この研究は、米国立衛生研究所（NIH）、NINDSにおける学内研究プログラムによってサポートされていました。著者は、編集を手伝って顕微鏡とパメラCのふるいで助けるために分子医学と神経科学、リック·ドレイファスの研​​究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。

注：神経前駆細胞とoligodendrocytic系統細胞の培養ルーチンについては、インキュベーションを37℃で加湿した5％CO 2雰囲気で行った。 2日毎に、培地は、培養40〜70％コンフルエントであれば、新鮮な培地の50〜100％を使用して置き換えられます。近くコンフルエントの時点では、培養は通常、毎週のスケジュール上で2-2.5e6/T75フラスコで継代されています。 1。コー​​ティングされたフラスコを準備<ol><li>コー​​トフラスコを準備するには、暗所で室温でPDLの50μg/ mlの（RT）でコートT75フラスコをその後、100mlの脱イオン水（脱イオン水）にポリ-D-リジン5mgの（PDL）を希釈してください。 1つの½時間後、PD​​Lを吸引し、DI水で一度フラスコをすすいでください。セル（ 表1）播種前に、乾いたフラスコましょう。 </li></ol> 2。前駆細胞由来のオリゴデンドロサイトへの神経前駆細胞の分化の開始（PDO） のプロトコルです以前の刊行物に記載されている人間の中枢神経系前駆細胞をオレート、それがこのプロトコル1の一部ではありません。人間の中枢神経系前駆細胞はNIHガイドラインに従って得られた8週間の妊娠胎児の脳の終脳から単離された。 <ol><li> 25 ng / mlのbFGFの、20 ng / mlの上皮増殖因子（EGF）（ 図1A）を補ったNeurobasal培地におけるPDL ​​コートフラスコ上の神経前駆細胞の多能集団を栽培しています。通路11（P11）よりも高い場合は、それらを使用しないでください。 </li><li>文化は約70％コンフルエントのとき神経前駆細胞を区別するために開始します。 </li><li>ウシ血清アルブミン、L-グルタミン、ゲンタマイシン、N2のコンポーネントは、T3に、Shh、NT-3は、bFGF、およびPDGF-AAを（ 表1）を補充した無血清DMEM / HAMS F12を1:1の培地を使用して完全な分化オリゴデンドロサイト培地を作る。この培地は、増殖因子（オリゴ培地+ GF）とオリゴ媒体として定義されます。 </li><li> PROGENを削除フラスコからデンサメディアは、で一度細胞をリンスリン酸緩衝食塩水（PBS）は、その後オリゴmediumを追加+ GFオリゴデンドロサイト分化を開始する（2.3で説明されるように詳細）。 oligodendrocytic系統にコミットした細胞のみが（ 図1B）成長していきます。 3週間この培地で細胞を培養。 </li><li>毎週、細胞が90〜95％のコンフルエンス、通路、それらをトリプシン（0.05％）-EDTA（0.1％）（T75フラスコのための4ミリリットル）を使用してであるとき。 50 mlコニカルチューブに継代される細胞から、媒体全体を転送し、この馴化培地はトリプシンをクエンチするために使用されます。細胞を乾燥しないようにしてください。その後トリプシンを追加します。 </li><li>優しく細胞の剥離を助けるためにフラスコを数回タップする、室温で5分間トリプシンで細胞をインキュベートします。 </li><li>デタッチされた細胞を用いたフラスコに馴化培地の4-5 mlを加えてトリプシンをいやす。 </li><li>培地と同じ50 mlコニカルチューブに細胞を移します。 1,200 rpmで（〜に培地と細胞を遠心室温で5分間、300×g）で。 </li><li>上清を吸引し、穏やかにチューブを転倒し、細胞ペレットを再懸濁し、その後新鮮なオリゴ培地+ GFを追加します。優しく均一な細胞懸濁液を作るには、上下の培地および細胞をピペット。 </li><li>セルをカウントし、各新しいPDLでコーティングされたT75フラスコに2.5e6を転送します。 </li></ol> 3。オリゴデンドロサイトの分化における最終ステップ<ol><li>オリゴ培地+ GF、細胞が70〜80％コンフルエントにある文化の3週間後、分化の最終工程（ 図1C）を起動します 。 </li><li> Shhは、NT-3、bFGFおよびPDGF-AA：オリゴ培地+ GFとしてではなく、4 GFを追加することなく、同じようにメディアを準備します。 GF - 4 GFなしでこの媒体はオリゴ媒体として定義されます。 </li><li>フラスコからオリゴ培地+ GFを吸引除去し、PBSで一回すすぎ、その後培地16ミリリットルの全容量を追加して、オリゴ媒体である¾（12ミリリットル）の - GFと¼（4ml）をPDN馴化培地である、のために6-10日）。 PDNからの馴化培地の使用は、分化過程に、または、細胞の生存に重要ではない。我々は実際には共培養実験のPDN細胞とPDOの唯一の直接接触はPDO生存の長さに影響を与えたことを観察した。オリゴ培地で生存期間 - PDOの細胞は、PDN細胞と共培養している場合はGFは2または3週間に延長することができます。 PDNにヒト神経前駆細胞を区別するためのプロトコルは、以前の刊行物に記載されており、このプロトコル1の一部ではありません。