המחברים מבקשים להודות לילדים ולתורמי פלזמה למבוגרים, וצוות בפפואה גינאה החדשה המכון למחקר רפואי. המחברים מבקשים להודות לAmandine B Carmagnac, קתרין ש Nie, דני W וילסון, איבו מולר ודיאנה S הנסן על תרומתם לפיתוח של טכניקה זו, ותודה לצלב האדום האוסטרלי לחבילות דם וסרום. עבודה זו התאפשרה בזכות תמיכה ויקטוריאני ממשלת המדינה תפעולית תשתיות ואוסטרלית הממשלה NHMRC IRIISS. עבודה זו נתמכה על ידי הבריאות הלאומית מועצה למחקר רפואית מעניק # 1031212 ו# 637,406, ומכונים הלאומיים לבריאות מענק # AI089686.

<ol>
	<li>Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-globulin+and+acquired+immunity+to+human+malaria.">Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.</a> Nature. 192, 733-737 (1961).</li><li>Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G., Medicine, P. L. o. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+anti-merozoite+antibodies+and+incidence+of+Plasmodium+falciparum+malaria:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Medicine. 7, (2010).</li><li>Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+protect+humans+against+Plasmodium+falciparum+blood+stages+do+not+on+their+own+inhibit+parasite+growth+and+invasion+in+vitro,+but+act+in+cooperation+with+monocytes.">Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).</li><li>Jafarshad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+mechanism+involved+in+defense+against+malaria+requires+costimulation+of+monocytes+FcgammaRII+and+FcgammaRIII.">A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII.</a> Journal of immunology. 178, 3099-3106 (1950).</li><li>Genton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+blood-stage+malaria+vaccine+reduces+Plasmodium+falciparum+density+and+exerts+selective+pressure+on+parasite+populations+in+a+phase+1-2b+trial+in+Papua+New+Guinea.">A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea.</a> The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).</li><li>Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+MSP3+candidate+vaccine.">Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.</a> The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).</li><li>Llewellyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antibody-dependent+respiratory+burst+activity+from+mouse+neutrophils+on+Plasmodium+yoelii+malaria+challenge+outcome.">Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome.</a> Journal of leukocyte biology. , (2013).</li><li>McIntosh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+human+FcgammaRI+in+mediating+protection+to+malaria.">The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria.</a> PLoS pathogens. 3, 72 (2007).</li><li>Pleass, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antimalarial+antibodies+highlight+the+importance+of+the+antibody+Fc+region+in+mediating+protection.">Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection.</a> Blood. 102, 4424-4430 (2003).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonizing+Antibodies+to+P.+falciparum+Merozoites+Associated+with+Immunity+to+Clinical+Malaria.">Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Joos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Protection+from+Falciparum+Malaria+Correlates+with+Neutrophil+Respiratory+Bursts+Induced+by+Merozoites+Opsonized+with+Human+Serum+Antibodies.">Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonization+and+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+merozoites+measured+by+flow+cytometry.">Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).</li><li>Richards, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Prioritization+of+Merozoite+Antigens+as+Targets+of+Protective+Human+Immunity+to+Plasmodium+falciparum+Malaria+for+Vaccine+and+Biomarker+Development.">Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development.</a> The Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+parasite+exit+from+the+host+erythrocyte:+a+two-step+process+requiring+extraerythrocytic+proteolysis.">Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).</li><li>Boyle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+viable+Plasmodium+falciparum+merozoites+to+define+erythrocyte+invasion+events+and+advance+vaccine+and+drug+development.">Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).</li><li>Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+timing+of+action+of+anti-malarial+drugs+against+Plasmodium+falciparum.">Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).</li><li>Angrisano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Localisation+of+Actin+Filaments+across+Developmental+Stages+of+the+Malaria+Parasite.">Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+dissection+of+coordinated+events+during+malaria+parasite+invasion+of+the+human+erythrocyte.">Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.</a> Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Zuccala, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcompartmentalisation+of+Proteins+in+the+Rhoptries+Correlates+with+Ordered+Events+of+Erythrocyte+Invasion+by+the+Blood+Stage+Malaria+Parasite.">Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Marapana, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+Parasite+Signal+Peptide+Peptidase+is+an+ER-Resident+Protease+Required+for+Growth+but+not+for+Invasion.">Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion.</a> Traffic. 13, 1457-1465 (2012).</li><li>Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture.">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li><li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+immunity+to+malaria.">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites.">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria.">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+Plasmodium+falciparum+for+in+vitro+growth+inhibition+assays.">Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays.</a> Malar J. 9, 152 (2010).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase.">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li><li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms.">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li><li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa.">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li><li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals.">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li><li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line.">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li><li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro.">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li><li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonopsonic+monocyte/macrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes:+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance.">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

