עבודה זו התאפשרה הודות למימון מקרן Wellcome. JM (080,964) וSCW (080,948) נתמכו במלגות Wellcome Trust וDT על ידי מלגת לימודים לנאמנות מלאווי-ליברפול-Wellcome.

1. אוסף דוגמאות יכולות להיות מופעלים בקלות באמצעות טסיות טמפרטורה, תסיסה או אחסון, ולכן הם צריכים להיות מטופלים בזהירות. השימוש בvacutainers לאסוף דם להכנת טסיות דם הוא בלתי נמנע ברוב המקרים קליניים, אך יש לשקול בזהירות כשאיבה עלולה לגרום להפעלה של טסיות דם. בשל הפרוטוקול הקליני בשימוש בבית החולים למחקר שלנו, הדגימות שלנו נאספות בזהירות בvacutainers ציטרט הנתרן. אנחנו לא חווינו שום בעיות עם הפעלה מוקדמת טסיות בזה או 12 המחקר הקודם שלנו. אנו אוספים דם להכנת טסיות דם מהקבוצה O + אנשים כדי למזער את הצטברות אנטיגן קבוצת דם ספציפי. תורמים גם לא לקחו תרופות בימים 7-10 הקודמים כידועות כמה תרופות כדי להשפיע על תפקוד טסיות דם. 1.1 הכנה של פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כ 5 מ&quot;לדם כולו ממארח ​​נאיבי מלריה או 2.5 מ&quot;ל של דם מסנטימטר או מלריה חמורה (SM) חולים בvacutainer ציטרט הנתרן (מספר מוצר BD 36,276). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדם כולו ב 250 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. אל צנטריפוגות ב 4 ° C בטמפרטורות נמוכות עלולות לגרום לטסיות הדם לצבירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את supernatant מעונן בצינור 15 מ&quot;ל נקי. טסיות דם מופעלים בקלות על ידי שינוי בטמפרטורה וזעזועים פיסיים ולכן יש לטפל בזהירות. הימנע רועד או כל תנועות קופצניות של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש haematocytometer של נויבאואר לספור ולהתאים את ההשעיה לטסיות הדם&gt; 300 x 10/3 טסיות μl לתורמים בריאים ו&lt; 150 x 10/3 טסיות μl מCM וחולי SM באמצעות חיץ פוספט 1X (pH 7.2-7.4; PBS). הקפד לבחור גורם לדילול גבוה כדי להקל על ספירת הטסיות ולהבטיח הדיוק שלה. </li></ol> הערה: מלריה טפיחהיש לי ients ספירת טסיות דם מופחת בהשוואה לאנשים הבריאים 16,17,18. ריכוזים לכן הטסיות לסנטימטר וUM מותאמים על פי ספירת הטסיות הממוצעת של חולים בכל קבוצת אבחון מלריה. פ הפנוטיפ הצטברויות falciparum נפוץ בבידודי סנטימטר ומציג זיקה מחייבת חזקה ולכן ריכוזי טסיות המופחתים אינו משפיע על גודל גוש או תדירות מאז ריכוז טסיות דם הוא סטנדרטי לכל המקרים הסנטימטר. 1.2 הכנת הפלזמה טסיות עלובה (PPP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג PPP, צנטריפוגות חלק PRP השיג מעל ב 1500 XG במשך 10 דקות. הרוב המכריע של טסיות דם הוא pelleted בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לאחסן גם PRP וPPP על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. באופן אידיאלי, להשתמש בטסיות דם טריים עבור assay ההצטברויות. לאחר 8-10 ימים רוב הלוחיות עשויים להיות לא פעיל וכנראה מצטבר. </li></ol> 2. סעיפיםITE תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שלוש הפעמים pRBC pelleted עם 5-10 מ&quot;ל RPMI 1640 על ידי צנטריפוגה XG ב 370 במשך 5 דקות. הערה: בפרוטוקול זה כל התרבויות התחילו מכ 1 מיליליטר נפח תא גדוש (PCV) ומתוחזק על 5% המטוקריט. ניתן להתחיל עם כל תרבויות PCV של pRBC והותאמו בהתאם עם RBC נגוע ותקשורת להגיע המטוקריט רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את pRBC בבקבוק תרבות ומוסף התרבות בינונית עם מלריה הסטנדרטית של RPMI 1640 בתוספת 25 HEPES מ&quot;מ, 5% Albumax II או סרום 10% ו -40 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin להשיג 5% המטוקריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלחל תרבות צלוחיות עם תערובת של חנקן 92.5%, 2.5% ו -5% חמצן דו תחמוצת הפחמן לפני האיטום והדוגרים. לחלופין, ניתן להשתמש בשיטת צנצנת נר אוויר חזק של טרייגר-ג&#39;נסן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לpRBC התקבל ישירות חולים, דגירה שלהם בקבוק התרבות ל24-36 שעות ב37 ° C חממה ב 5% CO 2 כדי לקבל טפילים בוגרים. הערה: Mקווי התרבות מותאמים OST מעבדה והם קלים מאוד לשמור בתרבות בתנאים סטנדרטיים. קיימות טכניקות פשוטות המתוארות להלן, שניתן להשתמש כדי לסנכרן את השלבים טפילים שונים כדי לשמור על קצב צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כתם דם דק כפי שיתואר להלן ולבחון התבגרות טפיל תחת מיקרוסקופ אור. </li></ol> 3. הכנת סרט שקופיות דם דקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כ 10-15 μl דם על קצה אחד של שקופיות זכוכית חלבית מונחות על משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגעת בטיפת הדם בקצה שקופית שנייה ועד לדם להתפשט באופן שווה על פני הקצה של השקופית השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את השקופית השנייה בזווית של ° 45, במהירות אך בעדינות, בלי להפעיל יותר מדי לחץ על השקופית הראשונה, חלק את הדם על פני השקופית הראשונה לעשות סרט דק של דם המתחלק באופן שווה. אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את השקופיות במתנול למשך 10 שניות. אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את השקופיות ב2% Giemsa stעין ללפחות 10 דקות. יש לשטוף באופן נרחב עד שהמים פועל ברורים. אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את השקופית באמצעות עדשת תחליב שמן 90-100x במיקרוסקופ אור </li></ol> 4. טיהור וסנכרון של שלבים מיניים הטיהור של פ הבוגר falciparum pRBC הוא צעד הנדרש עבור assay ההצטברויות. ואכן, רק טפילים בוגרים מסוגלים להיקשר לקולטנים טסיות כפי שהוא בשלב זה מחזור החיים שבאים לידי ביטוי ligands הרלוונטי ובולט מפני השטח של אריתרוציטים נגועים. ישנן מספר שיטות לטיהור ולסנכרן את שלבים מיניים של פ falciparum: יכולים להיות מועשר על ידי Percoll שיפוע 19 שלבים מאוחרים זוויגיים; תא מגנטי מיון 20 או באמצעות פרוטוקול ג&#39;לטין שיקוע 21 שתואר כאן.. סורביטול-סנכרון בוחר לשלבי טבעת 22, לאחר שמצלצל בתרבית במשך שעה 24-26 להשיג שלבים בשלים (ללא need לבצע הנפקת ג&#39;לטין). ההנפקה Plasmagel 4.1 הנפקת Plasmagel משתמשת בפתרון דמוי ג&#39;לטין כדי לבחור למשקל נמוך יותר עם ג&#39;ולי אריתרוציטים להישאר בפתרון תוך צורות הטבעת צפופות ורוזטות לשקוע בתחתית. טכניקה זו נותנת עד טוהר 90% מאריתרוציטים שלב הנגועים הבוגרים ויכולה לשמש הן לשדה ומבודד במעבדה. עם זאת, כאמור, הנפקת plasmagel מסירה pRBC rosetting כמו גם שלבי בוסר שעלול לגרום להצטברויות תדירות מופחתת באותם דגימות עם תדר rosetting גבוה. עם זאת, היעדר pRBC rosetting לאחר הנפקת plasmagel לא ישפיע על assay ההצטברויות בגלל rosetting הוא אינטראקציה של אריתרוציטים pRBC ונגועים תוך clumping הוא pRBCs תיווך מחייב ידי טסיות דם. יגנד המעורב בשתי התכונות האלה הוא שונה; עם בעיקר להשלים קולט CR-1 באריתרוציטים נגועים תיווך rosetting.