複数のプロセス（ 図1D）を持つ細胞の徐々に分化した培養における培地の結果から成長因子撤退。 </li></ol> 4。フローサイトメトリーアッセイフローサイトメトリーアッセイは、彼らの親の人口のものとの関係では、分化過程の間にオリゴデンドロサイトマーカーの取得を比較します。 <ol><li>神経Proを使用コントロールとしてgenitors。オリゴ培地+ GFのポリ-D-リジンで被覆した2 T75フラスコ中に2.5×10 6個の細胞でシードPDOの細胞。 </li><li> GF - 他のフラスコは、オリゴ媒体を持っていた一週間後、細胞の生存のための対照培養フラスコのように新鮮なオリゴ培地+ GFで培地を交換してください。 </li><li>両方のメディアにPDO細胞を解離させるためには20 U / mlのパパインおよびトリプシンを使用していない。パパインは、細胞の形態を維持解離中の細胞上の穏やかな効果を持っているためです。 </li><li>パパインバイアルにアールの平衡塩類溶液（EBSS）5mlを加える。 10分間またはパパインが完全に溶解し、溶液が透明に表示されるまで37℃でバイアルを置きます。これは、細胞を解離させるために使用されるパパインソリューションです。 </li><li>リボヌクレアーゼI（DNase処理）バイアル（ 表1）にEBSSの0.5 mlを加える。静かに混和します。溶解パパインのバイアルにこの溶液0.25mlを加える。この製剤は、約20 U / mlのパパインと0の最終濃度が含まれています0.005パーセントのDNase。 </li><li> 15〜30分間37℃でインキュベートした細胞の上に置いパパイン溶液（上記のように）;顕微鏡を用いて細胞の剥離を監視します。 7分間1200 rpmでGFと遠心の有無にかかわらず培地5mlで反応を停止します。 </li><li>二つの異なる5 mlのポリプロピレンチューブに両方のフラスコから細胞ペレットを転送し、通常の生理的媒体（NPM：145 mMのNaCl、5mMのKCl、1.8 mMのCaCl 2、10mMのHEPESおよび10mMグルコース）でそれらを洗って1 mg / mlのを補足したウシ血清アルブミン（NPM + BSA）。 </li><li>表面は4で免疫染色実行°GalC（ 表2）、A2B5、O4のために具体的かつ適切に滴定した一次抗体を用いて20分間インキュベートする。 </li><li> 5分間、4℃で、NPM + BSAで細胞を洗浄し、20分（ 表2）4℃で特異的な二次抗体を用いて、それらをインキュベートする。 </li><li>ネスチン、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、クラスIIIとなるなど、細胞内抗原を染色するTA;-チューブリン、およびミエリン塩基性タンパク質（MBP）（ 表2）は 、室温で20分間、2％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定し、-20℃で15分間冷70％エタノールで透過処理</li><li> 1×PBSで細胞を洗浄し、特定の二次抗体（ 表2）でインキュベートする。 </li><li>フローサイトメトリー分析の際に無傷の細胞および細胞内残骸を区別するために、4,6 - ジアミジノ-2 - phenyllindole、二塩酸塩（DAPI）（ライフ·テクノロジーズ、Grand Island、NY）を用いて細胞を染色します。 </li><li>上記のプロトコルを最適化する際に、我々はそれぞれの免疫試薬の特異性を確認するためにすべての適切な制御実験を行った。簡単に言えば、直接標識抗体について、適切な陰性対照は、一次抗体（ すなわち 、アイソタイプコントロール）と同じ免疫グロブリンアイソタイプクラス（またはサブクラス）と蛍光色素複合体の直接抱合抗体であった。一次抗体の間接免疫染色、適切なネガティブコントロールwの具体的に一次抗体が生成されたホストの免疫グロブリンクラス（またはそのサブクラス）を標的とし、目的の蛍光色素に共役二次抗体として。複数のホストから一次抗体（マウス、ウサギ、ニワトリ）が、我々は、各ホストの一次抗体を標的とする二次抗体を使用した、一緒に使用され、使用されるそれぞれの二次抗体は、一般的に最小化するために、他のホストからの免疫グロブリンに対するクロス吸着させたときにクロス宿主の免疫反応。ポジティブコントロールは、これらの抗原に特異的な一次抗体との直接的または間接的な免疫反応のいずれかを使用して、目的の抗原を発現することが知られている細胞調製物の直接的または間接的な免疫染色​​が含まれていた。上記の最適化の方法は、実験を免疫染色の種類ごとに一回行った。コントロール免疫反応は、一次抗体および二次抗体の間に有意クロスエピトープ免疫反応性がないことを明らかにした。フローサイトメトリーを用いて、均一について行ったFACVantage SEセルソーター（BD Biosciences社、サンノゼ、CA）を使用して、一時停止され、蛍光標識された細胞は、488nm、647 nm、および広範な紫外線（351から364 nm）を（ 図2）に同調励起波長を提供する3つのレーザーを装備。 </li></ol> 5。免疫蛍光検査法 注： - PDLでコーティングされた6ウェルプレートで2.5e5でGFの免疫蛍光実験では、PDOはオリゴ培地+ GFまたはオリゴ培地にプレーティングする。