We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

פרוטוקולים לכל במחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים בבית המשוכלל והנדיר de המרכז - Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. קציר עכבר קורנית עבור הכנת הרתי פרוסה השעיות תא בודדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף זרימה למינרית, להצמיד בצד הגחון העכבר עד קרש החיתוך. תרסיס העכבר עם אתנול 70%. הסר אלכוהול עודף בטופחו עם גזה כדי למנוע אתנול מלהיכנס חלל בית החזה פגיעה ברקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העור בבסיס של עצם החזה עם זוג מלקחיים ולעשות חתך דרך העור. הארך את החתך של העור כלפי מעלה לכל forelimb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן קיצוץ נוסף בבסיס עצם החזה להפריד את הסרעפת מן הצלעות. ואז לחתוך בכל צד של כלוב הצלעות כלפי עצם הבריח. תהפוך את כלוב הצלעות מעל לכיוון הראש לחשוף את חלל בית החזה. שתי האונות שלהתימוס לשכב על החלק העליון של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רקמת חיבור סביב האונות הרתי באמצעות מלקחיים, מספרי מייקרו לנתיחה, ו / או במספריים מעוגלים חדים. השתמש זוג מלקחי קצה מעוקל בסדר להרים את האונות בודדות מתחת או באמצעות נותרי רקמת חיבור. הערה: אין לתפוס את התימוס ישירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האונות הרתי צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל PBS ומניחים בצד על הקרח עד הצורך. </li></ol> 2. והטבעה Agarose ו Vibratome חיתוך של הרתי אונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% פתרון agarose להטבעת ידי המסת 2 גרם agarose נקודת התכה נמוכה ב 50 מ&quot;ל סטרילי PBS ו במיקרוגל בעוצמה נמוכה עד agarose נמס לגמרי. מכסים הבקבוק בנייר כסף ומניחים אלומיניום באמבט מים ב 55 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף בתרבית רקמה, להכין התקשורת RPMI להשלים-1640 המכיל 10% בסרום שור העובר (FBS), 4 מ&quot;מ גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין 1x, ו -10 מיקרומטר2-mercaptoethanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מ&quot;ל להשלים התקשורת RPMI-1640 לכל היטב צלחת תרבית תאים 6 באר ומקום הכנס תרבית תאים בכל טוב. הגדר את הצלחת בצד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן אמבט מי קרח עכור עם מים וקרח בתוך דלי קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את כל רקמות החיבור שנותרו סביב כל האונה הרתי באמצעות מלקחיים טיפ נאה. האם זה בעוד האונה הרתי היא שקועה PBS בצלחת בתרבית רקמה, לאחר העביר לתוך ממחטת נייר לנגב ספוגת PBS, או תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose להתקרר מתחת ל -40 מעלות צלזיוס, כאשר הבקבוק הוא רק חם למגע, כדי למנוע התחממות יתר הרקמה. יוצקים את 4% מקורר agarose לתוך תבנית רקמה עד לגובה של ס&quot;מ 1 ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים להעביר את האונה הרתי בקפידה כדי רקמה לנגב ולגלגל אותו בעדינות כדי לייבש אותו מבלי לפגוע ברקמה. ודא כי הרקמה מתייבש לגמרי או שזה יהיה להחליק החוצה של agarose במהלך חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס את האונה לתוך agarose ולמקם אותו או אופקית (כדי להגדיל את שטח הפנים של כל פרוסה) או אנכית (כדי להגדיל את מספר פרוסות) בתחתית התבנית. מניחים את התבנית במי קרח למשך 5-10 דקות, כדי לאפשר agarose כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את vibratome עבור חיתוך על ידי הרכבת מגש החיץ, להרכבת דיסק הדגימה, והחדרת להב vibratome. מניחים חתיכת סרט במעבדה על הדיסק הדגימה. לעקר את סביבת העבודה נקייה, התאספו עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose מבצרת, להפוך את התבנית ולחץ בעדינות במרכזה לשחרר את האונה מוטבע agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין חד לחתוך את agarose העודף סביב האונה עוזב ~ 2 מ&quot;מ של agarose בכל צד ו ~ 0.5 סנטימטר בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure כל בלוק agarose עם טיפת דבק רקמות חתיכת סרט על דיסק הדגימה. יכול להיות דבוק בלוקים מרובים בקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את wi להב vibratome<html> th העליון של הבלוק agarose. מלאו את מגש חיץ עם PBS סטרילי עד הבלוק הלהב agarose (ים) שקועים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף הרקמה מוטבע agarose להשיג פרוסות בעובי של 400-500 מיקרומטר. הגדר את vibratome כדי 0.225 מ&quot;מ / מהירות שניות, 100 הרץ תדיר, ו -5 ° זווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מרית והתכופפה לאסוף את הפרוסות