מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית, במכונים הלאומיים לבריאות, NINDS. המחברים מבקשים להודות לכל אנשי המעבדה לרפואה המולקולרית ומדעי המוח, ריק דרייפוס עזר עם מיקרוסקופיה וניפוי ג פמלה לסיוע בעריכה.

הערה: לculturing השגרתי של אב עצבי ותאי שושלת oligodendrocytic, הדגירה מתבצעת על 37 מעלות צלזיוס ב5% 2 CO humidified אווירה. כל 2 ימים, הבינוני מוחלף בעזרת 50 עד 100% ממדיום טרי אם התרבות היא confluent 40-70%. בזמן confluency הקרוב, התרבויות הם passaged ב2-2.5e6/T75 בקבוק בדרך כלל על לוח זמנים שבועי. 1. הכנת הבקבוק המצופה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלוחיות מצופות לדלל 5 מ&quot;ג של פולי-D-ליזין (PDL) ב100 מיליליטר מי deionized (DI-מים), ואז מעייל T75 צלוחיות עם 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של PDL בטמפרטורת חדר (RT) בחושך. לאחר ½ 1 שעות, לשאוב PDL ולשטוף את צלוחיות פעם אחת עם DI-מים. תן לצלוחיות היבשות לפני זריעת התאים (טבלה 1). </li></ol> 2. החל התמיינות של תאי אב עצביים לתוך oligodendrocytes derived-מולידו (PDO) הפרוטוקול הואolate בתאים CNS אדם מתואר בפרסום קודם וזה לא חלק מ1 בפרוטוקול זה. תאי אב במערכת עצבים מרכזיים אדם בודדו מtelencephalon של מוח 8-שבוע הריון של עובר, המתקבל בהתאם להנחיות NIH. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגדל אוכלוסיית multipotential של תאי אב עצביים בצלוחיות מצופות בPDL בינוני neurobasal בתוספת 25 ng / ml של bFGF ו20 ng / מיליליטר גורם צמיחת אפידרמיס (EGF) (איור 1 א). אל תשתמש בם אם גבוה יותר מקטע 11 (P11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל כדי לבדל את תאי אב העצביים כאשר התרבות היא כ 70% confluent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך בינוני oligodendrocyte בידול מלא באמצעות מדיום סרום ללא DMEM / קותלי חזיר של F12 01:01 בתוספת סרום שור אלבומין, L-גלוטמין, גנטמיצין, רכיבי N2, T3, ששש, NT-3, bFGF, וPDGF-AA (טבלה 1) . מדיום זה יוגדר כבינוני Oligo עם גורמי גדילה (Oligo הבינוני + GF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר Progenתקשורת itor מהצלוחיות, לשטוף תאים פעם אחת עם פוספט נאגר מלוח (PBS), לאחר מכן להוסיף Oligo בינוני + GF (פרטים מתוארים ב2.3) כדי להתחיל בידול oligodendrocyte. רק תאים המחויבים לשושלת oligodendrocytic יגדלו (1B איור). תרבות התאים במדיום הזה במשך 3 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל שבוע, כאשר התאים נמצאים בנקודת מפגש 90-95%, מעברם באמצעות טריפסין (0.05%)-EDTA (0.1%) (4 מ&quot;ל לבקבוק T75). להעביר את כל בינונית מהתאים שpassaged לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל; בינוני מזגן זה ישמש כדי להרוות טריפסין. ודא שלא לייבש את התאים. ואז להוסיף טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים בטריפסין למשך 5 דקות בRT, הכה בעדינות על הבקבוק מספר פעמים כדי לעזור ניתוק תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את טריפסין על ידי הוספה של 4-5 מיליליטר מדיום מותנה לבקבוק עם תאים המשפחתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המדיום ואת התאים לאותו הצינור 50 מיליליטר חרוטים. צנטריפוגה הבינונית והתאים של 1,200 סל&quot;ד (~300 XG) למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, resuspend תא הגלול, בעדינות להטות את הצינור, ולאחר מכן להוסיף את המקור Oligo טרי + GF. עדינות פיפטה הבינונית ותאים למעלה ולמטה כדי להפוך את השעית תא אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים, ו2.5e6 העברה לכל T75 בקבוק חדש PDL מצופה. </li></ol> 3. שלב סופי בבידול של oligodendrocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 שבועות של התרבות בOligo בינוני + GF, כאשר התאים נמצאים בנקודת מפגש 70-80%, להתחיל את התהליך הסופי של התמיינות (התרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני באותה הדרך כמו Oligo הבינוני + GF אך מבלי להוסיף 4 GF: ששישה, NT-3, bFGF וPDGF-AA. המדיום הזה ללא 4 GF יוגדר