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון Prewarm Gelofusine ובינוני ללא השני סרום / Albumax עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התרבות ל15 מ&quot;ל סטרילי צינור נקי ותאי גלולה ידי צנטריפוגה בטמפרטורת חדר ב370 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant כדי לא להפריע לתאי resuspend גלולה ובנפח שווה של Gelofusine ובינוני ללא חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התערובת לצינור 15 מ&quot;ל סטרילי ומאפשר לעמוד על 15-20 דקות ב37 ° C חממה או עד שניתן לראות תיחום ברור בין מפלס עליון ותחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את השכבה העליונה לצינור טרי מיליליטר סטרילי 15 ולהוסיף 10 מ&quot;ל של RPMI הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 370 במשך 5 דקות וזורקים supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את השלב ההתפתחותי parasitaemia ועל ידי כתם דם דק ולבחון תחת מיקרוסקופ אור כאמור בסעיף 4. </li></ol> הערה: טווח pRBC מבוגר בין 60-90% מאריתרוציטים נגועים depending על parasitaemia הראשוני של התרבות. עבור אחוז הגבוה של טפילים בוגרים, השתמש תרבויות עם parasitaemia ראשוני של ≥ 10%. 5. Clumping Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש haematocytometer של נויבאואר לספור ולהתאים את ההשעיה pRBC מתקבלת לאחר הנפקת plasmagel ל1 8 X 10 pRBC / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור 1.5 מ&quot;ל טרי, resuspend pRBC בהמטוקריט 5%, acridine הכתום ב20 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז וPRP הסופי ב 10% מהנפח הכולל. במקום acridine הכתום, יכולות להיות מוכתמות תרבויות טפילות עם 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ברומיד ethidium למשך 5 דקות לפני השימוש. דוגמה לתערובת תגובה 200 μl, להוסיף 10 pRBC הבוגר μl, 20 μl של 300 x 10 3 טסיות / μl לPRP מתורמים בריאים או 150 x 10/3 טסיות μl מחולי SM ו170 μl של מדיום ללא חלבון. הערה: היחס של טסיות דם: pRBC בתגובות הסופיות הוא 20:01. זה חשוב כמו זה מאפשר לי מקסיםאום תדירות הצטברויות מדגם שתיקבע. אם פחות טסיות מתווספות בבקרה אז אולי לא צריך את כל pRBCs הלם סיכוי לגוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו אופן להכין את הפקדים הבאים, תאי דם אדומים נגועים וPRP וpRBC עם PPP כדי לברר את תפקידו של טסיות דם בהצטברויות pRBCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לבקבוקון הברגה כובע חרוטי 1.5-2.0 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבקבוקון תחת תסיסה עדינה על ידי הגלגול ב10-12 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו להיווצרות גוש על ידי-שקופית רטובה שהוכנה על ידי pipetting 10 μl של pRBC ± תמהיל טסיות דם בשקופית זכוכית, מכסה בזכוכית להחליק ולבחון תחת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימה יכולה להיעשות במרווחי 15-20 דקות עבור סכום כולל של 120 דקות. גוש נחשב כצבירה של שלושה או יותר אריתרוציטים נגועים. </li></ol>

