Diese Arbeit wurde von der Intramural Research Program des National Institutes of Health, NINDS unterstützt. Die Autoren möchten sich bei allen Mitgliedern des Labors für Molekulare Medizin und Neurowissenschaften, Rick Dreyfuss für die Hilfe bei Mikroskopie und Pamela C. Sieben für die Hilfe bei der Bearbeitung danken.

Anmerkung: Für routinemäßige Kultivieren der neuralen Vorläuferzellen und oligodendrocytic Abstammungslinie Zellen, Inkubation bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre durchgeführt. Alle 2 Tage, wird das Medium ausgetauscht Verwendung von 50 bis 100% des frischen Mediums ist, wenn die Kultur 40 bis 70% konfluent. Zum Zeitpunkt der Nähe der Konfluenz werden die Kulturen bei 2-2.5e6/T75 Kolben normalerweise auf einem Wochenprogramm passagiert. Ein. Herstellung des beschichteten Flask <ol><li> Zur Vorbereitung beschichteten Kolben zu verdünnen 5 mg Poly-D-Lysin (PDL) in 100 ml deionisiertem Wasser (DI-Wasser), dann Mantel T75-Flaschen mit 50 ug / ml PDL bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln. Nach 1 ½ Std. absaugen PDL und spülen Sie die Flaschen einmal mit DI-Wasser. Lassen Sie die Flaschen trocken vor der Aussaat der Zellen (Tabelle 1). </li></ol> 2. Ab Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in Progenitor-derived Oligodendrozyten (PDO) Das Protokoll istOlate menschlichen ZNS Vorläuferzellen in einer früheren Publikation beschrieben, und es ist nicht Bestandteil dieses Protokolls 1. Menschlichen ZNS Vorläuferzellen wurden aus dem Telencephalon eines 8-Schwangerschaftswoche fötalem Gehirn, in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien erhalten wurde, isoliert. <ol><li> Wachsen multipotenten Population von neuralen Vorläuferzellen auf PDL beschichteten Flaschen in Neurobasalmedium mit 25 ng / ml bFGF und 20 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) (Abbildung 1A) ergänzt. Verwenden Sie sie nicht, wenn höher als Durchgang 11 (p11). </li><li> Start, um die neuronalen Vorläuferzellen zu unterscheiden, wenn die Kultur von etwa 70% konfluent. </li><li> Make vollständige Differenzierung Oligodendrozyten Medium mit serumfreien DMEM / Hams F12-Medium mit 1.01 Rinderserumalbumin, L-Glutamin, Gentamicin, N2 Komponenten, T3, Shh, NT-3, bFGF und PDGF-AA (Tabelle 1) ergänzt . Dieses Medium wird als Oligo-Medium mit Wachstumsfaktoren (Oligo mittel + GF) definiert werden. </li><li> Entfernen progenitor Medien aus den Flaschen spülen Zellen einmal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), dann fügen Oligo mittel + GF (Details unter 2.3 beschrieben) zu Oligodendrozyten Differenzierung beginnen. Nur Zellen, die sich für die oligodendrocytic Linie wachsen wird (Abbildung 1B). Kultur der Zellen in diesem Medium für 3 Wochen. </li><li> Jede Woche, wenn die Zellen bei 90-95% Konfluenz mit Trypsin ihnen Durchgang (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml für eine T75-Flasche). Übertragen das Medium von den Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen passagiert werden, dies konditionierte Medium wird verwendet, um das Trypsin zu quenchen werden. Achten Sie darauf, nicht zu trocknen die Zellen. Dann fügen Trypsin. </li><li> Inkubieren Zellen in Trypsin für 5 min bei RT, leichtes Antippen der Kolben mehrmals Zellablösung helfen. </li><li> Quench das Trypsin durch Zugabe von 4-5 ml des konditionierten Mediums in den Kolben mit den abgelösten Zellen. </li><li> Übertragen des Mediums und die Zellen auf den gleichen 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge das Medium und die Zellen bei 1.200 rpm (~300 xg) für 5 min bei RT. </li><li> Überstand, Zellpellet vorsichtig Kippen der Röhre, und fügen Sie dann frische Oligo mittel + GF. Gently Pipette und Zellen nach oben und unten, um eine einheitliche Zellsuspension. </li><li> Zählen Sie die Zellen, und die Übertragung 2.5e6 in jede neue PDL-beschichteten T75-Flasche. </li></ol> 3. Letzter Schritt in der Differenzierung von Oligodendrozyten <ol><li> Nach 3 Wochen der Kultur in Oligo-Medium + GF, wenn die Zellen bei 70-80% Konfluenz sind, starten Sie den abschließenden Prozess der Differenzierung (Abbildung 1C). </li><li> Planen Medium in der gleichen Weise wie die Oligo-Medium + GF, aber ohne Zugabe der vier GF: Shh, NT-3, bFGF und PDGF-AA. GF - Dieses Medium ohne die vier GF wird als Oligo Medium definiert werden. </li><li> Saugen Sie die Oligo-Medium + GF aus der Flasche, einmal mit PBS spülen und fügen Sie dann ein Gesamtvolumen von 16 ml des Mediums, von denen ¾ (12 ml) Oligo Medium - GF und ¼ (4 ml) ist PDN konditioniertes Medium für 6-10 Tage). Die Verwendung von konditioniertem Medium aus PDN ist nicht kritisch für die Differenzierung oder das Überleben der Zellen. Wir tatsächlich beobachtet, dass nur direkten Kontakt mit PDO PDN Zellen in Co-Kultur-Experimente eine Wirkung auf die Länge der PDO Überleben hatte. Die Überlebenszeit in Oligo Medium - GF könnten auf zwei oder drei Wochen verlängert werden, wenn die Zellen mit PDO PDN Zellen co-kultiviert. Das Protokoll für die menschliche neurale Vorläuferzellen in PDN zu differenzieren ist in einer früheren Publikation beschrieben, und es ist nicht Bestandteil dieses Protokolls 1. Wachstumsfaktorentzug aus dem Kulturmedium führt fortschreitend differenziert Kultur von Zellen mit mehreren Prozessen (1D). </li></ol> 4. Durchflusszytometrie Assay Die Durchflusszytometrie-Assay vergleicht den Erwerb von Oligodendrozyten Marker während der Differenzierung in der Beziehung mit denen ihrer Eltern Bevölkerung. <ol><li> Verwenden neuronalen progenitors als Kontrolle. Saatgut PDO Zellen bei 2.5x10 6 Zellen in zwei T75-Flaschen, beschichtet mit Poly-D-Lysin in Oligo-Medium + GF. </li><li> Eine Woche später, ersetzen Medium mit frischem Oligo mittel + GF in Flaschen als Kontrolle Kultur für die Lebensfähigkeit der Zellen, während andere Flaschen hatten Oligo mittel - GF. </li><li> Um PDO-Zellen in beiden Medien distanzieren verwenden 20 U / ml Papain und nicht Trypsin. Dies liegt daran, Papain eine sanftere Wirkung auf die Zellen während der Dissoziation die Erhaltung der zellulären Morphologie. </li><li> 5 ml Balanced Salt Earle-Lösung (EBSS) zu einem Papain Fläschchen. Die Küvette bei 37 ° C für 10 min oder bis das Papain vollständig gelöst und die Lösung klar erscheint. Dies ist der Papain-Lösung verwendet, um die Zellen zu dissoziieren. </li><li> 0,5 ml EBSS einem Deoxyribonuclease I (DNase) Fläschchen (Tabelle 1). Vorsichtig mischen. 0,25 ml dieser Lösung in der Durchstechflasche gelöst Papain. Diese Zubereitung enthält eine Endkonzentration von etwa 20 E / ml und 0 Papain0,005% DNase. </li><li> Ort Papain-Lösung (wie oben beschrieben) auf die Zellen und Inkubation bei 37 ° C für 15-30 min; überwachen die Ablösung der Zellen mit einem Mikroskop. Stoppen der Reaktion mit 5 ml Medium mit oder ohne GF und Zentrifuge bei 1.200 rpm für 7 min. </li><li> Übertragen Zellpellets aus beiden Kolben in zwei unterschiedlichen 5 ml Polypropylen-Röhrchen und waschen Sie sie mit normalen physiologischen Medium (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 10 mM Hepes und 10 mM Glucose) mit 1 mg / ml ergänzt Rinderserumalbumin (NPM + BSA). </li><li> Führen Oberfläche Immunfärbung bei 4 ° C für 20 min unter Verwendung von spezifischen und entsprechend titriert Primärantikörper für A2B5, O4, GalC (Tabelle 2). </li><li> Waschen der Zellen mit NPM + BSA bei 4 ° C für 5 min und Inkubation mit spezifischen Sekundärantikörper bei 4 ° C für 20 min (Tabelle 2). </li><li> Um intrazelluläre Antigene einschließlich Nestin, saure Gliafaserprotein (GFAP), Klasse III &amp; sein färbenta;-Tubulin und basischem Myelinprotein (MBP) (Tabelle 2), zu fixieren die Zellen in 2% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei RT und permeabilisieren mit kaltem 70% igem Ethanol 15 min bei -20 ° C. </li><li> Waschen der Zellen mit 1x PBS und Inkubation mit spezifischen Sekundärantikörper (Tabelle 2). </li><li> Um zwischen intakten Zellen und subzellulären Schmutz während der Durchflusszytometrie diskriminieren, Fleck Zellen mit 4,6-Diamino-2-phenyllindole, Dihydrochlorid (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> Bei der Optimierung des obigen Protokoll, führten wir alle geeigneten Kontrollversuchen um die Spezifität