כבינוני Oligo - GF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום Oligo + GF מהבקבוק, ולשטוף פעם עם PBS ולאחר מכן להוסיף בנפח כולל של 16 מ&quot;ל של מדיום, ש¾ (12 מ&quot;ל) הוא Oligo בינוני - GF ו¼ (4 מ&quot;ל) הוא מדיום מותנה PDN, עבור 6-10 ימים). השימוש במדיום מותנה מPDN אינו חיוני לתהליך ההתמיינות או להישרדות של התאים. אנחנו למעשה ציינו כי קשר היחיד ישיר של PDO עם תאי PDN בניסויי שיתוף התרבות הייתה השפעה על משך הישרדות PDO. זמן ההישרדות בOligo בינוני - GF עשוי להתמשך, לשבועות או שלושה, אם תאי PDO הם שיתוף תרבית עם תאים-PDN. הפרוטוקול להבדיל ובתאים עצביים אדם לPDN מתואר בפרסום קודם וזה לא חלק מ1 בפרוטוקול זה. נסיגה גורם גדילה מהתוצאות הבינוניות התרבות בתרבות מובחנת בהדרגת תאים עם תהליכים מרובים (1D איור). </li></ol> 4. Assay הזרימה cytometry בדיקת זרימת cytometry משווה את הרכישה של סמני oligodendrocyte במהלך תהליך ההתמיינות במערכת יחסים עם אלו של אוכלוסיית הוריהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פרו עצביgenitors כשליטה. תאי זרע PDO ב2.5x10 6 תאים בשתי T75 צלוחיות מצופות ב- D-ליזין פולי בOligo הבינוני + GF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבוע לאחר מכן, החלף בינוני עם בינוני Oligo טרי + GF בצלוחיות כתרבות שליטה לכדאיויות תא, בעוד צלוחיות אחרות היו Oligo בינוני - GF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק את תאי PDO בשני אמצעי התקשורת להשתמש 20 U / מ&quot;ל ​​של פפאין וטריפסין לא. הסיבה לכך היא פפאין יש השפעה עדינה על התאים במהלך דיסוציאציה שימור המורפולוגיה התאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של תמיסת המלח המאוזנת של ארל (EBSS) לבקבוקון פפאין. הנח את הבקבוקון על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או עד שהוא נמס לגמרי פפאין והפתרון נראה ברור. זהו פתרון פפאין נהג לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של EBSS לDeoxyribonuclease בקבוקוני (DNase) (טבלה 1). מערבב בעדינות. הוסף 0.25 מ&quot;ל של פתרון זה לבקבוקון של פפאין המומס. התכשיר מכיל ריכוז סופי של כ 20 U / ml פפאין ו0.005% DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון המקום פפאין (כמתואר לעיל) על תאים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15-30 דקות; לפקח על הניתוק של התאים באמצעות מיקרוסקופ. עצור את התגובה עם 5 מ&quot;ל של מדיום עם או בלי GF וצנטריפוגה בסל&quot;ד 1200 עבור 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כדורים סלולריים משתי הצלוחיות לשני צינורות פוליפרופילן 5 מ&quot;ל שונים ורחץ אותם במדיום הפיזיולוגי הנורמלי (NPM: 145 המ&quot;מ NaCl, 5 המ&quot;מ KCl, 1.8 mM CaCl 2, 10 מ&quot;מ וHepes הגלוקוז mM 10) בתוספת 1 ​​מ&quot;ג / מ&quot;ל שור אלבומין (NPM + BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע משטח immunostaining ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באמצעות נוגדנים ספציפיים עיקריים וכראוי לטיטרציה A2B5, O4, GalC (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם NPM + BSA ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ודגירתם עם נוגדנים ספציפיים משניים ב4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים אנטיגנים תוך תאיים כולל nestin, גליה fibrillary חומץ חלבון (GFAP), מעמד שלישי ויהיהת&quot;א;-טובולין, וחלבון המיאלין בסיסי (MBP) (טבלה 2), לתקן את התאים בparaformaldehyde 2% (PFA) במשך 20 דקות בRT וpermeabilize עם אתנול 70% קר במשך 15 דקות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם 1x PBS ו דגירה עם נוגדנים ספציפיים משניים (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבחין בין תאים שלמים ופסולת subcellular במהלך ניתוח cytometry זרימה, תאים עם כתם 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihydrochloride (DAPI) (חיים טכנולוגיים, גרנד איילנד, ניו יורק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופטימיזציה של הפרוטוקול לעיל, בצעו את כל ניסויי הבקרה