הרתי לתוך צלחת בתרבית רקמה המכילה PBS סטרילית כפי שהם נחתכים. מחק את הפרוסה הראשונה והאחרונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הפרוסות תחת מיקרוסקופ אור בהגדלת 4X. בחר את הפרוסות עם רקמת הרתי שלמה סביב agarose (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הפרוסות לצלחת מוכנה בשלב 2.3 באמצעות קצה פיפטה כדי להחליק את פרוסת הרתי בעדינות מן המרית מכופף על כנס תרבית תאים. כל כנס יכול להכיל ~ 3 פרוסות. ודא פרוסות לא נוגעים זה בזה או הקירות להכניס תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עד הצורך. </li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. הכנת thymocytes עבור שכיסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד האונות הרתי כמתואר בסעיף 1. לנתק את האונות באופן ידני כדי לעשות השעיה תא בודד באמצעות מטחנת 15 מעוקר מ&quot;ל רקמות מלא 5 מ&quot;ל של PBS סטרילי המכיל 2% FBS. העברת התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant ו resuspend התאים 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה 1x ACK (0.15 M NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHCO 3, 0.1 מ&quot;מ Na 2 EDTA) בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות עד lyse בתאי הדם האדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את צינור עד 15 מ&quot;ל עם PBS המכיל 2% FBS. צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 10 מ&quot;ל של PBS המכיל 2% FBS ולהעביר התאים דרך מסנן רשת 255 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו resuspend התא גלולה ב PBS המכיל 2% FBS בכל concentration של 1 x 10 7 תאים לכל מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התווית התאים עם צבעים סלולריים כמו אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) על פי פרוטוקולים של יצרן אם לא באמצעות thymocytes מעכברים להביע סמני congenic או כתבי ניאון מקודד גנטי להבחין מתאי אנדוגני פרוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי של התאים שכותרתו, resuspend התא גלולה ב מדיה מלאה RPMI-1640 ב 1-3 x 10 6 תאים לכל 15 μl. </li></ol> 4. שכיסה thymocytes על פרוסות הרתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה כדי לשאוב כל נוזל המקיף את הפרוסות הרתי על ההוספה. הערה: תשמרי על עצמך כדי למנוע נזק agarose. אם agarose פגום, thymocytes המעולף לא לצרף אל פני השטח פרוסה כתוצאה מאובדן מתח פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי לגעת פרוסה עם קצה פיפטה, כיסוי 15 μl של thymocytes מוכן בסעיף 3 על כל פרוסה הרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת PLAטה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לאפשר לתאים לנדוד אל פרוסות הרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות, לשטוף את פרוסות הרתי 3 פעמים עם 1 מ&quot;ל PBS להסיר thymocytes מעולף עודף שעדיין לא עברו לתוך הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עד שהפרוסות הרתי מוכנות להיות שנקטף, בדרך כלל 1-72 שעות תלויות בניסוי. </li></ol> 5. דיסוציאציה של הרתי פרוסות cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינור microcentrifuge עבור כל פרוסה על ידי הוספת 150 μl של PBS המכיל 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 2% FBS כדי להכניס את בתרבית רקמה עם פרוסות הרתי ומערבבים בעדינות עם מרית כפוף לנתק את פרוסות מפני השטח של להכניס תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הפרוסה מן הכנס אל צינור microcentrifuge בעזרת מרית מכופפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לשבש את הפרוסה באמצעות עלי מדגם צינור microcentrifuge. להוסיף 150 μl של PBS המכיל 2% FBS לנפח סופי 300μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הרקמה ניתקה דרך פילטר 40 מיקרומטר לתוך צינור microcentrifuge חדש. התאים המסוננים מוכנים להיות מוכתם עבור ניתוח התזרים cytometric 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן תאים בשנית לפני העברת על cytometer זרימה כדי להבטיח כי כל agarose מוסר ואינו לסתום את זרימת cytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש את התאים על cytometer זרימה ולנתח נתונים כפי שתואר קודם לכן 40. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת פרוסות הרתי ותוצאות נציג מבחר חיובי ושלילי היעיל של הגבלה אני בכיתת MHC מראש מבחר המעולף thymocytes המהונדס TCR ידי cytometry זרימה. מערכת זו נוצל בעבר בהצלחה דומה לתמוך סלקציה חיובית של הכיתה MHC II-מוגבל CD4 + T תאים thymocytes העקורים מראש מבחר 32,</sup...

