Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa intramuros no National Institutes of Health, NINDS. Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do Laboratório de Medicina Molecular e Neurociência, Rick Dreyfuss para ajudar com microscopia e peneiramento Pamela C. para ajudar com a edição.

Nota: Para a cultura de rotina de células progenitoras neurais e células da linhagem oligodendrocytic, a incubação é realizada a 37 ° C em 5% de CO 2 humidificado atmosfera. Cada 2 dias, o meio é substituído com 50 a 100% de meio fresco se a cultura é de 40-70% confluentes. No momento da confluência perto, as culturas são passadas a 2-2.5e6/T75 frasco geralmente num plano semanal. 1. Preparando o balão revestido <ol><li> Para preparar frascos revestidos diluir 5 mg de poli-D-lisina (PDL) em 100 ml de água desionizada (DI-água), em seguida, casaco frascos T75 com 50 ug / ml de PDL à temperatura ambiente (TA) no escuro. Após 1 ½ hora, aspirar o PDL e lavar os frascos de uma vez com DI-água. Deixe os frascos secos antes de semear as células (Tabela 1). </li></ol> 2. Começando diferenciação das células progenitoras neurais em oligodendrócitos Progenitoras derivados (DOP) O protocolo para seolate células progenitoras do SNC é descrito numa publicação anterior e não faz parte do presente protocolo 1. As células progenitoras do SNC, foram isolados do telencéfalo de um cérebro de 8 semanas de gestação fetal, obtidas em conformidade com as directrizes de NIH. <ol><li> Crescer população multipotencial das células progenitoras neurais em PDL frascos revestidos em meio neurobasal suplementado com 25 ng / ml de bFGF e 20 ng / ml do factor de crescimento epidérmico (EGF) (Figura 1A). Não usá-los se for maior do que a passagem 11 (p11). </li><li> Começam a diferenciar as células progenitoras neuronais, quando a cultura é de aproximadamente 70% confluentes. </li><li> Fazer meio de diferenciação completa oligodendrócitos usando DMEM livre de soro / HAMS F12 01:01 suplementado com albumina de soro bovino, L-glutamina, gentamicina, componentes N2, T3, Shh, NT-3, bFGF, e PDGF-AA (Tabela 1) . Este meio será definida como o meio de oligo com factores de crescimento (meio de oligo + GF). </li><li> Remover PROGENItor media dos frascos, lave as células uma vez com salino tamponado com fosfato (PBS), em seguida, adicionar meio de oligo + GF (detalhes descritos em 2.3) para iniciar a diferenciação oligodendrocítica. Apenas as células comprometidas com a linhagem oligodendrocytic crescerá (Figura 1B). Cultura das células neste meio durante 3 semanas. </li><li> Cada semana, quando as células estão a 90-95% de confluência passagem, eles utilizando tripsina (0,05%), EDTA (0,1%) (4 ml para um frasco T75). Transferir todo o meio a partir das células para ser passado para um tubo cónico de 50 ml, o meio condicionado será utilizado para temperar a tripsina. Certifique-se de não secar as células. Em seguida, adicionar tripsina. </li><li> Incubar as células em tripsina durante 5 min à TA, batendo suavemente o frasco várias vezes para ajudar destacamento celular. </li><li> Extingue-se a tripsina por adição de 4-5 ml de meio condicionado para o balão com as células isoladas. </li><li> Transferir o meio e as células para o mesmo tubo cónico de 50 ml. Centrifuga-se o meio e as células a 1200 rpm (~300 xg) durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante, ressuspender o sedimento de células, inclinando gentilmente o tubo e, em seguida, adicionar meio fresco oligo + GF. Gentilmente pipeta meio e as células para cima e para baixo para se obter uma suspensão de célula uniforme. </li><li> Contar as células e 2.5e6 de transferência em cada novo PDL revestido T75 frasco. </li></ol> 3. Etapa final da diferenciação de oligodendrócitos <ol><li> Após 3 semanas de cultura em meio de oligo + GF, quando as células estão a 70-80% de confluência, iniciar o processo final de diferenciação (Figura 1C). </li><li> Preparar meio da mesma maneira como o meio de oligo + GF mas sem adicionar o GF quatro: Shh, NT-3, bFGF e PDGF-AA. Este meio sem o GF quatro serão definidos como oligo meio - GF. </li><li> Aspirar o meio de oligo + GF do frasco, lavar uma vez com PBS e, em seguida, adicionar um volume total de 16 ml de meio, que de ¾ (12 ml) é oligo meio - GF e ¼ (4 ml) é PDN meio condicionado, por 6-10 Dias). O uso de meio condicionado a partir de PDN não é crítico para o processo de diferenciação ou a sobrevivência das células. Nós, de facto, observou-se que só o contacto directo com as células de DOP PDN em experiências de co-cultura tinha um efeito sobre a duração da sobrevivência DOP. O tempo de sobrevivência médio em oligo - GF pode ser prolongada até duas ou três semanas, se as células de DOP são co-cultivados com células PDN. O protocolo para diferenciar as células progenitoras neurais em PDN é descrito numa publicação anterior e não faz parte do presente