<ol>
	<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Saul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+variant+surface+antigens+on+malaria-infected+red+blood+cells.">The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells.</a> Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).</li><li>Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+pathogenesis.">Malaria pathogenesis.</a> Science. 264, 1878-1883 (1994).</li><li>Newbold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-specific+adhesion+and+clinical+disease+in+Plasmodium+falciparum.">Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).</li><li>Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+study+of+the+pathology+of+fatal+malaria.+Evidence+for+widespread+endothelial+activation+and+a+potential+role+for+intercellular+adhesion+molecule-1+in+cerebral+sequestration.">An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration.</a> Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).</li><li>Fried, M., Duffy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Plasmodium+falciparum+to+chondroitin+sulfate+A+in+the+human+placenta.">Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta.</a> Science. 272, 1502-1504 (1996).</li><li>Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.+falciparum+rosetting+mediated+by+a+parasite-variant+erythrocyte+membrane+protein+and+complement-receptor+1.">P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1.</a> Nature. 388, 292-295 (1997).</li><li>Udomsangpetch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+-infected+erythrocytes+form+spontaneous+erythrocyte+rosettes.">Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes.</a> J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).</li><li>Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+Plasmodium+falciparum+var+gene+implicated+in+malaria+in+pregnancy.">Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy.</a> J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).</li><li>Biswas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+uses+gC1qR/HABP1/p32+as+a+receptor+to+bind+to+vascular+endothelium+and+for+platelet-mediated+clumping.">Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping.</a> PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).</li><li>Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+accumulation+in+brain+microvessels+in+fatal+pediatric+cerebral+malaria.">Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria.</a> J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).</li><li>Wassmer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+from+Malawian+patients+with+cerebral+malaria-possible+modulation+in+vivo+by+thrombocytopenia.">Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia.</a> J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).</li><li>Mayor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+severe+malaria+outcomes+with+platelet-mediated+clumping+and+adhesion+to+a+novel+host+receptor.">Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor.</a> PLoS One. 6, e19422 (2011).</li><li>Arman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Mediated+Clumping+of+Plasmodium+falciparum+Infected+Erythrocytes+Is+Associated+with+High+Parasitemia+but+Not+Severe+Clinical+Manifestations+of+Malaria+in+African+Children.">Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).</li><li>Arman, M., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+conditions+affect+the+outcome+of+Plasmodium+falciparum+platelet-mediated+clumping+assays.">Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays.</a> Malar. J. 7, 243 (2008).</li><li>Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombocytopenia+in+malaria+with+immunoglobulin+(IgM)+changes.">Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes.</a> Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).</li><li>Jy, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregates+as+markers+of+platelet+activation:+characterization+of+flow+cytometric+method+suitable+for+clinical+applications.">Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications.</a> Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).</li><li>Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection-induced+thrombocytopenia.">Infection-induced thrombocytopenia.</a> Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).</li><li>Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+humoral+immune+response+in+Plasmodium+falciparum+malaria.+II.+IgG+subclass+levels+of+anti-P.+falciparum+antibodies+in+different+sera.">Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera.</a> Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).</li><li>Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells.">Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> MACS. 4, 7-8 (2000).</li><li>Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation.">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Chotivanich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+autoagglutination+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+and+disease+severity+in+Thailand.">Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand.</a> J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).</li><li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+is+a+common+adhesive+phenotype+and+is+associated+with+severe+malaria.">Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).</li><li>Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-adrenergic+stimulation+of+phosphatidylinositol+synthesis+in+human+platelets+as+an+alpha-2+effect+secondary+to+platelet+aggregation.">Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation.</a> J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).</li><li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma:+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field.">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