המתאימות על מנת לאשר את הספציפיות של כל immunoreagent. בקצרה, לנוגדנים שכותרתו ישירות, השליטה השלילית המתאימה הייתה נוגדן ישירות מצומדת של אותה כיתת אימונוגלובולינים אלוטיפ (או תת) והצמוד fluorochrome כנוגדן ראשוני (כלומר, שליטת אלוטיפ). לimmunostaining העקיף של נוגדנים עיקריים, השליטה השלילית w המתאיםכנוגדן מצומד לfluorochrome עניין שממוקד ברמת אימונוגלובולינים (או תת) של המארח שבו הנוגדן הראשוני נוצר דווקא משני. כאשר נוגדנים עיקריים ממארחים מרובים (עכבר, ארנבת, עוף) היו בשימוש יחד, השתמש בנוגדן המשני מיקוד הנוגדן הראשוני של כל מארח וכל נוגדן משני השתמש היה לחצות adsorbed-בדרך כלל נגד נוגדנים מהצבאות האחרים כדי למזער צולב תארח immunoreactivity. הפקדים החיוביים כללו immunostaining ישיר או עקיף של הכנות סלולריות הידועות לבטא את האנטיגנים של עניין או באמצעות immunoreactions ישיר או עקיף עם נוגדנים הספציפיים לאנטיגנים אלה העיקריים. שיטות אופטימיזציה הנ&quot;ל בוצעו פעם אחת עבור כל סוג של immunostaining ניסויים. immunoreactions הבקרה עולה כי אין immunoreactivity הצולב epitope משמעותי בין נוגדנים ראשוניים ומשניים. cytometry הזרימה בוצע באופן אחידתאים מושעים כותרתו fluorescently באמצעות FACVantage SE תא סדרן (BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה) מצויד בשלושת לייזרים, המספקים אורכי גל עירור מכוון ל488 ננומטר, 647 ננומטר, וUV רחב (351-364 ננומטר) (איור 2) . </li></ol> 5. Assay immunofluorescence הערה: לניסויי immunofluorescence, PDO מצופים בOligo הבינוני + GF או Oligo בינוני - GF ב2.5e5 ב 6 גם צלחות מצופות PDL. התאים הם קבועים ב2% PFA בנקודתי זמן שונים לאחר נסיגה של גורמי גדילה. נוגדן כתם מבוצע על 6 גם צלחות פלסטיק במקום זכוכית coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה ולהוסיף 2% PFA. דגירה במשך 10 דקות ב RT. השלך PFA. שטוף תאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם. יש להיזהר שלא לייבש את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize תאים לסמנים תאיים באמצעות 0.25% פתרון טריטון ב PBS עבור 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע, תאים לחסום מחייבים שאינם ספציפיים ואו 10 דקות עם HHG (1 חיץ mM HEPES, סרום סוס 2%, וסרום עיזים 10% בתמיסת המלח המאוזנת &quot;הנקס). דלל נוגדנים ספציפיים עיקריים (טבלה 2) לריכוז שנקבע מראש בHHG. הנח נוגדנים מדוללים על גבי תאים. דגירת 1 שעות בRT בייקר או ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים 3 פעמים עם PBS, למשך 5 דקות בכל פעם. דלל נוגדנים משניים מתאימים (טבלה 2) בשילוב עם fluorochrome לריכוז שנקבע מראש בHHG. הנח את התערובת של נוגדנים משניים מדוללים על גבי תאים. דגירת 1 שעות בRT על שייקר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים 3 פעמים עם PBS, למשך 5 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מphotobleaching להוסיף 10 μl של להאריך זהב עם DAPI לתאים ומקום coverslip זכוכית על ראשם. דמיינו תאים שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Axiovert 200 מ&#39;(Zeiss, Thornwood, ניו יורק) (איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+pathway+of+human+brain+progenitor+cells+identified+by+JC+virus+susceptibility.">Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility.</a> Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11, 951-966 (1993).</li><li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system.">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li><li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+central+nervous+system.">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276, 66-71 (1997).</li><li>Belachew, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+NG2+proteoglycan-expressing+progenitor+cells+are+intrinsically+multipotent+and+generate+functional+neurons.">Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons.</a> J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).