עבודה זו נתמכה על ידי NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) ומענקי NIH AR052785 וAR046786 (AEO ווו-MW).

<ol>
	<li>Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIM+and+cortactin+antagonism+regulates+ciliogenesis+and+hedgehog+signaling.">MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling.</a> Dev Cell. 19, 270-283 (2010).</li><li>Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+dermal+papilla+cells+in+hydrogels+reveals+intrinsic+differences+between+Sox2-positive+and+-negative+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).</li><li>Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+procedure+to+reconstitute+hair-producing+skin.">A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).</li><li>Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+mouse+models+for+hair+follicle+reconstitution.">Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution.</a> Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).</li><li>Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+regulation+of+murine+hair+growth:+insights+from+grafting+defined+cell+populations+onto+nude+mice.">In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice.</a> J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li><li>Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+mouse+vibrissal+dermal+papilla+cells+and+de+novo+hair+follicle+induction.">Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction.</a> Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).</li><li>Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+dermal+papilla+cells+is+required+for+their+hair+follicle-inductive+properties.">BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties.</a> Genes Dev. 22, 543-557 (2008).</li><li>Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-lox-regulated+conditional+RNA+interference+from+transgenes.">Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).</li><li>Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+hair+follicle+development+in+vivo:+determination+of+follicle+formation,+hair+growth,+and+hair+quality+by+dermal+cells.">Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).</li><li>Woo, W. -. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+maintains+dermal+papilla+identity+and+hair+morphogenesis+via+a+Noggin-Shh+regulatory+loop.">Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop.</a> Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).</li><li>Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+dermal+papilla+cells+into+inductive+spheroidal+microtissues+on+poly(ethylene-co-vinyl+alcohol)+membranes+for+hair+follicle+regeneration.">Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration.</a> Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).</li><li>Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+from+dissociated+cells:+generation+of+mature+cycling+hair+follicles+from+skin-derived+cells.">Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells.</a> J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מבחני כינון מחדש שיער לספק מודל התחדשות איבר ייחודי לבחינת מנגנון היווצרות זקיק שיער דה נובו. כאן, אנו מתארים assay שיער קאמרי שונה שימושי לקביעת תפקוד גן במבנה זקיק שיער. הבדיקה שלנו מבוססת על הבדיקה דיווחה הקאמרית שיער הכינון מחדש 5, 6,11, שאנו שונים כדי להציג את טכניקת ביטוי lentiviral להשיג ביטוי יתר מציאת גן או באחד משני סוגי תאי עור או האפידרמיס. הבדיקה שלנו מספקת חלופה מהירה ליצירת נוקאאוט הגנטי רקמות ספציפיות. בדיקה זו מאפשרת לנו להפגין תפקוד גן במבנה זקיק שיער קטן כמו 3 שבועות מהדבקת תאים ראשוניים עם lentivirus לאוסף שתל. הבדיקה שלנו ניתן להאריך להתייחס אינטראקציות גנטיות באמצעות שילוב shRNA / משלוח cDNA ידי lentivirus לסוג תא אחד 12, כמו גם מאפשר בדיקה של איתות בין תאי העור האופייני ואפידרמיסes. בדיקת השיער שלנו היא מתאימה ביותר לאיתור רווח או פסד--of-פונקצית פנוטיפים חזקים בהתחדשות זקיקי שיער, ואילו פגמים עדינים קשים יותר לצפות. אנחנו הוכחנו הצלחת תפקוד גן מסוים עור של כמה גנים באמצעות assay התחדשות השיער שלנו 1,12. בהתבסס על סמן GFP שיתוף הביע מוקטור lentivirus להביע shRNA 10, הראינו כי shRNA להביע תורם בתאי עור התמיד בשתלי השיער מחדש. תאי ה-GFP חיוביים נכחו בפטמית עורי (DP) של זקיקי שיער ההתחדשות (איור 3). התאים העקורים סבירים כללו רמות שונות של מציאת גן כתאים הביעו רמות שונות של GFP, ובכך הפנוטיפ זקיק השיער שנצפה היה ממגוון הגנטי hypomorph לnull. שיפור אחד assay זה יהיה להקים בחירה מהירה ויעילה לתאים הגבוהים shRNA להביע לפני graftinז כגון שימוש FACS לטהר תאים חזקים GFP להביע-. אלטרנטיבה היא להחליף תאי נוקאאוט מוטציה או מותנים בבדיקת 9 זה. מצד השני, מערכת תרבות שיכול לשמר את תפקוד תא DP היא מאוד שימושית כעצמת DP היא אבדה בהדרגה את תאי עורי פעם אחת העיקריים הם passaged. מערכות תרבות אפשריות כוללות שימוש בחומרים ביולוגיים הנגזרים מנישה מלאכותית או תרבויות צבירה 2,7,8,13. שיפור נוסף יהיה ליצור שיטה אמינה אפידרמיס תא קפוא עם שיעור החלמה גבוהה תא כמו זה יהיה להפחית את השימוש בסט השני של גורי עכברים (צעד 7) כדי לייצר הקרטינוציטים טריים באובדן או ספציפי לעור רווח-of- מחקרי פונקציות. בדיקת שיער תא זה מייצרת צפיפות ואיכות דומה לעור עכבר רגיל זקיק שיער, למרות שצמיחת שיער היא מעט פחות מסונכרנת וכיוון זקיק הוא יותר אקראי. כמה מגבלות של הבדיקה הגנטית התחדשות שיער includדואר הדרישה של כמות גדולה של lentivirus ומספרים סלולריים, וזה מאוד עבודה אינטנסיבית במונחים של שיטות ניתוחיות בהשוואה לצורות אחרות של מבחני כינון מחדש שיער כגון תיקון ומבחני דש 3,4,14. עם זאת, האיכות של זקיקי שיער וצייר זמן כדי לזהות צמיחת שיער היא מעולה למבחנים אחרים 4. assay התחדשות השיער הממוקד שלנו מספק לוויה מהירה ונוחה למודלים גנטיים קיימים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> CNT-07 </td><td> התא N Tec </td><td> CNT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> מוסף AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> רוש </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, סוג 1 </td><td> סיגמא </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> סיגמא </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> צלחת תרבית רקמה </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> מספריים מבתרים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> מצבטים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 10-275 </td><td> מעוקל </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex אספקה </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> אין גודל. 10 </td></tr><tr><td> Stainer התא מיקרומטר 70 </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> צינור צנטריפוגה חרוטים 15 מ&quot;ל </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> מטליות אלכוהול </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> מחט מד 23 </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> חומר סיכת עין </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> מטליות Providone-lodine </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> הסיליקון צ&#39;יימברס </td><td> רנר GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> תפרים </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> תחבושת גמישה </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> רוטב ללא חסיד </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> חומרים </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> שטוף את הפתרון PBS 500 מיקרוגרם / המ&quot;ל פניצילין / סטרפטומיצין 12.5 מיקרוגרם / המ&quot;ל Fungizone 100 מיקרוגרם / המ&quot;ל Gentamycin פתרון Dispase HBSS 2.5 מ&quot;ג / המ&quot;ל הסופי Dispase 100 מיקרוגרם / המ&quot;ל Gentamycin תקשורת המנטרלת HBSS 15% (v / v) FBS פתרון collagenase 0.25% (w / v) collagenase, סוג 1 ontent &quot;&gt; 100 מיקרוגרם / המ&quot;ל פניצילין / סטרפטומיצין 2.5 מיקרוגרם / המ&quot;ל Fungizone 50 מיקרוגרם / המ&quot;ל Gentamycin פתרון Polybrene HBSS 8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(w / v) Polybrene </td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