יש לנו תאר assay הצטברויות טסיות דם בתיווך המשמש ללימוד pRBC קליני מבודדים באופן ישיר בתחום. הצטברויות טסיות דם בתיווך, התנהגות אופיינית בפ קליני מבודדים falciparum, זוהה כדבק פנוטיפ מובחן, תכוף בבידודי CD36 מחייבים 12,23-24. יש לנו בשימוש assay זה לזהות שלוש נקודות עיקריות: 1) חזקות בפנוטיפ clumping המבחנה של פ falciparum מבודד מילדי Malawian הקשורים לחומרת מחלה ואבחון 2) mediaties P-selectin קולט הרומן נחבט בטסיות יחד עם CD36, 3) מידת טרומבוציטופניה הנוכחית בחולים עם סי די בכך כדי להגביל את היווצרות נוספת של גושים בpRBC 12 חוץ גופית. המעורבות של טסיות דם בהיווצרות הגוש באה לידי ביטוי על ידי בחינת הכנה רטובה שקופית כפי שמתואר בסעיף 6. יכולות להיות מבודדות מטסיות PRP על ידי צנטריפוגה במהירויות גבוהותעל מנת למזער תגובות antigenic קבוצת דם, עם זאת, היינו כולו PRP על מנת למזער מוקדמת הפעלת טסיות דם מטיפול מוגזם ומצנטריפוגה במהירות גבוהה. פעילות טסיות דם ניתן למדוד על ידי בדיקת הצטברות טסיות דם באמצעות אגוניסטים חלשים טסיות דם, אפינפרין או diphosphate אדנוזין (ADP) 25 כפי שתואר ב26. ישנם כמה היבטים של assay כי בעבר כבר מאופיינת בצורה גרועה, אחד מהם הוא החשיבות של בחירת מקורות PRP וההשפעה של קבוצות אנטיגן דם על התוצאה של assay. הכנו PRP מאנשים שהיו קבוצת הדם O + ולא לקחנו תרופה כלשהי בימים האחרונים לפני 7-10 דם נמשך כחלק מתרופות יכולות להשפיע על התנהגות של טסיות דם. גורמים נוספים שעשויים להשפיע על הצלחה כוללים clumping pRBC המטוקריט, רמות parasitaemia ואורך של assay ההצטברויות. שימוש המטוקריט גבוה ושיתוף טסיותUNT זה יהיה קשה לדעת אם האשכול הוא באמת גוש או אם יותר מדי תאים רק יושבים יחד משום שהם צפופים 15. Clumping גם בדרך כלל עולה עם פעמים דגירה ארוכות יותר. כל אלה הם הקווים המנחים השימושיים שיש לשקול בעת תכנון מחקרי התקבצות. אנו מוצאים כי דגימות מקבוצות קליניות שונות ניתן לנתח במקביל באמצעות PRP מאותו התורם אם זה אפשרי לעשות זאת, אבל בהגדרות משאב מוגבלות כגון אתרי שדה בריכת העירוי מוגבלת בדרך כלל. לכן זה קשה לי + תורם O יחיד לתקנן את מבחני. לפיכך, אנו זיהינו + O כמה תורמים כדי להבטיח תאימות קבוצת דם בכל מקום אפשרי. שימוש במספר רב של תורמים הוא גם מועיל במקרים של גדלי דגימות גדולים כל כך שהניטל של תרומת דם אינו נופל על אדם אחד בלבד. נקודות דגימה ב15-20 דקות הן הרבה יותר ריאלי אם PE בודדrson עורך את מבחני, מה שמאפשר להכנות רטובות שקופיות וביצוע קינטיקה assay ללא דגימה פעמים החופפות. רוב הנתונים מיקרוסקופי הוא חזותי ואובייקטיבי במידה מסוימת, ולכן, חשוב שספירת תאים מאומתת על ידי יותר מאדם אחד. במקרה כזה, טיפול במדגם אחד בכל פעם יכול לאפשר ניתוח של שלוש עד ארבע דגימות יום, תלוי ביעילות אישית מלא. ניתן לבצע התכנסות בטסיות דם בתיווך באמצעות שני קליניים ומבודדים במעבדה. לקווי מעבדה, מומלץ שCD36 טפילים מחייבים משמשים כדי למקסם את תדרי clumping. Assay יכול להיות בשילוב עם מבחני התלכדות אחרים כגון rosetting או בשימוש בצעדים כבדים מבחני עיכוב שיאפשר המחקר של רצפטורים על טסיות הדם שעשוי לתווך מחייב pRBC, היבט הבין היטב ובחן של פנוטיפ זה.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