protocolo 1. Retirada do factor de crescimento a partir dos resultados de cultura de média em cultura progressivamente diferenciadas de células com vários processos (Figura 1D). </li></ol> 4. Ensaio de Citometria de Fluxo O ensaio de citometria de fluxo compara a aquisição de marcadores de oligodendrócitos, durante o processo de diferenciação, em relação com as da sua população parental. <ol><li> Use pró neuralgenitores como controle. Semente de células DOP 2.5x10 6 células em dois frascos T75 revestidos com poli-D-lisina em meio de oligo + GF. </li><li> Uma semana mais tarde, substitua meio com meio fresco oligo + GF em frascos como uma cultura de controlo para a viabilidade celular, enquanto que outros frascos tinham oligo meio - GF. </li><li> Para dissociar as células em ambos os meios DOP usar 20 U / ml de papaína e não tripsina. Isto é porque a papaína tem um suave efeito sobre as células durante a dissociação preservação da morfologia celular. </li><li> Adicionar 5 ml de solução salina equilibrada de Earle (EBSS) para um frasco de papaína. Colocar o frasco a 37 ° C durante 10 minutos ou até que a papaína esteja completamente dissolvido e a solução é mais clara. Esta é a solução de papaína utilizada para dissociar as células. </li><li> Adicionar 0,5 mL de EBSS para um frasco de desoxirribonuclease I (DNase) (Tabela 1). Misture delicadamente. Adicionar 0,25 ml desta solução para o frasco de papaína dissolvida. Esta preparação contém uma concentração final de aproximadamente 20 U / ml de papaina, e 00,005% de DNase. </li><li> Solução de papaína lugar (como descrito acima), em que as células e incubar a 37 ° C durante 15-30 min; monitorar o desprendimento das células utilizando um microscópio. Parar a reacção com 5 ml de meio com ou sem GF e centrifugar a 1200 rpm durante 7 min. </li><li> Transferir os sedimentos celulares a partir de ambos os balões em dois diferentes tubos de 5 ml de polipropileno e lavá-las com meio fisiológico normal (NPM: 145 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,8 mM CaCl2, 10 mM de Hepes e 10 mM de glucose) suplementado com 1 mg / ml albumina de soro bovino (BSA + NPM). </li><li> Executar superfície imunocoloração a 4 ° C durante 20 minutos utilizando específicos e apropriadamente titulado anticorpos primários para A2B5, O4, GalC (Tabela 2). </li><li> Lavar as células com NPM + BSA a 4 ° C durante 5 min e incube-as com anticorpos específicos secundários, a 4 ° C durante 20 minutos (Tabela 2). </li><li> Para corar os antigénios intracelulares, incluindo nestina, proteína glial fibrilar ácida (GFAP), classe III e serta;-tubulina e a proteína básica mielina (MBP) (Tabela 2), as células fixar em 2% de paraformaldeído (PFA), durante 20 min à TA e permeabilizar com etanol a 70% frio durante 15 min a -20 ° C. </li><li> Lavar as células com PBS 1x e incubar com anticorpos específicos secundários (Quadro 2). </li><li> Para discriminar entre células intactas e fragmentos subcelulares, durante a análise de citometria de fluxo, corar as células com 4,6-diamidino-2-phenyllindole, o dicloridrato de (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> Na otimização do protocolo acima, foram realizados todos os experimentos de controle apropriados para confirmar a especificidade de cada imunorreagente. Resumidamente, para os anticorpos marcados directamente, o controlo negativo adequado era um anticorpo conjugado directamente da mesma classe de imunoglobulinas do isotipo (ou subclasse) e conjugado de fluorocromo como o anticorpo primário (isto é, o controlo de isotipo). Para imunomarcação indireta de anticorpos primários, o adequado controle negativo wcomo anticorpo secundário conjugado com o fluorocromo de interesse que especificamente dirigida a classe de imunoglobulina (ou subclasse) do hospedeiro, em que o anticorpo primário foi gerado. Quando os anticorpos primários a partir de hospedeiros múltiplos (rato, coelho e galinha) foram utilizados em conjunto, utilizou-se o anticorpo secundário de segmentação do anticorpo primário de cada máquina e cada um anticorpo secundário usado foi tipicamente cruzada adsorvido contra as imunoglobulinas de outros hospedeiros para minimizar transversal imunorreatividade hospedar. Os controlos positivos incluíram imunocoloração directa ou indirecta de preparações de células que se sabe expressarem os antigénios de interesse utilizando quer imunorreacções, directas ou indirectas, com os anticorpos primários específicos para estes antigénios. Os métodos de optimização acima foram efectuados uma vez para cada tipo de imunocoloração experimentos. Imunorreacções de controlo não revelou imunorreactividade cruzada epítopo significativa entre os anticorpos primários e secundários. A citometria de fluxo foi realizada de forma uniformesuspensão de células marcadas por fluorescência utilizando um classificador FACVantage célula SE (BD Biosciences, San