כדי למדוד phagocytosis merozoite, בקיאות בשתי טכניקות נדרש: טיהור של merozoites וassay phagocytosis THP-1. השלבים הקריטיים ביותר לשילוב של שתי טכניקות אלה הם: 1) טפילים מסונכרנים היטב; 2) הוספת E64 בזמן הנכון כדי להניב merozoites המוקף קרום; 3) הסרת hemozoin להימנע מצרפים; 4) ספירת merozoite מדויקת על ידי cytometry זרימה; 5) הדילול של פלזמה משמשת; ו6) שמירה על צפיפות תא נמוכה ומספר מעבר של THP-1 תאים. בחינה קפדנית של היבטים המרכזיים אלה תבטיח תגובות phagocytosis חזקות הם נצפו. אמנם, מתואר כאן היא הכנת merozoites להערכת phagocytosis, הטכניקה יכולה להיות מנוצל עבור מגוון רחב של יישומים. ללא קשר למתודולוגיה הזרם למטה, הכנות merozoite אופטימליות תלויות בעיתוי נכון בנוסף E64 על מנת ליצור merozoites. שיטת E64 המתוארת כאן הוכח yIELD merozoites פולשנית לשימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של אירועי פלישה ומבחני רגישות הסמים 15-20. בעוד כדאיות merozoite אינה חיונית לphagocytosis, נדרשת יושרה של מעיל משטח merozoite. לכן שיטת E64 המתוארת כאן מאפשרת merozoites באיכות גבוהה כדי להיות מיוצר להערכת תגובת נוגדנים למעייל פני השטח. כפי שמתואר באיור 1, אם E64 מתווסף מוקדם מדי או מאוחר מדי merozoites הקרום סגור לא נוצרים. מסיבה זו, תרבויות טפיל סינכרוני מאוד נדרשות. כאן, השימוש בטיפולי סורביטול והפרין לחוזקה לסנכרן תרבויות טפיל D10-GFP לחלון של שעה 2 הוא תאר. הפרין יכול לקדם gametocytogenesis במעבדה אחרת מבודדת, ולכן יש להשתמש בזהירות. עשויות לשמש גם שיטות סנכרון אלטרנטיביים כגון אלנין, ובלבד שטפילים מסונכרנים היטב מיוצרים 29. אם E64 מתווסף לטפילי אסינכרוני, אבזר נמוךortion של merozoites מוקף קרום יופק ונותר טפיל שנדבק ב-RBC יהיה גם קרע בדרך כלל או לפתח מורפולוגיה נורמלית. נוכחותם של טפילים שלא התפתחה לmerozoites קרום סגור תגרום לסתימה של המסנן ולהפחית באופן משמעותי את תשואת merozoite מתקבלת. במהלך הסינון של merozoites המוקף בממברנה, hemozoin הוא משוחרר מוקואולות העיכול וקיים כגבישים חופשיים בתמיסה. Hemozoin הוא מעודדי דלקת מאוד וכבר דווח לווסת תגובות מונוציטים וphagocytosis מקרופאג 30, ביום 31. בנוסף לויסות phagocytosis, כפי שמוצג באיור 2, hemozoin יכול ליצור אגרגטים עם merozoites בתמיסה. כTHP-1 תאים יכולים phagocytose אגרגטים אלה, זה יכול להיות confounder עיקרי להחלטה של ​​phagocytosis בתיווך הנוגדנים. לכן, הסרת hemozoin יש צורך בassay זה לאבמורכבות נוספות של OID hemozoin על ביולוגיה תא בלען. בנוסף, אי ספיקת כדי להסיר hemozoin יכולה להיות גם הרסנית בעת השימוש בטכניקה זו כדי ליצור merozoites ללא תשלום עבור יישומים אחרים, במיוחד שבו נדרש כימות merozoite. כפי שמתואר באיור 4, מספר merozoites הוסיף לassay יכול להשפיע על מידת phagocytosis ידי THP-1 תאים. למרות cytometry הזרימה מאפשר ספירה של ריכוז merozoite, pipetting זהיר ולשכפל את הסעיפים של merozoites נחוץ כדי לשפר את הדיוק. זה קריטי במיוחד אם קווי טפיל מרובים הם להיבדק Side-by-צד. זה בעבר