</li><li>Almazan, G., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oligodendrocyte+precursor+cell+line+from+rat+optic+nerve.">An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve.</a> Brain Res. 579, 234-245 (1992).</li><li>Filipovic, R., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+minocycline+in+co-cultures+of+human+fetal+neurons+and+microglia.">Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia.</a> Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).</li><li>Goldman, S. A., Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+niche-defying+feat:+induced+oligoneogenesis+in+the+adult+dentate+gyrus.">A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus.</a> Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).</li><li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nat. Med. 9, 439-447 (2003).</li><li>Lyssiotis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+induces+developmental+plasticity+in+oligodendrocyte+precursor+cells.">Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).</li><li>Sim, F. J., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+matter+progenitor+cells+reside+in+an+oligodendrogenic+niche.">White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche.</a> Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-396 (1983).</li><li>Windrem, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cells+derived+from+the+adult+human+subcortical+white+matter+disperse+and+differentiate+as+oligodendrocytes+within+demyelinated+lesions+of+the+rat+brain.">Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain.</a> J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li><li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells.">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+oligodendrocytes+from+embryonic+stem+cells:+conserved+SHH+signaling+networks+and+divergent+FGF+effects.">Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects.</a> Development. 136, 1443-1452 (2009).</li><li>Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroblasts+distinguished+from+O-2A+glial+progenitors+by+surface+phenotype+(O4+GalC-)+and+response+to+cytokines+using+signal+transducer+LIFR+beta.">Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta.</a> Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+oligodendrocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li><li>Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oligodendrocyte+and+its+many+cellular+processes.">The oligodendrocyte and its many cellular processes.</a> Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).</li><li>Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+human+oligodendroglial+development+in+vitro.">Tracing human oligodendroglial development in vitro.</a> J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).</li><li>Bradl, M., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes:+biology+and+pathology.">Oligodendrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).</li><li>Chong, S. Y., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tapping+into+the+glial+reservoir:+cells+committed+to+remaining+uncommitted.">Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted.</a> J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).</li><li>Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+development+and+the+onset+of+myelination+in+the+human+fetal+brain.">Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain.</a> Front Neuroanat. 3, 5 (2009).</li><li>Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serum-free+derivation+of+oligodendrocyte+precursors+from+neural+stem+cell-enriched+cultures.">Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures.</a> Stem Cells. 27, 116-125 (2009).</li><li>D'Intino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triiodothyronine+administration+ameliorates+the+demyelination/remyelination+ratio+in+a+non-human+primate+model+of+multiple+sclerosis+by+correcting+tissue+hypothyroidism.">Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism.</a> J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).</li><li>Cui, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+different+gestational+stages+exhibit+substantially+different+potential+to+myelinate.">Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate.</a> Stem Cells Dev. , (2012).</li><li>Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+nestin+in+neural+and+glial+cells+in+the+developing+human+CNS+defined+by+a+human-specific+anti-nestin+antibody.">Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody.</a> Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פרוטוקול זה מתאר כיצד להפיק oligodendrocytes העוברי מתאי אב עצביים עיקריים אדם ולאפיין פנוטיפ שלהם הוא באמצעות cytometry זרימה ומכתימה immunofluorescence. הגידול וההתרחבות של אבות עצביים ממערכת עצבים מרכזיים בעובר תוארה 1-4 טובים מאוד. עם זאת, קבלת oligodendrocytes אדם מספיק לניסויים במבחנה עדיין קשה, למרות שזה אפשרי לזהות ולבודד מבשרי גליה מחומר לבן אדם בוגר 5-13. היו ניסיונות שונים בהתפתחות של תנאי תרבות שונות לבידול ישיר של אבות עצביים עובריים לייצור מיאלין oligodendrocytes 14-21. פרוטוקול זה ממשיך ומתאר תאי nestin חיוביים עצביים אב המבטאים את סמן O4 (איור 2) כאשר גדל במשך 3 שבועות במדיום סרום ללא תוספת עם גורמים נבחרים צמיחה (PDGF-AA, bFGF, שש, וNT-3), tכובע הוא חיוני לשגשוג וההישרדות של מבשרי oligodendrocyte 22-24. להסרה של גורמי גדילה אלו בO4 תאים + הביאה בידול וביטוי נוסף לרכיבי המיאלין (galactocerebroside וMB). בנוסף, הביטוי של סמני בידול oligodendrocyte עולה בקנה אחד עם שינויים מורפולוגיים מתאים שהופיעו בהתחלה צרה ודו קוטבי (האיור 1B) לתאים שהופכים לmultipolar עם תהליכים מפותחים (התרשים 1C). ההסרה של גורמי גדילה נוספת כדי לאפשר לשלבים הסופיים של בידול התבססה על מחקרים שנעשו בעכבר והן 15,25 אנושיים. הנוכחות של triiodothyronine (T3) היא חשובה להישרדות והבידול של oligodendrocytes 26 בזמן שאנחנו הבחנו כי ההסרה מארבעת גורמי הגדילה הייתה צורך הביטוי של סמנים סופיים של בידול. זה בהשוואה לתאים המשיכו בOligo הבינוני + GFsa שליטה. אנחנו לא הראשונים שתארנו את ההתמיינות של תאי אב לתאים עצביים multipotent oligodendrocyte בתגובה לאותות כגון שש וbFGF 24. הדיווחים קודמים הראו כי קליפת מוח oligodendrogenesis מתחיל בסביבות גיל הריון 10 שבועות בבני אדם 24 עם הקיבולת של oligodendrocytes העוברי האנושי לmyelinate להגדיל באופן יחסי לגיל הריון 22. בידול של galactocerebroside + + וO4 תאים מבשרים oligodendrocyte מתאי אב עצביים כבר דיווח על שימוש במוח עוברי שליש שני 21,27. עם זאת, התאים האלה אינם מתרבים בהיעדר תאי תמיכה כולל האסטרוציטים ונוירונים, והולכים לאיבוד במהירות לאורך הזמן בתרבות 21. המערכת שלנו תומכת בהקמתה של GalC + וMBP + תאים מתרבות העוברית של אדם מגיל 8 שבועות הריון. כמו כן תארנו כי differeoligodendrocytes ntiated יכול להיות מתורבת במבחנה ללא צורך של תמיכה בתאים כהאסטרוציטים או נוירונים, למרות שיתוף הטיפוח עם הנוירונים יכול להאריך את ההישרדות של oligodendrocytes המובחן. עוד אחד יתרונות של פרוטוקול זה הוא האפשרות לטפח מספר גדול של תאים המבטאים את הסמן + O4 שניתן לגדל וpassaged בתרבות במשך שבועות, תוך שמירה על הפנוטיפ שלהם. באותו הרגע O4 התאים + האלה יכולים להיות דחף נוסף בשלב האחרון של התמיינות כאשר גורמי הגדילה יוסרו מבינוני. הפרוטוקול המפורט במאמר זה מתייחס לצורך בשושלות מתאימות לניסויים במבחנת oligodendrocyte. יתר על כן, אנו מאמינים שזיהוי גורמים ספציפיים אשר יגרמו למפל הבידול של אבות עצביים לכיוון oligodendrocyte מולידו נגזר הוא חשוב להבנת מנגנונים התאיים ומולקולריים של התפתחותיתמעברים. היא עשויה גם לשמש ככלי חשוב ללימוד הפרעות demyelinating ואינטראקציות סלולריות וירוס מארח מתייחסות לפתוגנזה של וירוסי neurotropic אנושיים כמו JCV.