Jose, CA) equipado com três lasers, que proporcionam comprimentos de onda de excitação de 488 nm sintonizados, 647 nm, e uma gama de UV (351-364 nm) (Figura 2) . </li></ol> 5. Ensaio de Imunofluorescência Nota: Para as experiências de imunofluorescência, DOP são plaqueadas em meio de oligo + GF ou meio de oligo - GF em 2.5e5 em placas de 6 poços revestidas com PDL. As células são fixadas em 2% de PFA em vários pontos de tempo após a retirada de factores de crescimento. O anticorpo mancha é realizada em placas de 6 cavidades de plástico em vez de lamelas de vidro. <ol><li> Remova a mídia e adicione o PFA 2%. Incubar durante 10 min à TA. Descarte PFA. Lavar as células 3 vezes com PBS, 5 minutos de cada vez. Tenha cuidado para não secar as células. </li><li> Permeabilizar as células para marcadores intracelulares utilizando solução de triton 0,25% em PBS durante 10 min à RT. </li><li> Para evitar ligação não específicos de células, bloco fou 10 min com HHG (1 mM de tampão HEPES, soro de cavalo a 2% e soro de cabra a 10% em solução salina equilibrada de Hanks). Diluir anticorpos específicos primários (Tabela 2) até uma concentração pré-determinada em HHG. Coloque anticorpos diluídos em células. Incubar 1 hora à temperatura ambiente no agitador ou a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar as células 3 vezes com PBS, durante 5 minutos de cada vez. Diluir anticorpos secundários apropriados (Tabela 2), acoplado com um fluorocromo a uma concentração pré-determinada em HHG. Coloque a mistura de anticorpos secundários diluídos em células. Incubar 1 hora à temperatura ambiente num agitador no escuro. </li><li> Lavar as células 3 vezes com PBS, durante 5 minutos de cada vez. </li><li> Para evitar a fotodegradação adicionar 10 ul de Prolong ouro com DAPI para as células e colocar uma lamela de vidro em cima deles. Visualizar as células marcadas, utilizando um microscópio de fluorescência Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (Figura 3). </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo descreve como para derivar a partir de oligodendrócitos fetais humanas primárias células progenitoras neuronais e caracterizar o fenótipo de citometria de fluxo utilizando ambos e coloração por imunofluorescência. A expansão eo crescimento de células progenitoras neurais de SNC fetal foi muito bem descrito 1-4. No entanto, a obtenção de oligodendrócitos humanos suficientes para experimentação in vitro continua a ser difícil, embora seja possível identificar e i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> DME / PRESUNTOS F12 01:01 </td><td> Omega Cientista </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Bovine Albumin </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Qualidade Biologicals </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Qualidade Biologicals </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 nM </td></tr><tr><td> Componentes N2 </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Shh </td><td> R &amp; D System </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 ^ g / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Qualidade Biologicals </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papaína </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> DNase frascos </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0,005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar Ouro comDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Reagentes. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Primário Abs (todos a 1 ug / ml) </td><td></td><td> Isotype espécies </td><td> Fonte </td><td> Abs secundário </td></tr><tr><td colspan="5"> Citometria de Fluxo </td></tr><tr><td> A2B5-Biotina </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Dom J. Nielson </td><td> Estreptavidina PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Presente de J. Nielson </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> Mouse </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, Southern Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Frango </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestina </td><td> Mouse </td><td> IgG 1 </td><td> Messam et al. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Coelho </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA </td></tr><tr><td> tubulina βIII </td><td> Mouse </td><td> IgG2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG-2-PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Imunocitoquímica </td></tr><tr><td> tubulina βIII (1:1,500) </td><td> Mouse </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Coelho </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Frango </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> Coelho </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . Tabela 2 Os anticorpos (Abs) utilizados para ensaios de citometria de fluxo e imunocitoquímica conjugados de anticorpos: PE, ficoeritrina; PETR, ficoeritrina Texas Red; AMCA, amino-metil-cumarina-acetato; Cy, cianina; FITC, isotiocianato de fluoresceína de Ig:. Imunoglobulinas. . AF: Alexa Fluor; gαm: cabra anti-rato; gαrb: cabra anti-coelho; dαck: burro anti-galinha. </td></tr></tbody></table>