פ falciparum גורם למרבית זיהומי מלריה חמורים. את המנגנונים שבבסיס pathophysiological מלריה מוחית (CM) לא הבינו באופן מלא וכבר הכניסו כמה השערות קדימה, כולל חסימה מכאנית של microvessels על ידי פ &#39; תאי דם אדומים falciparum-parasitized (pRBC). ואכן, בשלב התוך האריתרוציטים של מחזור החיים שלו, פ יש falciparum היכולת הייחודית לשנות את פני השטח של הכדורית האדומה הנגוע על ידי יצוא פני שטח אנטיגנים שונים עם מאפיינים דבקים על הממברנה RBC. זה מאפשר התפיסה של pRBC ברקמות ואיברים מרובים על ידי הידבקות לתאי האנדותל המצפים את microvasculature של venules לאחר נימי 1. בעשותם כך, הצורות בוגרות של הטפיל למנוע אישור הטחול של אריתרוציטים מעוותים הנגועים 2 ולהגביל את הסביבה שלהם ללחץ חמצן נמוך יותר נוח 3. כתוצאה מזה SEQUESTמנה, זה רק טפילי זוויגיים לא בשלה וgametocytes שניתן לאתר בדם היקפי. Cytoadherence ותפיסה של pRBC הבוגרת לקולטנים המארחות הרבים הביעו במיטות כלי הדם מתרחש במחלה קשה ולא מסובכת. עם זאת, כמה שורות של ראיות מצביעות על כך שרק פנוטיפים דבק ספציפיים עשויים להיות קשור עם תוצאות פתולוגיים חמורות של מלריה. אחת דוגמאות לאינטראקציות מארח טפילות ספציפיות כאלה הוכח במבחנה, בו היכולת של מולקולת 1-הידבקות אינטר לתמוך מחייב של pRBC עם מאפייני דבק מסוימים נקשרה להתפתחות של קדחת מוח 4,5. השליה גם הוכרה כאתר של הצטברות pRBC מועדפת בנשים הרות שנדבקו במלריה, עם chondrotin סולפט המרפדים את חלל השליה intervillous כקולט העיקרי 6 הביע בsyncytiotrophoblasts. Rosetting של pRBC לאאריתרוציטים נגועים o באמצעות קולט משלים 1 (CD35) 7,8 גם היו קשורים עם מחלה קשה 9. אחד פ &#39;תאר לאחרונה פנוטיפים cytoadherence falciparum הוא היכולת של pRBC כדי ליצור גושים טסיות בתיווך במבחנה. היווצרות של גושי pRBC כאלה דורשת CD36, גליקופרוטאין הביע על פני השטח של טסיות דם. אחר הקולטן אנושי, gC1qR/HABP1/p32, הביע בתאים מסוגים שונים, כולל תאי אנדותל וטסיות דם, גם הוכח כדי להקל על הידבקות pRBC על טסיות דם כדי ליצור גושי 10. בין אם clumping מתרחש in vivo עדיין לא ברור, אבל זה עשוי להסביר את ההצטברות המשמעותית של טסיות דם המתוארים בmicrovasculature המוח של ילדים שמתו ממלאווי 11 ס&quot;מ. בנוסף, היכולת של בודד תרבויות קליניות לגוש במבחנה היה קשור ישירות לחומרת מחלה ב12 Malawian </sup&gt; וMozambican חולים 13, (אם כי לא בMalian 14). עם כמה היבטים של הפנוטיפ הצטברויות pRBC המאופיין היטב, מחקרים עכשוויים בנושא זה לא הלכו הליך סטנדרטי. זה נושא חשוב, בגלל השונות גבוהות הידועה הגלומות בassay 15. כאן, אנו מציגים שיטה בהצטברויות טסיות דם בתיווך במבחנה של פ falciparum עם תקווה שזה יספק פלטפורמה לשיטה עקבית לקבוצות אחרות, ולהעלות את המודעות למגבלות בחקירת פנוטיפ זה במחקרים עתידיים. שבסיסה במלאווי, אנו מספקים פרוטוקול שתוכנן במיוחד להגדרת משאב מוגבלת, עם היתרון שניתן לבדוק קליני מבודדים טריים שנאסף לפנוטיפ ללא צורך בשימור בהקפאה.