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> DME / קותלי חזיר של F12 01:01 </td><td> אומגת מדען </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> שור אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> גנטמיצין </td><td> איכות ביולוגית </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> איכות ביולוגית </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> T3 </td><td> סיגמא </td><td> T2877 </td><td> 3 ננומטר </td></tr><tr><td> רכיבי N2 </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> ששישה </td><td> מערכת מו&quot;פ </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> סיגמא </td><td> P6407 </td><td> 50 ק&quot;ג / מ &#39; </td></tr><tr><td> PFA </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> איכות ביולוגית </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> פפאין </td><td> וורטינגטון </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> בקבוקוני DNase </td><td> וורטינגטון </td><td> LK003172 </td><td> 0.005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> וורטינגטון </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> להאריך זהב עםDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. ריאגנטים. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> עיקריים שרירי בטן (כולם במיקרוגרם 1 / מ&quot;ל) </td><td></td><td> אלוטיפ מינים </td><td> מקור </td><td> Abs המשני </td></tr><tr><td colspan="5"> זרימת cytometry </td></tr><tr><td> A2B5-ביוטין </td><td> עכבר </td><td> IgM </td><td> מתנת ג&#39;נילסון </td><td> Streptavidin פטר, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> עכבר </td><td> IgM </td><td> מתנה מג&#39; נילסון </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> עכבר </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> עכבר </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> עכבר </td><td> 3 IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, הדרום יוטק, אל על </td></tr><tr><td> MBP </td><td> עוף </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, ג&#39;קסון Immu., הרשות הפלסטינית </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> עכבר </td><td> 1 IgG </td><td> Messam et al. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> ארנב </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, ג&#39;קסון Immu, הרשות הפלסטינית </td></tr><tr><td> טובולין βIII </td><td> עכבר </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, קליפורניה </td><td> gαm IgG 2-הפטר, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Immunocytochemistry </td></tr><tr><td> טובולין βIII (1:1,500) </td><td> עכבר </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, קליפורניה </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> ארנב </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, ג&#39;קסון Immu, הרשות הפלסטינית (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> עוף </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, ג&#39;קסון Immu, הרשות הפלסטינית (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> עכבר </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> ארנב </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . טבלה 2 נוגדנים (ABS) המשמשים לזרימה cytometry ומבחני immunocytochemistry conjugates נוגדנים: PE, phycoerythrin; פטר, phycoerythrin טקסס אדומה; AMCA,-methyl-coumarin-יצטט אמין; סי, cyanine; FITC, isothiocyanate fluorescein IG:. אימונוגלובולינים. . AF: Alexa פלואוריד; gαm: עיזים אנטי עכבר; gαrb: עיזים נגד ארנב; dαck: חמור אנטי עוף. </td></tr></tbody></table>