T תאים להבדיל באמצעות סדרה של ביניים התפתחותיים התימוס במהלכן הם נתקלים בכמה מחסומים המבטיחים בדור של רפרטואר תא T פונקציונלי, עמיד בפני עצמי 1-3. סלקציה חיובית מקדמת את ההישרדות של thymocytes עם קולטנים של תאי T (TCR) מסוגלים להכיר, עם נמוך הזיקה מתונה, פפטיד שהציגו מולקולות מורכבות histocompatibility גדולות (MHC) על תאי אפיתל הרתי קליפת מוח (cTEC) 2,3. סלקציה שלילית ו- T רגולטוריים התפתחות התא (T reg) לתרום להקמת סובלנות עצמית באמצעות חיסול או הסטת thymocytes שמגיבים בחריפות-פפטיד עצמי שהציג MHC 2,4. בשלה CD4 + CD8 + חיובית כפולה (DP) thymocytes להביע TCRs שעוברים תהליך הבחירה להתמיין תת-אוכלוסיות של תאי T בוגרים, שרובם הם מהשורה MHC-מוגבל ואני ציטוטוקסיות CD8 +או בכיתת MHC II-מוגבל CD4 + עזר יחיד חיובי (SP) ותאי T, לפני היציאה התימוס כדי לבצע פעולות מפעיל באיברים הלימפה משני 1-3. מה שמוסיף למורכבות של פיתוח תאי T, ההגירה הדינמית ומפגשים הסלולר לפתח thymocytes ברחבי רשת תא סטרומה 5-9. בתאי סטרומה אלה ממלאים תפקידים ברורים בפיתוח thymocyte ומופצים באופן דיפרנציאלי בין האזורים קורטיקליים מדולריים הרתי שבו חיובי סלקציה שלילית להתרחש 10. למרות סלקציה חיובית מתרחשת בעיקר בקליפת המוח, יש ראיות מצטבר thymocytes העקור נודד אל הלשד ולהמשיך לדרוש אותות TCR לפני שהם להתמיין לתאי T בוגרים דבר המצביעים על כך הלשד עשוי לספק אותות נוספים הדרושים להשלמת מבחר חיובי שושלת בידול 11,12. נוסף,למרות נוכחותם של תאי אפיתל הרתי מדולרי מיוחדים (Mtec) מבטאים ו אנטיגנים הנוכחי מוגבל רקמות הקלת מחיקה של thymocytes אוטוריאקטיבים 13,14, חלק גדול של סלקציה שלילית מתרחש בקליפה בתגובה הביע בכל מקום בגוף-פפטיד עצמי שהציג הדנדריטים תאים 15,16. לפיכך, מודלים מדויקים של פיתוח תאי T חייב לספק microenvironment הרתי מאורגן, עם קליפת המוח ללא פגע ואזורים מדולרי, המאפשר אינטראקציה בין thymocytes ותאי סטרומה, ותומך הגירה thymocyte כמו תאים אלה עוברים סלקציה חיובית ושלילית. כדי להשלים vivo לשעבר מנתח של thymocytes כאמצעי לימוד מבחר חיובי ושלילי, מספר במבחנה, באתרו, ו במודלי vivo של התפתחות תאי T פותח 17-22. זה כבר ידוע לשמצה קשה לשחזרבחירה במבחנה חיובית, אבל coculture של אוכלוסיות תא גזע או מבשרי תא T עם תאי סטרומה להביע ליגנד Notch, בעיקר OP9-DL1 / 4 תאים, יש לו את היכולת לתמוך במחויבות שושלת T ו סלקציה חיובית מוגבלת מה שהופך אותו לא יסולא בפז במודל חוץ גופייה כדי מחקר תאי T פיתוח 23-25. מגבלות של מערכת זו, עם זאת, כוללים את העובדה כי תאים אלה חסרים את מכונות עיבוד פפטיד ייחודי המצוי בתאי סטרומה הרתי ואת microenvironment הרתי תלת ממדי. למרות שלמעלה טכנית מסורבלת, באתרו במודלים vivo של מבחר הרתי יכול להתגבר על מחסומים הקשורים למערכות במבחנה. תרבויות איבר Reaggregate הרתי (RTOC) מכילים מוגדר תערובות של thymocytes ותאי סטרומה הרתי 18,26,27. reaggregates תא אפיתל הרתי אלה לשמור הביטוי שהייתי בכיתה MHC ו- II והוא יכול לתמוך developmeNT של שני תת התא הקונבנציונלי T, אך עדיין חסרת מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים. תרבות איבר הרתי עוברית (FTOC) היא מודל פופולרי של פיתוח תאי T שניתן זורע עם thymocytes באמצעות תרבות תליית טיפת אונות הרתי lymphodepleted או באמצעות זריקה של thymocytes לתוך lymphoreplete אונות הרתי ולתמוך בפיתוח יעיל של CD4 + ו- CD8 + T תאים לאורך זמן בתרבות 18,28-31. ב החניכה של התרבות של אונות הרתי העובר יש מחסור של mTECs, אך מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים עלולים לפתח לאורך זמן בהתאם לתנאים. שיקול חשוב הוא כי מודל זה עשוי לתמוך עוברי מועדף לעומת פיתוח תא הבוגר T. לבסוף, הזרקת intrathymic של מבשרי הרתי מוגדר בעכברים בוגרים הוא מאתגר מבחינה טכנית אך ברור מספקת סביבה לתמיכה פיתוח תאי T in vivo. אלו באתרו במודלים vivo הם לא כלים מצויניםo מחקר T תא הפיתוח והשימוש שלהם צריך להיחשב על בסיס ניסוי אחר ניסוי. פרוסות הרתי, לעומת זאת, צמחו לאחרונה כמודל צדדי, משלים ללמוד בחירה הרתי באתרו עם האפשרות להכיל ייחודי, מורכב, ובדרך כלל ניסויי תפוקה גבוהים יותר. פרוסות הרתי לשמור על השלמות של האזורים קורטיקליים מדולריים ולספק מסגרת של תאי סטרומה שתומכת גירת thymocyte במהלך פיתוח, כמו גם מבחר חיובי ושלילי יעיל 11,32-39. תת thymocyte הוסיף גבי פרוסות הרתי נודדים לתוך רקמות נישת microenvironmental המתאימה שלהם 34,37. Thymocytes המעולף ניתן להבחין בין תאי אנדוגני פרוסה הרתי באמצעות סמני congenic או תוויות ניאון והוא יכול להישמר בתרבות במשך כמה ימים. תרבויות organotypic פרוסה הרתי יכול לשמש כדי לחקור היבטים שוניםההתפתחות של תאי T כולל מבחר הרתי, התנהגות thymocyte (הגירה אינטראקציות הסלולר), ולוקליזציה thymocyte, בין היתר. בהינתן היכולת ליצור ~ 20 פרוסות הרתי לכל עכבר, את יכולת ההרחבה של ניסויים היא בדרך כלל גדולה יותר מאשר אחרים במודלים באתרו של מבחר הרתי. למרות הכנת פרוסות הרתי דורשת ציוד מיוחד, כגון vibratome, ואת זמן החיים של פרוסות הרתי בתרבות מוגבלת בשל אובדן של תאים לאורך זמן באמצעות מוות של תאים וחוסר קרום encapsulating, פרוסות הרתי לספק מודל מצוין לניתוח של מבחר הרתי של אוכלוסיות מסונכרנות של thymocytes בתוך microenvironment הרתי בוגר. כאן אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי (כולל קצירת התימוס, הטבעת agarose של אונות התימוס vibratome חתך של הרקמות המוטבעות), בידוד שכיסה של thymocytes, הניתוק של פרוסות הרתי עבור ניתוח התזרים cytometric.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50080</td><td>Low melting temperature agarose</td></tr><tr><td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td><td>Polyciences</td><td>18986</td><td>22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>Double Edge Prep Blades</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Adhesive</td><td>3M&amp;nbsp;</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>0.4 &amp;micro;m Cell Culture Inserts&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 with L-glutamine</td><td>Wisent</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Wisent</td><td>080-110</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>L-Glutamine, 200 mM</td><td>Wisent</td><td>609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td><td>Wheaton</td><td>357426</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh Filter</td><td>Component Supply</td><td>U-CMN-255</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td><td>Bel-Art</td><td>F19922-0000</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Nylon Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Inox Tip</td><td>Dumont&amp;nbsp;</td><td>RS-5047</td><td>Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm</td></tr><tr><td>Micro Forceps</td><td>Dumont&amp;nbsp;</td><td>RS-5090&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