דוגמה של assay גוש טסיות דם בתיווך באמצעות כ -70% שלבים בשלים של פ falciparum לאחר העשרה על ידי הנפקת plasmagel מוצג באיור 2. גוש הוא צבירה של שלושה או יותר אריתרוציטים נגועים. צביעה עם acridine כתום או ethidium רומיד ניתן דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Acridine הכתום הוא spectrally דומה להעמסה, עם מקסימום עירור ב 502 ננומטר ופליטה מרבי ב525 ננומטר (ירוק), ואילו ethidium רומיד יש מקסימום עירור ב 493 ננומטר ופליטה מרבי ב620 ננומטר (בדומה לצבעי rhodamine, אדום ). גושים הם הבחינו בקלות מתחת למיקרוסקופ כמו תחת אור רגיל הם מופיעים כאגרגטים תא ותחת הקרינה כמו כתמים של ירוק או אדום, כאשר מוכתם acridine כתום או צבעי ethidium ברומיד, בהתאמה, כפי שמוצג באיור 2 (30 דקות באמצעות נקודת זמן acridine הכתומה ). הגושים גדולים יותר, גדול יותר המצרפי התא מופיע האו&quot;םאור רגיל דר וגדול יותר את הכתמים של ירוק או אדום מתחת לזרוח לצבעים המתאימים. מאז ה-DNA צבעי היעד ולכן גרעיני כתם, טסיות הדם וRBC נגוע לא מזוהית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשל החוסר של גרעינים. היווצרות אקראית של גושי pRBC קטנים של 4.7 ± 1.6 pRBCs / סבך להתרחש לאחר 30 דקות. גודל הגוש מגביר באופן משמעותי לרמה ממוצעת של 15 גושים pRBC&gt; / לאחר דגירה של 120 דקות עם כמה גושים המכילים מספר רב של pRBC / גוש שלא היה אפשר לסמוך מבחינה ויזואלית. התדירות של הפנוטיפ ההצטברויות מחושבת כמספר תאים הנגועים להציג בגושים / 1000 תאים נגועים, נספר במבחנים כפולים. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> איור 1. זרימת העבודה לclumping ניסוי. R טסיות דםIch ועני פלזמה (א) ו פ תרבות falciparum הכדורית האדומה נגועות (ב &#39;) מוכנה ולאחר מכן בשילוב עבור assay ההצטברויות (C). <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> איור 2. הצטברויות אריתרוציטים נגועים על ידי פ &#39; falciparum מעבדה בודד. גושים שהוקמו על ידי HB3 בשלב 0, 30 דקות ו -120 בפלזמה עשירה בטסיות דם () והיווצרות גוש עניים בטסיות דם עניה פלזמה (ב &#39;). מגבלות assay ישנן מגבלות שמשפיעות במיוחד על תפקוד טסיות דם או להשפיע על תוצאה ורוב אלה כבר הודגשו על ידי ארמן ורואו 15. כאן אנו מזכירים כמה מהבעיות הפוטנציאליות שעשויות להיות נתקלות בdiffereשלבי NT של assay: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמה קלינית מבודדים בתרבות חוץ גופית יכולה להיות אתגר כמו שלפעמים תקופות ארוכות יותר התרבות נדרשות על מנת להשיג מספיק parasitaemia הגבוה כדי לאפשר היווצרות של גושים. עם שיעורי וריאצית antigenic גבוהים בפ falciparum, הפנוטיפ של הדבק המותאם התרבות טפילה עשוי שלא לשקף את אוכלוסיית הטפיל מדביק המקורית לאחר זמנים ממושכים בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת למנוע הלא ספציפי התלכדות בשל אנטיגנים קבוצת דם, תורמי הטסיות צריכים להיות מתאימים לאנטיגן קבוצת הדם עם קליני מבודדים המשמשים באותו assay, או קבוצת אנטיגן דם O משמש תורם האוניברסלי. עם זאת, אנשים עם קבוצת דם O-הם נדירים באתרי אפריקה כמו מלאווי ולכן טסיות נפוצות מתקבלות מתורמי דם O + קבוצה וצריכים להיות מתאים לקבוצת דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת גושים בהכנת שקופית רטובה היא מסורבלת ומאתגר עבור לכידת תמונה כגאמות נמצאות בתנועה מתמדת. בדרך כלל, pRBC להצטבר על הקצוות להחליק את המכסה או שהם נוטים להישאר ביחד ויוצרים גושים &quot;שקר&quot; שיכול להתבלבל בקלות עם גושים אמיתיים. על מנת להקטין את תנועת תא, לאפשר לתאים משקעים למשך 15 דקות בטמפרטורת חדר לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay ההצטברויות הוא זמן רגיש, ולכן מאפשר רק דגימה אחת כדי להיות מנותחת לאדם בכל פעם לדיוק אופטימלי. דגימת נקודות זמן לשני מדגמים שונים יכולה בקלות חופף, וכתוצאה מנקודתי זמן דגימה תואמות בין דגימות אם מדגם טיפול יותר מפעם אחת באותו הזמן. בנסיבות כאלה, תוכנה מתוחכמת כמותי יכולה לחשב גדלים סבכו או לחלופין נוגדנים ספציפיים לתא יכולים לשמש כדי לנתח את ההרכב של הגושים. בעוד טכניקות אלה יכולים מאוד לשפר את המשמעות של הנתונים, במשאבים לעניים הגדרות שבו assay זה עשוי לשמש, בטכניקות ובציוד האמורים לא תהיינה זמינים בקלות. </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting at JoVE.com

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

שיטה זו חוקרת את הפנוטיפ הצטברויות טסיות דם בתיווך של<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; נגועים באריתרוציטים (pRBC) קליני מבודדים. זה מבוצע על ידי בידוד ולשתף דוגרים פלזמה טסיות דם עשיר ובהשעיה של pRBC.

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; נגועים בסביבה מסכנה משאבים

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

a-simple-protocol-for-platelet-mediated-clumping-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

18.6K Views.  Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme. שיטה זו חוקרת את הפנוטיפ הצטברויות טסיות דם בתיווך של Plasmodium falciparum נגועים באריתרוציטים (pRBC) קליני מבודדים. זה מבוצע על ידי בידוד ולשתף דוגרים פלזמה טסיות דם עשיר ובהשעיה של pRBC.

Video: A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ<em&gt; אנופלס</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

הפרדה<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; שלב מאוחר נגועים באמצעי מגנטי

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.