jedes Immunreagenz bestätigen. Kurz gesagt, für direkt markierten Antikörpern, die geeignete Negativkontrolle ein direkt konjugierten Antikörper des gleichen Isotyps Immunglobulin-Klasse (oder Unterklasse) und Fluorochrom-Konjugat als primärer Antikörper (dh die Isotyp-Kontrolle). Für indirekte Immunfärbung primärer Antikörper, die entsprechende negative Kontrolle wals sekundärer Antikörper, konjugiert an dem Fluorochrom von Interesse, dass speziell die Immunglobulin-Klasse (oder Unterklasse) von dem Wirt, in dem der primäre Antikörper erzeugt wurde angestrebt. Wenn primäre Antikörper von mehreren Hosts (Maus, Kaninchen, Huhn) zusammen verwendet wurden, nutzten wir die sekundären Antikörper gegen den primären Antikörper jeden Host und jeden sekundären Antikörper verwendet wurde typischerweise gegen die Immunglobuline aus den anderen Hosts-adsorbiert überqueren, um cross-Minimierung Gastgeber Immunreaktivität. Die positiven Kontrollen einbezogen direkten oder indirekten Immunfärbung von Zellpräparaten bekannt, die Antigene von Interesse exprimieren entweder mit direkten oder indirekten Immunreaktionen mit den primären Antikörpern, die spezifisch für diese Antigene. Die obigen Optimierungsmethoden wurden einmal für jeden Typ von Immunfärbung Experimente durchgeführt. Steuerung Immunreaktionen zeigten keine signifikante Cross-Epitop Immunreaktivität unter primären und sekundären Antikörpern. Durchflusszytometrie wurde auf einheitlich durchgeführtsuspendiert fluoreszenzmarkierte Zellen unter Verwendung eines FACVantage SE Zellsortierer (BD Biosciences, San Jose, CA) mit drei Laser, welche Anregungslicht Wellenlängen abgestimmt zu 488 nm, 647 nm bereitzustellen ausgestattet, und eine breite UV (351-364 nm) (Abbildung 2) . </li></ol> 5. Immunofluoreszenzassay Hinweis: Für Immunfluoreszenz Experimenten PDO sind in Oligo-Medium + GF oder Oligo ausplattiert - GF bei 2.5e5 in 6-Well-Platten mit PDL beschichtet. Die Zellen werden in 2% PFA zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Entzug von Wachstumsfaktoren fixiert. Der Antikörper Fleck ist auf Kunststoff-6-Well-Platten anstelle von Deckgläsern durchgeführt. <ol><li> Entfernen Sie das Medium und fügen Sie die 2% PFA. Inkubieren für 10 min bei RT. Entsorgen PFA. Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, jeweils 5 min. Seien Sie vorsichtig, nicht zu trocknen die Zellen. </li><li> Permeabilisieren Zellen für intrazelluläre Marker mit 0,25% Triton-Lösung in PBS für 10 min bei RT. </li><li> Um unspezifische Bindung, Block Zellen verhindern foder 10 min mit HHG (1 mM HEPES-Puffer, 2% Pferdeserum und 10% Ziegenserum in balanced salt Hanks-Lösung). Verdünnte spezifischen primären Antikörper (Tabelle 2) zu einer vorbestimmten Konzentration in HHG. Zeigen verdünnte Antikörper auf Zellen. Inkubieren 1 h bei RT auf dem Schüttler oder bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, für jeweils 5 min. Verdünnte geeigneten sekundären Antikörpern (Tabelle 2) mit einem Fluorochrom zu einer vorbestimmten Konzentration in HHG gekoppelt. Legen Sie die Mischung von verdünntem Sekundärantikörper auf Zellen. Inkubieren 1 h bei RT auf einem Schüttler im Dunkeln. </li><li> Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, für jeweils 5 min. </li><li> Um zu vermeiden, Ausbleichen hinzufügen 10 ul verlängern Gold mit DAPI zu den Zellen und setzen Sie ein Deckglas auf sie. Visualisieren Sie markierten Zellen mit einem Axiovert 200M Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) (Abbildung 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+pathway+of+human+brain+progenitor+cells+identified+by+JC+virus+susceptibility.">Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility.</a> Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11, 951-966 (1993).</li><li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system.">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li><li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+central+nervous+system.">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276, 66-71 (1997).