כבר הראה כי פלזמה מילדים למחצה חסינים מפני PNG יכולה להיות מדולל באופן משמעותי לפני תגובות ירידת 23. שתואר כאן הוא הדילול האופטימלי של פלזמה (1/120, 000 הדילול סופי של פלזמה) לקבוצה של 5 - ילדי PNG בת 12 שהפיקה את מגוון הגדול של phagocyt. תגובות אוזיסים המתוארות באיור 5 טווח זה אפשר לריבוד של תגובות לארבע קבוצות (0 - 19%, 20-39%, 40-59% ו60 - phagocytosis 79%), ומודלים רגרסיה חשפו כי תגובות opsonizing היו קשורות עם ההגנה מפני מחלה קלינית וצפיפות גבוהה parasitaemia 10 לעוקבה שונה לומדת ייתכן שיהיה צורך להתאים את דילול פלזמה כדי להבטיח phagocytosis ידי THP-1 תאים לא רווי או מתחת לרמה של זיהוי. Cytometry זרימה מאפשרת phagocytosis המהיר וכימות עם דיוק משופר על מיקרוסקופ. פרוטוקול זה הוא תפוקה גבוהה, צלחת מבוססת ואוטומטי רכישת 96 צלחות גם ללמוד חסינות הלחות שנרכשה באופן טבעי. השיטה דורשת צביעת merozoites ברומיד ethidium, יכולים להיות מנוצלים כתמי DNA אלטרנטיביים לעומת זאת, כגון SYBRgreen, DAPI ויוד propidium, כתמי קרום או כתמי חלבון. assay זה יהיה מקובל Primarמונוציטים y או נויטרופילים, ויכולים להיות מותאמים אם תא בלען או הביולוגיה FCR היה של עניין. תאים ראשוניים או THP-1 תאים מובחנים במבחנה עם PMA יכולים לשמש כדי לחקור phagocytosis במלריה ופתוגנים אחרים 12, 32-34. עם זאת שימוש בתאים ראשוניים עשויה להיות מאתגר כפי שהתאים אלה הם חסיד וגם להציג phagocytosis שאינו הנוגדן בתיווך 35. בנוסף, השתנות בטהרה, כדאיות ופונקציונליות כמה מגבלות מפתח לשימוש בתאי phagocytic העיקריים. קולטני Fc המעורב בphagocytosis merozoite יישאר uncharacterized, ולכן באמצעות חסימת נוגדנים לקולטניים Fc ספציפי יכולה להבהיר את תרומתו של כל מועדון כדורגל קולטן לmerozoite phagocytosis. כphagocytosis THP-1 הוא FCR תלוי, זה מאפשר פירוש פשוט של phagocytosis נצפה. assay זה גם משאיל את עצמו לטיפול ספציפי אנטיגן של opsonizing נוגדנים אשר יכולים להיות מושגת על ידי utilizing טפילים עקום החוצה לפני שטח אנטיגנים merozoite, או באמצעות נוגדנים אנושיים מטוהרים זיקה לmerozoite חלבוני פני השטח. יתר על כן, בעומק מחקרים של תגובות ציטוקינים הבאים phagocytosis merozoite חסרים, ויכולים להיות מושגת באמצעות assay זה. שתי טכניקות אלו מהוות התקדמות ניכרת בחקר נוגדני antimerozoite הפונקציונליים. טיהור merozoites באיכות גבוהה יש יתרון לשימוש בmerozoites cryopreserved, או זעירים מניאון מצופה באנטיגנים merozoite. למרות assay זה כבר נעשה שימוש ככלי להערכת חסינות שנרכשה באופן טבעי, זה עשוי להוכיח כלי חשוב להתמודדות עם הרכישה של חסינות בתגובה לחיסון. למרות שזה הוכח לאחרונה כי phagocytosis או merozoites opsonised קשור להגנה מפני מלריה קלינית, לא ניתן להסיק מסקנות ישירות מphagocytosis THP-1 במבחנה לin vivo phagocytoאחות של merozoites כphagocytosis בassay זה מתרחשת תחת תנאים סטטיים ובהעדר מתחרה בתאי דם אדומים. ההתאמות הפוטנציאליות של assay זה עשויות כך לספק כלי תכליתי להבנה נוספת של מלריה וphagocytosis merozoite.