התמורה מבחר הרתי בתוך microenvironment הרתי ייחודי מאוד מאורגנת וכתוצאה מכך הדור של רפרטואר תא T פונקציונלי, עמיד בפני עצמי. מודלים חוץ גופית ללמוד מחויבות השושלת T ופיתוח סיפקו תובנות חשובות לגבי התהליך הזה. עם זאת, מערכות אלו חסרים את המילייה הרתי תלת ממדים המלאות נחוצה להתפתחות תאי T, ולכן הם קירובים שלמים של in vivo מבחר הרתי. כמה מן האתגרים הקשורים לפיתוח תא דוגמנות T ניתן להתגבר באמצעות במודלים באתרו המספקים microenvironment הרתי שלם שתומך מבחר הרתי מלא לפתח תאי T. תרבויות organotypic פרוסת הרתי משלימים קיימים טכניקות באתרו. פרוסות הרתי לשמור על שלמות של אזורים קורטיקליים מדולרי הרתי ולספק פלטפורמה ללמוד פיתוח של thymocytes כיסו של שלב התפתחותי מוגדר או של ג T אנדוגניאמות בתוך microenvironment הרתי בוגר. בהינתן היכולת ליצור ~ 20 פרוסות לכל עכבר, פרוסות הרתי להציג יתרון ייחודי במונחים של מדרגיות לניסויי קצב העברת נתונים גבוהות. יתר על כן, הקלות היחסית ביצירת פרוסות הרתי ופוטנציאל כיסוי תת הרתי שונה או אוכלוסיות תאים אחרות מרקע גנטי מגוונים משפרת את הרבגוניות של שיטה זו. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת פרוסות הרתי, בידוד כיסוי של thymocytes, ניתוק של פרוסות הרתי עבור ניתוח תזרים cytometric. מערכת זו יכולה גם להיות מותאמת ללמוד פיתוח תאי T בלתי קונבנציונלי וכן לדמיין גירת thymocyte, אינטראקציות תא-סטרומה thymocyte, ואותות TCR הקשורים בחירה הרתי על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים.