</li><li>Belachew, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+NG2+proteoglycan-expressing+progenitor+cells+are+intrinsically+multipotent+and+generate+functional+neurons.">Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons.</a> J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).</li><li>Almazan, G., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oligodendrocyte+precursor+cell+line+from+rat+optic+nerve.">An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve.</a> Brain Res. 579, 234-245 (1992).</li><li>Filipovic, R., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+minocycline+in+co-cultures+of+human+fetal+neurons+and+microglia.">Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia.</a> Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).</li><li>Goldman, S. A., Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+niche-defying+feat:+induced+oligoneogenesis+in+the+adult+dentate+gyrus.">A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus.</a> Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).</li><li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nat. Med. 9, 439-447 (2003).</li><li>Lyssiotis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+induces+developmental+plasticity+in+oligodendrocyte+precursor+cells.">Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).</li><li>Sim, F. J., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+matter+progenitor+cells+reside+in+an+oligodendrogenic+niche.">White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche.</a> Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-396 (1983).</li><li>Windrem, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cells+derived+from+the+adult+human+subcortical+white+matter+disperse+and+differentiate+as+oligodendrocytes+within+demyelinated+lesions+of+the+rat+brain.">Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain.</a> J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li><li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells.">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+oligodendrocytes+from+embryonic+stem+cells:+conserved+SHH+signaling+networks+and+divergent+FGF+effects.">Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects.</a> Development. 136, 1443-1452 (2009).</li><li>Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroblasts+distinguished+from+O-2A+glial+progenitors+by+surface+phenotype+(O4+GalC-)+and+response+to+cytokines+using+signal+transducer+LIFR+beta.">Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta.</a> Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+oligodendrocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li><li>Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oligodendrocyte+and+its+many+cellular+processes.">The oligodendrocyte and its many cellular processes.</a> Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).</li><li>Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+human+oligodendroglial+development+in+vitro.">Tracing human oligodendroglial development in vitro.</a> J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).</li><li>Bradl, M., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes:+biology+and+pathology.">Oligodendrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).</li><li>Chong, S. Y., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tapping+into+the+glial+reservoir:+cells+committed+to+remaining+uncommitted.">Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted.</a> J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).</li><li>Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+development+and+the+onset+of+myelination+in+the+human+fetal+brain.">Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain.</a> Front Neuroanat. 3, 5 (2009).</li><li>Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serum-free+derivation+of+oligodendrocyte+precursors+from+neural+stem+cell-enriched+cultures.">Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures.</a> Stem Cells. 27, 116-125 (2009).</li><li>D'Intino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triiodothyronine+administration+ameliorates+the+demyelination/remyelination+ratio+in+a+non-human+primate+model+of+multiple+sclerosis+by+correcting+tissue+hypothyroidism.">Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism.</a> J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).</li><li>Cui, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+different+gestational+stages+exhibit+substantially+different+potential+to+myelinate.">Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate.</a> Stem Cells Dev. , (2012).</li><li>Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+nestin+in+neural+and+glial+cells+in+the+developing+human+CNS+defined+by+a+human-specific+anti-nestin+antibody.">Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody.</a> Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Ableitung fetaler Oligodendrozyten aus primären humanen neuralen Vorläuferzellen und zu charakterisieren ihren Phänotyp sowohl mit Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz. Der Ausbau und das Wachstum von neuralen Vorläuferzellen aus fetalem ZNS wurde sehr gut 1-4 beschrieben. Allerdings erhalten ausreichende personelle Oligodendrozyten in vitro Experimente bleibt schwierig, obwohl es möglich ist, zu identifizieren und zu isolieren, glialen Vorläuferzellen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> DME / Hams F12 01.01 </td><td> Omega Scientist </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Rinderalbumin </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Qualität Biologicals </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Qualität Biologicals </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 nM </td></tr><tr><td> N2-Komponenten </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Shh </td><td> R &amp; D System </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 ug / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Qualität Biologicals </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papain </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> DNase Vials </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0,005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold- mitDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Reagenzien. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Primäre Abs (alle auf 1 pg / ml) </td><td></td><td> Species Isotyp </td><td> Quelle </td><td> Sekundäre Abs </td></tr><tr><td colspan="5"> Durchflusszytometrie </td></tr><tr><td> A2B5-Biotin </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Gift J. Nielson </td><td> Streptavidin PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Geschenk von J. Nielson </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> Maus </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, Southern Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Huhn </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> Maus </td><td> IgG 1 </td><td> Messam et al. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Kaninchen </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA </td></tr><tr><td> βIII Tubulin </td><td> Maus </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2 a-PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Immunzytochemie </td></tr><tr><td> βIII Tubulin (1:1,500) </td><td> Maus </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Kaninchen </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Huhn </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> Kaninchen </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . Tabelle 2 Antikörper (Abs) für Durchflusszytometrie und Immunzytochemie Assays verwendet Antikörper-Konjugate: PE, Phycoerythrin; PETR, Phycoerythrin Texas Red; AMCA, Amino-methyl-cumarin-acetat; Cy, Cyanin; FITC Fluoresceinisothiocyanat Ig:. Immunglobulin. . AF: Alexa Fluor; gαm: Ziege-Anti-Maus; gαrb: Ziege-Anti-Kaninchen; dαck: Esel-Anti-Huhn. </td></tr></tbody></table>

progenitor-derived oligodendrocyte culture system from human fetal brain