progenitor-derived oligodendrocyte culture system from human fetal brain

בידול של אבות עצביים אדם לסוגי תאים עצביים וגליה מציע מודל ללמוד והשווה תקנה מולקולרית של התפתחות משפחה של תאים עצבית. בהרחבה במבחנה של אבות עצביים מרקמת מערכת עצבים המרכזיים של עובר כבר מאופיין היטב. למרות זיהוי והבידוד של אבות גליה מחומר אנושי בוגרים תת קורטיקלי לבן ופיתוח של תנאי תרבות שונות לבידול ישיר של אבות העובריים עצביים לתוך oligodendrocytes ייצור המיאלין, רכישת oligodendrocytes אדם מספיק לניסויים במבחנה נותר קשה. בידול של galactocerebroside + (GalC) וO4 + מבשר oligodendrocyte או תאי אב (OPC) מתאים מבשרים עצביים כבר דיווח על שימוש במוח עוברי שליש שני. עם זאת, התאים האלה אינם מתרבים בהיעדר תאי תמיכה כולל האסטרוציטים ונוירונים, והולכים לאיבוד במהירות לאורך הזמן בתרבות. הצורך נותר למערכת כדי לייצר תרבות תאים של השושלת המתאימה לניסויים במבחנת oligodendrocyte. תרבות של oligodendrocytes האנושי הראשוני יכולה, למשל, להיות מודל שימושי ללמוד פתוגנזה של חומרים מזהמים כמו neurotropic polyomavirus האנושי, JCV, שin vivo מדביק תאים אלה. תאים בתרבית אלה גם יכולים לספק מודלים של מחל demyelinating אחרות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). ראשוני, עוברי של אדם שמופק ממוח, ותאים עצביים multipotential להתרבות במבחנה, תוך שמירה על היכולת להתמיין לתאי עצב (נוירונים מוליד-derived, PDN) והאסטרוציטים (האסטרוציטים מוליד-derived, מחשבי כף יד) מחקר זה מראה כי אבות עצביים יכולים להיגרם להבדיל דרך כל שלבי התפתחות השושלת oligodendrocytic (oligodendrocytes מוליד-derived, PDO). אנחנו בתאים עצביים התרבות בתקשורת DMEM-F12 סרום נטול supplemented עם גורם טסיות נגזר גידול (PDGF-AA) גורם בסיסי גדילה (bFGF), סוניק קיפוד (שש), גורם neurotrophic 3 (NT-3), N-2 וtriiodothyronine (T3). את התאים בתרבית הם passaged בתאים 2.5e6 לצלוחיות 75cm בערך כל שבעה ימים. שימוש בתנאים אלה, רוב התאים בתרבית לשמור מורפולוגיה המאופיינת במספר תהליכים וסמנים מפורשים של תאים טרום oligodendrocyte, כגון A2B5 ו-O-4. כאשר אנו מסירים את גורמי הגדילה 4 (GF) (bFGF, PDGF-AA, ששש, NT-3) ולהוסיף תקשורת ממוזגת מPDN, התאים להתחיל לרכוש יותר תהליכים וסמנים ספציפיים מפורשים של בידול oligodendrocyte, כגון GalC ומיאלין חלבון בסיסי (MBP). בצענו אפיון הפנוטיפי באמצעות cytometry זרימה הססגונית לזהות סמנים ייחודיים של oligodendrocyte.

חשוב מאוד להתחיל את תהליך הבידול מתרבות 70% -80% confluent העצבית מוליד תא (איור 1 א). תאים רבים יגוועו לאחר שינוי התרבות הבינונית ממוליד עד בינוני Oligo שכן הוא כולל גורמי גדילה ספציפיות. זה מצביע על כך שהצמיחה של תאי אב עצביים אינה מחויבים לפנוטיפ oligodendrocytic לא להיות נתמכת על ידי המדיום החדש (1B איור). הדגירה בOligo בינוני + GF במשך שבוע אחד הביאה תרבות ביניים מציגה, מורפולוגיה דו קוטבית צרה (האיור 1B). התאים נשמרים בOligo בינוני + GF ל3-4 שבועות (התרשים 1C). נסיגה גורמת גדילה מהתרבות הבינונית הביאה תרבות מובחנת בהדרגה של תאים עם תהליכים מרובים (1D איור). cytometry הזרימה משמש לייצוג כמותי של הנתונים. איורים 2 א, 2B ו-2C להוכיח כי רוב האבות עצביים מתבטאים בתאי גזע הסמן nestin neuroepithelial, ואילו רק אוכלוסיות קטנות הביעו סמני שושלת-מגבילים כגון סמן GFAP astrocyte (איור 2 א), סמן הכיתה השלישית העצבי β-טובולין (איור 2 ב &#39;) , או על סמן oligodendrocyte O4 (האיור 2C). כאשר מדיום התרבות הוחלף בOligo הבינוני + GF ותאים בתרבית ל1 שבוע, ירד ביטוי nestin וגדל A2B5 ביטוי ניתן לראות (האיור 2D). A2B5 הוא סמן מקדים neuroglial. לשם השוואה, 2 שבועות לאחר החלפה בינונית, ביטוי nestin ירד עוד יותר וA2B5 ביטוי לבד גדל (2E איור), כמו גם הביטוי של סמן נוסף oligodendrocyte, O4 (האיור 2F). ימי גמילת גורם גדילת הודעה, O4 ביטוי כמו