細胞は、成長因子の撤退後の様々な時点で2％PFAで固定されています。抗体染色は、プラスチック製6ウェルプレートの代わりにガラスカバースリップ上で実行されます。 <ol><li>メディアを取り出し、2％PFAを追加します。室温で10分間インキュベートする。 PFAを捨てる。 PBSで各5分間の時間で細胞を3回洗浄する。細胞を乾燥しないように注意してください。 </li><li>室温で10分間、PBS中の0.25％トリトン溶液を用いて、細胞内マーカーのために、細胞を透過。 </li><li>非特異的結合をブロック細胞を防止するために、FまたはHHG（1 mMのHEPES緩衝液、2％ウマ血清、ハンクス平衡塩溶液中で10％ヤギ血清）で10分。 HHGで予め決められた濃度になるように具体的な一次抗体を（ 表2）で希釈します。細胞に希釈した抗体を置きます。シェーカー上または4℃で一晩、室温で1時間インキュベートします。 </li><li> 5分毎に時間のために、PBSで細胞を3回洗浄します。 HHGで予め決められた濃度に蛍光色素と結合し、適切な二次抗体を（ 表2）で希釈します。細胞に希釈した二次抗体の混合物を置きます。暗闇の中でシェーカー上で室温で1時間インキュベートします。 </li><li> 5分毎に時間のために、PBSで細胞を3回洗浄します。 </li><li>退色を避けるために細胞にDAPIで金を延長し、それらの上にカバーガラスを配置し、10μlを添加する。 AXIOVERT 200M蛍光顕微鏡（ツァイス、ソーンウッド、ニューヨーク州）（ 図3）を用いて標識した細胞を可視化します。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルは、初代ヒト神経前駆細胞から胎児オリゴデンドロサイトを導出し、フローサイトメトリーと免疫蛍光染色の両方を使用して、その表現型を特徴付ける方法について説明します。胎児の中枢神経系から神経前駆細胞の拡大と成長は非常によく、1から4に記載されている。しかし、in vitro の実験で 、人間のために十分なオリゴデンドロサイト...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> DME / HAMS F12の1時01分</td><td>オメガ·サイエンティスト</td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td>ウシアルブミン</td><td>シグマ</td><td> A9418 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>質バイオ</td><td> 120-098-031 </td><td> 50μg/ mlの</td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td>質バイオ</td><td> 118-084-061 </td><td> 2mMの</td></tr><tr><td> T3 </td><td>シグマ</td><td> T2877 </td><td> 3nMの</td></tr><tr><td> N2のコンポーネント</td><td> Gibco BRL社</td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td>ぺプロテック株式会社</td><td> 450から03 </td><td> 2 ng / mlの</td></tr><tr><td>しゃべるな</td><td> R＆Dのシステム</td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / mlの</td></tr><tr><td> bFGFの</td><td>ぺプロテック株式会社</td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / mlの</td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td>ぺプロテック株式会社</td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> PDL </td><td>シグマ</td><td> P6407 </td><td> 50μgの/ mの</td></tr><tr><td> PFA </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15712 </td><td>二パーセント</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>質バイオ</td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td>パパイン</td><td>ワージントン</td><td> LK003178 </td><td> 20 U / mlの</td></tr><tr><td> DNaseをバイアル</td><td>ワージントン</td><td> LK003172 </td><td> 0.005パーセント</td></tr><tr><td> EBSS </td><td>ワージントン</td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td>ゴールドを長引かせる ととも​​にDAPI </td><td>インビトロジェン</td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1試薬。