החשיבות של נוגדנים לחסינות למלרית falciparum Plasmodium הוצגה לפני 40 שנה, כאשר אימונוגלובולינים ממבוגרי ההיפר הועברו באופן פסיבי לילדים הסובלים ממלריה חמורה וכתוצאה מכך המחלה להקל 1. כתוצאה מכך, מאמץ ניכר בקש לזהות מטרות של חסינות מלריה מגן, בעיקר באמצעות מדידת טיטר נוגדנים לפפטידים או חלבונים הביעו bacterially ידי ELISA. סרולוגיה מבוססת ELISA הוכיחה גם משתנה מאוד בין לימודים, ואינה מתייחסת לנוגדנים פונקציונלי 2. אנטיגנים מלריה רבים לגרום IgG1 cytophilic ופרופיל נוגדן IgG3, במיוחד פני השטח אנטיגנים merozoite 3. הטיה תת הדבר מצביעה על כך אינטראקציות נוגדן-FC-קולטן (FCR) עם phagocytes חשובות לפונקציות מפעיל של opsonizing נוגדני antimerozoite 4. חיסוני אנטיגן merozoite כמה בפיתוח נועדולעורר פונקציות תא בלען מפעיל 5, 6 ולמרות שראיות משמעותיות לחשיבות של אינטראקציות הנוגדן-FCR במודלים של מלריה מכרסם קיימים 7-9, וכמה מחקרים שנעשה לאחרונה תומכים בחשיבות של נוגדנים פונקציונליים ופונקציות מפעיל תא בלען לחסינות למלריה בבני אדם 10, 11, תחום זה עדיין נחקר גרוע. מחקר לנוגדנים ספציפיים opsonizing merozoite היה מוגבל על ידי שני גורמים; הקושי בבידוד merozoites באיכות טובה; ותגובות phagocytosis משתנים מהתאים ראשוניים. עד לאחרונה, מילויים צנטריפוגה במהירות גבוהה או צפיפות Percoll נוצלו כדי לבודד merozoites מsupernatants התרבות של פקיעת תרבויות schizont. merozoites אלה היו מעשי רק לעתים נדירות, ולעתים קרובות מניפולציות נוספות על ידי צנטריפוגה צפיפות ולשטוף מרובים שלבים 12, או הקפאה 11 לפני השימוש במבחנים. proc אלהesses פוטנציאל לנתק חלבונים רבים הקשורים שולי ממשטח merozoite, חלבונים ידועים להיות מטרות אנטיגני של חסינות מלריה 13. לאחרונה מעכבי פרוטאז ציסטאין טרנס Epoxysuccinyl-L-leucylamido בוטאן (4 guanidino-) (E64) נעשה שימוש כדי ליצור merozoites קיימא. E64 מונע קרע schizont, שהניבו merozoites קרום סגור 14, שיכול להיות מופר על ידי סינון לשחרר merozoites קיימא 15, 16. טכניקה זו תוביל לרזולוציה מרחבית של חלבונים רבים במהלך הפלישה כדורית אדומה 15, 17-19 והבהירה את ההשפעה הספציפית השלב של כמה תרופות נגד מלריה 16, 20. עם זאת, הדור של merozoites קיימא נותר מאתגר מבחינה טכנית. כדי לסייע בהפצה של טכניקה זו ויישום למבחנים תפקודיים של חסינות, פרוטוקול מפורט לטיהור קיימא merozoite והשימוש בם בassay הסטנדרטי הפונקציונלי של נוגדן: שיתוף פעולה סלולארי בopsonization וphagocytosis מתואר כאן. טכניקה זו מדגימה התקדמות משמעותית לעומת מבחני קודמים במבחנה של opsonization merozoite, כגון פרץ נויטרופילים נשימה, תלוי נייד עיכוב הנוגדן (ADCI), ומבחני phagocytosis merozoite חלופיים. מבחני אלה הם גרועים לשחזור עקב וריאציה בתשומות טפיל ואת פעילותם של תאים ראשוניים phagocytic 11, 21. hemozoin לזהם גם עשוי מאוד להשפיע על תפקוד התא בלען 22. Assay phagocytosis merozoite חזק לשעתק דיווח לאחרונה 23 מנצל את שורת תאי promonocytic THP-1 24. זה סוג תא אידיאלי עבור מבחני זרימת cytometry תפוקה גבוהה כפי שהוא לא חסיד ובמיוחד מבצע phagocytosis FC-קולטן בתיווך 25, 26. מורכבות נוספות בזמן investigating phagocytosis הוא שהתואר של phagocytosis תלוי במספר merozoites ביחס לTHP-1 תאים וריכוז בפלזמה. כדי להבטיח שחזור בין ניסויים, צריך להיות מנת merozoites וריכוז מוגדר בשימוש. בשל גודלם הזעיר, לזרום כימות cytometric נדרש. ההליך המתואר כאן מסיר hemozoin ומייצר merozoites קיימא, ומתאר את היישום של merozoites אלה לספירת התזרים cytometric של merozoites אחרי opsonization וphagocytosis. למרות תובעני מבחינה טכנית, הטכניקות המתוארות עשויות להיות שימושיות בהבהרת התרומה של תגובות נוגדנים ספציפיות למשטח merozoite נרכש באופן טבעי וחיסון מושרה חסינות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">THP-1 cell line</td>
			<td style="width:225px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31800-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:225px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercapthoethanol&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td>Use in Fume Hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pen/Strep Solution (100x)</td>
			<td style="width:225px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">HEPES</td>
			<td style="width:225px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">90909C</td>
			<td style="width:373px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hypoxanthine</td>
			<td style="width:225px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Human Serum&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Donation from Autralian Red Cross</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available commercially (i.e. Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06329.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentamycin</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;">61022027</td>
			<td style="width:373px;">Injection Quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin Sodium BP (5000IU/mL)</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>procine origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S-hydrochloride</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-sorbitol</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">&#160;50-70-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E64 Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">98281-100G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4.2H20</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10383.4G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:317px;">Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1.09204.0500</td>
			<td style="width:373px;">1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrodisc Syringe Filters 1.2-&#956;m/32-mm</td>
			<td style="width:225px;">Pall Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">4656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">QuadroMACS Separator (for small column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td>Interchangeable with MidiMACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">VarioMACS Separator (for large columns)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-090-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Column (small magnetic column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">large magnetic column</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:225px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1510433</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:225px;">Invitogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td>
			<td style="width:225px;">BD Biopsciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">FlowJo cytometry analysis software</td>
			<td style="width:225px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays

אנטיגנים merozoite falciparum Plasmodium נמצאים בפיתוח כחיסון למלריה פוטנציאלית. היבט אחד של חסינות מפני מלריה הוא הסר של merozoites החופשי מהדם על ידי תאי phagocytic. עם זאת הערכת היעילות התפקודית של נוגדנים ספציפיים opsonizing merozoite היא מאתגרת בשל זמן מחצית החיים קצרים של merozoites וההשתנות של תאי phagocytic עיקריים. תאר בפירוט במסמך זה שיטה ליצירה merozoites קיימא באמצעות מעכבי פרוטאז E64, וassay של merozoite phagocytosis opsonin תלוי באמצעות שורת התאים פרו monocytic THP-1. E64 מונע קרע schizont תוך מתן אפשרות לפיתוח של merozoites אשר שוחרר על ידי סינון של schizonts טופל. merozoites רומיד Ethidium שכותרתו opsonized עם דגימות פלזמה אנושיות, והוסיף לTHP-1 תאים. Phagocytosis נבחנים על ידי פרוטוקול תפוקה גבוהה סטנדרטי. merozoites קיימא הוא משאב יקר ערך להערכת numerהיבטים מפוקפקים של פ הביולוגיה falciparum, כולל הערכה של תפקוד מערכת החיסון. רמת נוגדנים שנמדדה על ידי assay זה קשור עם חסינות קלינית למלריה באנשים שנחשפו באופן טבעי. Assay יכול להיות גם שימוש להערכת נוגדני חיסון מושרה.