ניתוח תמיכת פרוסות הרתי של היבטים שונים של פיתוח תא T כגון מבחר חיובי ושלילי. עבור ניסויים מוצלחים, איכות הפרוסה הרתי היא בעל חשיבות עליונה. לפיכך, פרוסות הרתי צריך להיבדק כדי להבטיח את שלמות הרקמה הרתי וכי agarose סביב פרוסה הרתי הוא תמים ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי, בשילוב עם cytometry זרימה, יכול לשמש מודל בחירה חיובית ושלילית לפתח תאי T. פרוסות הרתי ניתן להתאים גם לניתוח באתרו של הגירה thymocyte, לוקליזציה, ואיתות באמצעות immunofluorescence ושני פוטון מיקרוסקופית.

הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

preparation-and-applications-of-organotypic-thymic-slice-cultures

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Views.  Hôpital Maisonneuve-Rosemont.  אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי, בשילוב עם cytometry זרימה, יכול לשמש מודל בחירה חיובית ושלילית לפתח תאי T. פרוסות הרתי ניתן להתאים גם לניתוח באתרו של הגירה thymocyte, לוקליזציה, ואיתות באמצעות immunofluorescence ושני פוטון מיקרוסקופית. 

Video: Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Neuroscience

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Cancer Research

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Biology

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the multicellular interactions of native tissue. Tissue&#160;slices immediately cut from freshly resected tumors preserve spatial aspects of intratumor heterogeneity (ITH), thus making them useful surrogates of in vivo biology. Careful optimization of tissue slice preparation and cultivation conditions is fundamental for the predictive diagnostic potential of tumor slice explants. In this regard, murine models are valuable, as these provide a consistent flow of tumor material to perform replicate and reproducible experiments. This protocol describes the culturing of murine lung tumor-derived tissue slices using a rotating incubation unit, a system that enables intermittent exposure of tissues to oxygen and nutrients. Our previous work showed that the use of rotating incubation units improves the viability of tissue compared to other culture methods, particularly floating slices and stagnant filter supports. Here, we further show that slice thickness influences the viability of cultured slices, suggesting that optimization of slice thickness should be done for different tissue types. Pronounced ITH in relevant oncogenic functions, such as signaling activities, stromal cell infiltration or expression of differentiation markers, necessitates evaluation of adjacent tissue slices for the expression of markers altered by drug treatment or cultivation itself. In summary, this protocol describes the generation of murine lung tumor slices and their culture on a rotating incubation unit and demonstrates how slices should be systematically analyzed for the expression of heterogeneous tissue markers, as a prerequisite prior to drug response studies.

We provide a method for the generation, cultivation and systematic analysis of organotypic slices derived from murine lung tumors. We also describe how to optimize for slice thickness, and how to select drug concentrations to treat tumor slices.

הקמת וניתוח של הגידול פרוסה Explants כתנאי בדיקות אבחון

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...