גם הגדיל את הביטוי של GalC,סמן oligodendrocyte מאוחר (האיור 2G). נסיגת שישה ימי הודעה לגורם גדילה, שיתוף והביטוי של O4 GalC מוגברת (איור 2H) והוא דומה לשיתוף הביטוי לGalC וMBP (האיור ט 2). Immunostaining רב epitope מגלה כי יותר ממחצית מהתאים בתרבית מביעה MBP (איור י 2). עדות נוספת לבידול PDO התאפיינה, באמצעות assay immunofluorescence, מהגידול הזמני של ביטוי MBP בתאים אלה לאחר נסיגת גורם גדילה (איור 3A-C). לסיכום, תאי אב עוברי עצביים אדם מסוגלים להתרבות במבחנה, תוך שמירה על היכולת להתמיין לסוגי תאי מוח 3 גדולים (איור 4). <img src="/files/ftp_upload/4274/4274fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. שלב ניגוד מיקרוסקופיה of (A) בתאי אב עצביים בתרבית במדיום מוליד; (B) ותאים עצביים הגדלים בOligo בינוני + GF במשך שבוע התערוכה, מורפולוגיה דו קוטבית צרה שינתה; (C) oligodendrocytes בדיל מוליד נגזרות גדל במשך 3 ימים בOligo הבינוני לאחר מורפולוגיה גורם גדילת נסיגת תערוכת oligodendrocyte מאופיין במספר רב של תהליכים. 20x הגדלה. <img src="/files/ftp_upload/4274/4274fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2 ניתוח cytometry זרימה של תאי אב עצביים משותף המבטא את מבשר תאי הסמן Nestin (כל הצירים האנכיים) עם:. () GFAP הסמן astrocytic; (ב) טובולין III β הסמן העצבי, וכן (ג) oligodendrocytic סמן O4; (ד &#39;) ותאים עצביים גדלו במשך שבוע בOligo תקשורת + GF שיתוף המפורש nestin וA2B5; (E) nestin וA2B5 שיתוף ביטוי לאחר שבועות של צמיחת אבות עצביות בOligo בינוני + GF (F) A2B5 וO4 שיתוף ביטוי לאחר שבועות של צמיחת אבות עצביות בOligo הבינוני + GF; (G) 2 ימים לאחר נסיגת גורם גדילה, סמנים שונים oligodendrocyte של בידול, O4 וGalC, באים לידי ביטוי. שישה ימים לאחר נסיגת גורם גדילה (H) שיעור מוגבר של תאים הם כפולים חיוביים לO4 וGalC; (אני) כפולים חיוביים לGalC וMPB; ו( J) כפול חיובי לO4 וMBP. AJ הוא נציג של ארבעה ניסויים עצמאיים. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4274/4274fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/4274/4274fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. Immunofluor העקיףמכתים escence של oligodendrocytes מוליד-derived לMBP () 2 ימים, (ב) 5 ימים, ו( C, D) 9 ימים לאחר נסיגת גורם גדילה. (ד) מייצג את תמונת השלב של תרבות 9 ימים בOligo הבינוני - GF ו( E) היא גדלה של הקופסה הלבנה של אותה תמונה (A, B) 20x גדלה; (C, D) הגדלת 32x.. <img src="/files/ftp_upload/4274/4274fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. ייצוג סכמטי של מודל תרבית התאים שלנו. ראשוני, אנושי עוברי מופק ממוח, ותאים עצביים multipotential להתרבות במבחנה תוך שמירה על גמישותם. שימוש תנאי תרבות שונים, ותאים עצביים יכולים להתמיין לתאי עצב (PDN), האסטרוציטים (PDA) וoligodendrocyte (PDO), כפי שמוצג על ידי ספציפי differentiatסמני יון.

Watch this Scientific Journal Video about Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain at JoVE.com

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

ראשוני, תאים אנושיים עובריים מופקים ממוח, multipotential progenitor להתרבות<em&gt; במבחנה</em&gt; תוך שמירה על היכולת להתמיין לתאי עצב והאסטרוציטים. עבודה זו מראה כי אבות עצביים יכולים להיגרם להבחין דרך שלבים שונים של שושלת oligodendrocytic ידי מיזוג עם גורמי גדילה נבחרים.

מערכת מוליד-נגזר Oligodendrocyte תרבות ממוח העוברי של אדם

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Google

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K Views.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health. ראשוני, תאים אנושיים עובריים מופקים ממוח, multipotential progenitor להתרבות במבחנה תוך שמירה על היכולת להתמיין לתאי עצב והאסטרוציטים. עבודה זו מראה כי אבות עצביים יכולים להיגרם להבחין דרך שלבים שונים של שושלת oligodendrocytic ידי מיזוג עם גורמי גדילה נבחרים.

Video: Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...