Differenzierung von humanen neuronalen Vorläuferzellen in neuronale und gliale Zelltypen ein Modell zu studieren und Vergleichen molekulare Regulation von neuronalen Zellstammbaums Entwicklung. In vitro Expansion von neuralen Vorläuferzellen aus fötalem ZNS-Gewebe ist gut charakterisiert worden. Trotz der Identifizierung und Isolierung von glialen Vorläuferzellen aus adulten menschlichen subkortikalen weißen Substanz und Entwicklung verschiedener Kulturbedingungen direktem Differenzierung von fötalen neuralen Vorläuferzellen in Myelin Herstellung Oligodendrozyten, Erhaltens ausreichender menschlichen Oligodendrocyten für in vitro Experimente ist weiterhin schwierig. Differenzierung Galactocerebrosid + (GalC) und O4 + Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder Vorläuferzellen (OPC) aus neuralen Vorläuferzellen wurde berichtet, mit zweiten Trimester fetalen Gehirns. Allerdings sind diese Zellen nicht proliferieren in Abwesenheit von Stützzellen einschließlich Astrozyten und Neuronen und schnell über die Zeit in Kultur verloren. Der Bedarf bleibt für eine Kultur-System an Zellen des Oligodendrozyten Linie geeignet für in vitro Experimente erzeugen. Kultur von primären humanen Oligodendrozyten könnte beispielsweise ein nützliches Modell für die Pathogenese von neurotropen Infektionserreger wie das menschliche Polyomavirus, JCV, die in vivo infiziert jene Zellen zu studieren. Diese kultivierten Zellen konnten auch Modelle von anderen demyelinisierenden Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Primary, humanen fötalen brain-derived vermehren multipotente neurale Vorläuferzellen in vitro unter Beibehaltung der Fähigkeit, sich in Neuronen (Vorläuferzellen abgeleiteten Neuronen, PDN) und Astrozyten (Vorläuferzellen abgeleitete Astrozyten, PDA) Diese Studie zeigt, dass neuronale Vorläuferzellen induziert werden kann differenzieren durch viele der Stufen oligodendrocytic Linie Entwicklung (Vorläuferzellen abgeleitete Oligodendrozyten, PDO) zu unterscheiden. Wir Kultur neuralen Vorläuferzellen in DMEM-F12 serum-freien Medien unterstütztumgesetzt mit basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA), Sonic Hedgehog (Shh), neurotrophen Faktor 3 (NT-3), N-2 und Trijodthyronin (T3). Die kultivierten Zellen werden bei 2.5e6 Zellen pro 75cm Flaschen etwa alle 7 Tage passagiert. Mit diesen Bedingungen behält die Mehrzahl der Zellen in Kultur eine Morphologie von wenigen Prozessen und Express Marker des Pre-Oligodendrozyten-Zellen, wie A2B5 und O-4 ist. Wenn wir die vier Wachstumsfaktoren (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) entfernen und konditionierten Medien von PDN, beginnen die Zellen zu mehreren Prozesse und Express Marker spezifische Differenzierung der Oligodendrozyten, wie GalC und Myelin erwerben basisches Protein (MBP). Wir führten phänotypischen Charakterisierung mit multicolor Durchflusszytometrie einzigartige Marker der Oligodendrozyten zu identifizieren.

Es ist sehr wichtig, um die Differenzierung von einer 70% -80% konfluente Zellkultur neuralen Vorläuferzellen (1A) zu starten. Viele Zellen sterben nach dem Wechseln des Kulturmediums aus Vorläuferzellen zu Oligo Medium, da es bestimmte Wachstumsfaktoren enthält. Dies zeigt, daß das Wachstum von neuralen Vorläuferzellen nicht zu einem Phänotyp oligodendrocytic begangen wird nicht von dem neuen Medium (1B) gestützt werden. Inkubation in Oligo-Medium + GF für eine Woche in Folge e...

Watch this Scientific Journal Video about Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain at JoVE.com

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente Vorläuferzellen<em&gt; In vitro</em&gt; Gleichzeitig die Fähigkeit, sich in Neuronen und Astrozyten differenzieren. Diese Arbeit zeigt, dass neuronale Vorläuferzellen induziert werden durch Phasen des oligodendrocytic Linie durch Konditionierung mit ausgewählten Wachstumsfaktoren zu unterscheiden.

Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K Aufrufe.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health. Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente Vorläuferzellen In vitro Gleichzeitig die Fähigkeit, sich in Neuronen und Astrozyten differenzieren. Diese Arbeit zeigt, dass neuronale Vorläuferzellen induziert werden durch Phasen des oligodendrocytic Linie durch Konditionierung mit ausgewählten Wachstumsfaktoren zu unterscheiden.