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> プライマリABS（全1μg/ mlの時） </td><td></td><td> 種のアイソタイプ </td><td> ソース </td><td> 二次腹筋 </td></tr><tr><td colspan="5"> フローサイトメトリー </td></tr><tr><td> A2B5-ビオチン</td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ギフトJ.ニールソン</td><td>ストレプトアビジンPETR、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> O4FITC </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td> J.ニールソンからの贈り物</td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-FITC、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> O4 </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-FITC、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> GalC </td><td>マウス</td><td> IgGの3 </td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmIgGの3-PE、サザンバイオテック、アラバマ</td></tr><tr><td> MBP </td><td>チキン</td><td> IgYの</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> dαckIgYの-AMCA、ジャクソンIMMU。、ペンシルバニア</td></tr><tr><td>ネスチン</td><td>マウス</td><td> IgG 1の </td><td> Messam ら 2000 28 </td><td> gαmのIgG 1-PECy5、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> GFAP </td><td>ウサギ</td><td> IgG抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαrbたIgG-PEジャクソンIMMU、ペンシルバニア</td></tr><tr><td> βIIIチューブリン</td><td>マウス</td><td> IgGの2 </td><td> Covance、カリフォルニア州</td><td> gαmIgGの2のa-PETR、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td colspan="6"> 免疫細胞化学 </td></tr><tr><td> βIIIチューブリン （1:1,500） </td><td>マウス</td><td>のIgG 2A </td><td> Covance、カリフォルニア州</td><td> gαmのIgG 2A-FITC、Invitrogen社、カリフォルニア州 （1:1,000） </td></tr><tr><td> GFAP （1:1,000） </td><td>ウサギ</td><td> IgG抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαrbのIgG-FITC、ジャクソンIMMU、ペンシルバニア （1:500） </td></tr><tr><td> MBP （1:50） </td><td>チキン</td><td> IgYの</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> dαckIgYの-FITC、ジャクソンIMMU、ペンシルバニア （1:100） </td></tr><tr><td> O4 （1:100） </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-AF546、Invitrogen社、カリフォルニア州 （1：100） </td></tr><tr><td> GalC （1:10） </td><td>ウサギ</td><td> IgG抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-AF750、Invitrogen社、カリフォルニア州 （1:100） </td></tr></tbody></table> 。フローサイトメトリーおよび免疫アッセイのために使用される表2抗体（腹筋） のconjugate抗体：PE、フィコエリトリン、PETR、フィコエリトリンテキサスレッド、AMCA、アミノメチルクマリン-アセテート; Cyは、シアニン、FITC、フルオレセインイソチオシアネートのIg：免疫グロブリン。 。AF：のAlexa Fluor;gαm：ヤギ抗マウス;gαrb：ヤギ抗ウサギ;dαck：ロバ抗ニワトリ。 </td></tr></tbody></table>