שלב ההבשלה של טפילים לפני טיפול E64 הוא קריטי ליצירה merozoites מוקף קרום. איור 1Ai מציג את שלב ההבשלה המתאים של schizonts להוספת E64. הטפילים צריכים להיות גדולים וכמעט למלא את תא הדם האדום. מראה מנומר של כתם Giemsa מציין merogony החל, ויש להוסיף E64 להניב merozoites מוקף קרום (איור 1Aii). אם E64 הוא הוסיף קודם לכן לtrophozoite טפילי במה, merozoites המוקף הקרום לא נוצרים גם לאחר 12 שעות של E64. במקום טפילים לקחת על מורפולוגיה חריגה כגון הגדלה של vacuole העיכול (איור 1Bi ו1Bii), וmerozoites לא נוצרים. אם E64 הוא הוסיף מאוחר יותר לschizonts, merozoites מוקף קרום לא נוצרים כקרע schizont חסר עכבות (איור 1Ci ו1Cii). רמה גבוהה של תיאום טפיל נדרש, אחרחכם טווח של כל שלוש התוצאות שתוארו יהיה לראות לאחר טיפול E64. הסרת hemozoin היא עוד צעד קריטי עבור merozoites לטיהור. אם merozoites אינו מטוהרים מhemozoin אז אשכולות merozoite-hemozoin צורה שלא ניתן וחילצה ידי pipetting. אגרגטים אלה לרוץ על cytometer כאירועים בודדים, אם כי עם מאפיינים צופה פני פיזור ותופעות פיזור שונים מmerozoites אחת, וכתוצאה מספירת merozoite לא מדויקת על ידי cytometry זרימה (איור 2 א). כTHP-1 תאים יכולים גם phagocytose hemozoin, יכולים גם להיות phagocytosed אשכולות merozoite-hemozoin אלה (איור 2). אגרגטים אלה ניאון EtBr מאוד כפי שהם מכילים merozoites מרובה. Phagocytosis של תוצאות אגרגטים במקבילים פרופיל הקרינה EtBr THP-1 לזה שנצפה עבור phagocytosis של merozoites הבודד מרובה. לפיכך, אם hemozoin לא הוסר, הקרינה EtBr של THP-1 תאים תהיה overestimate של פוטנציאל opsonizing לפלזמה הנבדקת. Hemozoin הוא דיווח גם לשנות את תפקוד תא בלען באופן משמעותי. merozoites GFP החיובי הם מוכתמים דלפק עם EtBr להגדיל את ההדמיה של merozoites phagocytosed ידי THP-1 תאים. שימוש בתנאים שתוארו בפרוטוקול זה, כל merozoites GFP החיובי הם counterstained עם EtBr שבו יש עוצמת הקרינה בהירה (איור 3 א). הערכת Phagocytosis ידי הקרינה EtBr מאפשרת רזולוציה מעולה של phagocytosis merozoite מאשר הקרינה ה-GFP (איור 3 ב). מספר merozoites הוסיף לassay יהיה לווסת את כמות phagocytosis נצפתה. מסיבה זו, ספירה מדויקת על ידי cytometry זרימה היא קריטית. הגדלת יחס של merozoites: THP-1 תגרום לדבקות המוגברת של merozoites לTHP-1 תאים בהעדר הפלזמה (איור 4 א). הגדלת merozoite: THP-1 יחסים גם תוצאות ph המוגברתגובות agocytosis כאשר merozoites הם opsonized (איור 4). Merozoite 4:1: יחס THP-1 מומלץ לתגובות phagocytic חזקות. באמצעות יחס זה, והדילול של פלזמה מצויינים, assay זה הוא מסוגל לפתור רמות נמוכות, בינוניות וגבוהות של נוגדני opsonizing. בין 0 ל 78 תגובות phagocytosis אחוזים נצפו באמצעות דגימות פלזמה PNG ומצבים האחרים שתוארו. תגובות כאלה מוצגות לאחרונה מקשרים עם חסינות קלינית שנרכשה באופן טבעי למלריה 10. איור 5 מראה דוגמאות של 4 הרבעונים של תגובות phagocytosis מאנשים PNG. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. עיתוי בנוסף E64 הוא קריטי ליצירה merozoites המוקף בממברנה. () Maturatio המתאים. שלב n של טפילי i) לפני טיפול E64, וii) merozoites מוקף קרום הופק לאחר 6 שעות של טיפול E64 (merozoites הסגור ב &#39;) קרום לא נוצרים אם E64 מתווסף לטפילים לא בשלה; i) trophozoites בשלב מאוחר, וii) לאחר 12 שעות של E64 (C) schizont קרע לא עכבות אם E64 מתווסף מפולחים מאוחר schizonts.; i) schizonts שלב המאוחר, וii) לאחר 6 שעות של E64. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. הסרת Hemozoin היא קריטית כדי ליצור השעיה merozoite תא בודד. אגרגטים Merozoite-hemozoin הטופס הבא סינון של merozoites המוקף הקרום, אלא אם כן hemozoin מופרד מגנטי מmerozoites. () חלקות צופה פני פיזור וצד פיזור של merozoites עם hemozoin הוסרוhemozoin עודפים. ניתן phagocytosed אגרגטים (ב &#39;) Hemozoin-merozoite ידי THP-1 תאים. שקופיות ציטומגלווירוס ספין מוכתמות הבדל-מהיר של תאי THP-1 הודגרו עם הפלזמה PNG opsonized הכנות merozoite עם או בלי hemozoin. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. מכתים Ethidium רומיד מאפשר לרזולוציה מעולה של phagocytosis merozoite. Merozoites מטוהר D10-GFP הם counterstained עם EtBr כדי לשפר את עוצמת הקרינה. () Cytometry זרימת histrogram של merozoites מטוהר עם gating על merozoites GFP החיובי, וכתם נקודה מראה EtBr הקרינה בתוך אוכלוסיית ה-GFP מגודרת זה חיובי. (ב) פיזור קדימה לעומת GFP ופיזור קדימה לעומת EtBr של THP-1 תאים הבאים phagocytosis של merozoites ניאון הכפול GFP וEtBr. שערים היו ד<html> rawn המבוסס על תאי THP-1 עם merozoites ואין שליטת פלזמה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 merozoite:. יחס THP-1 משפיע על מידת phagocytosis נצפתה. (א) חמש merozoite: THP-1 יחסים מתוארים; 50:1, 20:01, 10:01, 4:1, 1:1. שליטה רק תאים מצביעה על הקרינה רקע עקב THP-1 תאים. הקרינה EtBr THP-1 עבור כל יחס מצויינים לmerozoites opsonized עם בריכה של הפלזמה PNG או עם פלזמה אוסטרלית nonimmune ממוצע הקרינה בעוצמה של THP-1 תאים לmerozoite שונה (ב &#39;):. THP-1 יחסים, וopsonization עם בריכה של הפלזמה PNG או פלזמה האוסטרלית nonimmune (ממוצע + SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ove_content &quot;עבור: together.within-לשמור על עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. מגוון גדול של נוגדני opsonizing ניתן למדוד. Merozoites היה opsonized עם פלזמה מאנשים PNG וטופחו עם THP-1 תאים. ארבע תגובות phagocytosis נציג מוצגות. גייטס היו סגור המבוססת על תאי THP-1 עם merozoites ואין שליטת פלזמה, ומספרים מצביעים phagocytosis% לאחר הפחתה של תאי THP-1 עם שליטת פלזמה שאינה מחוסנת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays at JoVE.com

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

מדידת פונקצית נוגדן היא מפתח להבנה חסינות למלרית falciparum Plasmodium. שיטה זו מתארת ​​את הטיהור של merozoites קיימא, ומדידה של phagocytosis opsonization תלוי על ידי cytometry זרימה.

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

high-yield-purification-plasmodium-falciparum-merozoites-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

22.8K Views.  Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.  מדידת פונקצית נוגדן היא מפתח להבנה חסינות למלרית falciparum Plasmodium. שיטה זו מתארת ​​את הטיהור של merozoites קיימא, ומדידה של phagocytosis opsonization תלוי על ידי cytometry זרימה. 

Video: High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

מבחר Plasmodium falciparum טפילים עבור Cytoadhesion לתאי המוח האנושי האנדותל

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; נגועים בסביבה מסכנה משאבים

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

הפרדה<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; שלב מאוחר נגועים באמצעי מגנטי

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

מבחני Electrochemiluminescence עבור האדם איון עצמיים

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

טיהור של תשואה גבוהה לחילוץ ההכנות הרחק וירוס

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...