progenitor-derived oligodendrocyte culture system from human fetal brain

Diferenciação de progenitores neurais humanas em tipos de células neuronais e gliais oferece um modelo para estudar e compará-regulação molecular do desenvolvimento neural de células de linhagem. Expansão in vitro de células progenitoras neurais a partir de tecido fetal CNS tem sido bem caracterizado. Apesar de a identificação e isolamento de células progenitoras da glia do adulto assunto sub-cortical humano branco e desenvolvimento de várias condições de cultura de diferenciação directa de progenitores neurais fetais em oligodendrócitos de mielina que produzem, adquirindo suficientes oligodendrócitos humanos para experimentação in vitro continua a ser difícil. Diferenciação de galactocerebrósido + (GalC) e O4 + precursor oligodendrócitos ou células progenitoras (OPC) a partir de células precursoras neurais tem sido relatado o uso de segundo trimestre cérebro fetal. No entanto, estas células não proliferam na ausência de células de suporte, incluindo os astrócitos e neurónios, e são rapidamente perdidos ao longo do tempo na cultura. Permanece a necessidade para um sistema de cultura para a produção de células da linhagem de oligodendrócitos adequado para experimentação in vitro. Cultura de oligodendrócitos humanos primários poderiam, por exemplo, ser um modelo útil para estudar a patogénese da neurotrópicas agentes infecciosos, como o poliomavírus humanos, JCV, que in vivo infecta as células. Estas culturas de células podem também proporcionar modelos de outras doenças desmielinizantes do sistema nervoso central (SNC). Primária, fetal humano derivado do cérebro, as células progenitoras neurais multipotenciais proliferam in vitro, mantendo a capacidade de se diferenciar em neurônios (células progenitoras derivadas de neurônios, PDN) e astrócitos (células progenitoras derivadas de astrócitos, PDA) Este estudo mostra que progenitores neurais pode ser induzida para diferenciar através de muitos dos estágios de desenvolvimento da linhagem oligodendrocytic (progenitor derivados de oligodendrócitos, DOP). Nós, de cultura de células progenitoras neurais em meio isento de soro F12 de DMEM-supcomplementado com um factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), factor neurotrófico 3 (NT-3), N-2 e tri-iodotironina (T3). As células cultivadas são passadas a células 2.5e6 por frascos de 75 centímetros aproximadamente de sete em sete dias. Usando estas condições, a maioria das células na cultura de manter uma morfologia caracterizada por alguns processos e marcadores expressos do pré-oligodendrócitos células, tais como A2B5 e O-4. Quando se remover os factores de crescimento de quatro (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) e adicionar o meio condicionado a partir de PDN, as células começam a adquirir mais processos e os marcadores de diferenciação específicos expressos oligodendrócito, tais como GalC e mielina proteína básica (MBP). Foi realizada a caracterização fenotípica usando multicolor citometria de fluxo para identificar marcadores únicos de oligodendrócitos.

É muito importante para iniciar o processo de diferenciação de uma cultura de células de 70% -80% confluente neural progenitor (Figura 1A). Muitas células irão morrer depois de mudar o meio de cultura de células progenitoras para médio oligo uma vez que inclui fatores de crescimento específicos. Isto indica que o crescimento de células progenitoras neurais não comprometidos com um fenótipo oligodendrocytic não serão suportadas pelo meio novo (Figura 1B). A incubação em m...

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Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Primário, fetais humanos derivado do cérebro, as células progenitoras multipotenciais proliferam<em&gt; In vitro</em&gt; Enquanto se mantém a capacidade de se diferenciar em neurónios e astrócitos. Este trabalho mostra que os progenitores neurais podem ser induzidas a diferenciar por estágios da linhagem oligodendrocytic por condicionamento com factores de crescimento seleccionados.

Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K visualizações.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health. Primário, fetais humanos derivado do cérebro, as células progenitoras multipotenciais proliferam In vitro Enquanto se mantém a capacidade de se diferenciar em neurónios e astrócitos. Este trabalho mostra que os progenitores neurais podem ser induzidas a diferenciar por estágios da linhagem oligodendrocytic por condicionamento com factores de crescimento seleccionados.