progenitor-derived oligodendrocyte culture system from human fetal brain

神経細胞とグリア細胞型へのヒト神経前駆細胞の分化は、神経細胞系譜開発の分子調節を研究し、比較するためのモデルを提供しています胎児の中枢神経系組織からの神経前駆細胞の in vitro での展開では 、十分に特徴付けされています。種々の培養条件の成人ヒト皮質下白質と開発からオリゴデンドロサイトを産生するミエリンに胎児の神経前駆細胞の分化に直接グリア前駆細胞の同定および単離にもかかわらず、in vitroの実験で 、人間のために十分なオリゴデンドロサイトを獲得することは依然として困難である。ガラクトセレブロシドの分化+（GalC）及びO4 +神経前駆細胞からのオリゴデンドロサイト前駆体または前駆細胞（OPC）の妊娠中期胎児の脳を使用して報告されている。しかしながら、これらの細胞はアストロサイトとニューロンを含む支持細胞の非存在下で増殖しないし、文化の中で時間をかけて迅速に失われる。必要性は 、in vitro の実験で適したオリゴデンドロサイト系譜の細胞を産生する培養システムのために残してあります。 初代ヒトオリゴデンドロサイトの培養は、例えば、 生体内でそれらの細胞に感染し、ヒトポリオーマウイルス、JCVのような神経親和性感染因子の病因を研究するための有用なモデルである可能性があります。これらの培養細胞は、中枢神経系（CNS）の他の脱髄疾患のモデルを提供することができます。神経細胞（前駆細胞由来のニューロンは、PDN）とアストロサイトに分化する能力を維持しながら、プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性神経前駆細胞をin vitro で増殖（前駆細胞由来アストロサイト、PDA）、本研究では、神経前駆細胞を誘導できることを示していますoligodendrocytic系統の発展段階（前駆由来オリゴデンドロサイトは、PDO）の多くを介して区別することができます。 DMEM-F12無血清培地中で私たちの文化の神経前駆細胞はsup塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、血小板由来増殖因子（PDGF-AA）、ソニックヘッジホッグ（Shh）、神経栄養因子（NT-3）、N-2とトリヨードサイロニン（T3）とで可能です。培養細胞は、およそ7日ごとに75センチメートルフラスコあたり2.5e6細胞で継代されています。これらの条件を用いて、培養中の細胞の大多数は少数のプロセスとそのようなA2B5およびO-4などの事前オリゴデンドロサイト細胞の急行マーカーによって特徴形態を維持。我々は4つの成長因子（GF）（bFGFは、PDGF-AA、Shhを、NT-3）を削除し、PDNからの馴化培地を追加すると、細胞は、GalCおよびミエリンなどのオリゴデンドロサイト分化の特定の複数のプロセスおよびエクスプレスマーカーを取得するために開始塩基性タンパク質（MBP）。我々は、オリゴデンドロサイトのユニークなマーカーを同定するために多色フローサイトメトリーを用いて表現型の特性評価を行った。

それは70％-80％コンフルエント神経前駆細胞培養（ 図1A）から分化プロセスを開始することが非常に重要です。多くの細胞は、それが特定の成長因子が含まれているため、前駆細胞からオリゴ培地に培地を変更した後に消えてしまうでしょう。これはoligodendrocytic表現型にコミットされていない神経前駆細胞の増殖は新しい媒体（ 図1B）によってサポートされないこと...

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Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性前駆細胞は増殖<em&gt; in vitroで</em&gt;ニューロンおよびアストロサイトに分化する能力を維持しています。この作品は、神経前駆細胞がselect増殖因子とコンディショニングによってoligodendrocytic系統の段階を経て分化誘導することができることを示しています。

ヒト胎児脳から由来オリゴデンドロサイト前駆細胞培養システム

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K ビュー.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health. プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性前駆細胞は増殖 in vitroでニューロンおよびアストロサイトに分化する能力を維持しています。この作品は、神経前駆細胞がselect増殖因子とコンディショニングによってoligodendrocytic系統の段階を経て分化誘導することができることを示しています。