המורפוגנזה שיער זקיק, תהליך מורכב הדורש אינטראקציה בין הקרטינוציטים epithelia נגזרות וmesenchyme הבסיסי, היא מערכת מודל אטרקטיבית ללמוד פיתוח איברים ורקמות איתות ספציפית. למרות התפתחות זקיק שיער היא ניתוח גנטי צייתן, מהיר ושחזור של גורמים חיוניים לתהליך זה עדיין מהווה אתגר. כאן אנו מתארים הליך כדי להפיק ביטוי יתר ממוקד או מציאת shRNA בתיווך של גורמים באמצעות lentivirus באופן רקמות ספציפי. שימוש בגרסה שונה של מודל התחדשות שיער 5, 6, 11, אנחנו יכולים להשיג רווח או חזק ניתוח אובדן-of-פונקציה בהקרטינוציטים עכבר עיקריים או תאי עור כדי להקל על מחקר של מסלולי אפיתל-mesenchymal איתות שמובילים להמורפוגנזה זקיק שיער . אנו מתארים כיצד לבודד הקרטינוציטים טריים עיקריים עכברים ותאי עור, המכילים תאי פטמית עור ובין קודמיהם, לספק lentivirus contaiנינג או shRNA או cDNA לאחת מאוכלוסיות התאים, ולשלב את התאים לייצר זקיקי שיער שנוצרו באופן מלא על גבם של עכברים בעירום. גישה זו מאפשרת ניתוח של גורמי רקמה ספציפיות הנדרשים ליצירת זקיקי שיער בתוך שלושה שבועות ומספקת לוויה מהירה ונוחה למודלים גנטיים קיימים.

באיור 1 אנו מראים את התוצאה של מציאת shRNA lentiviral עור ספציפית של יתפוגג (SMO), רכיב איתות ששש קריטי, בשתל שיער רגנרטיבית שבועות 3 ישן. שתלי שליטה באמצעות וקטור lentiviral לבד להראות צמיחת שיער חזקה (איור 1 א). לעומת זאת, מציאת עור ספציפי של תוצאות SMO באובדן צמיחת שיער (1B איור). Hematoxylin וeosin כתם מתארים את השלב של זקיקי שיער בשליטה ובתנאי ניסוי (האיור 1C, ד). הפנוטיפ צמיחת השיער מטיפולים דומים יכול להיות משתנה בין ניסויים, כולל שליטה החיובית עם דלקת לבד וקטור lentiviral. שתלי בקרה חיוביים לכן תמיד צריכים להיות כלולים בכל ניסוי כהפניה כ30% משתלים יכולים להיכשל כתוצאה מצלקות או קובץ מצורף שלם של שתלים. במקרה של בדיקת אינטראקציה בין שני גורמים כגון overexpressing cDNA של גורם אחד מחדשמציאת shRNA בתיווך scue של גורם נוסף, יש תמיד כוללת שתלים בלבד למציאת מניפסט תוצאת אובדן של תפקוד בכל ניסוי. זה יספק טווח נחוץ כדי לקבוע כיצד גן מסוים perturbs מסלול זקיק שיער התחדשות ואיך שני גני האינטראקציה. הסרה של החדר (איור 2 א) חייב להיעשות בזהירות. השתל חדש שנוצר צריך להיות מעט אטום עם משטח עמום (איור 2 ב &#39;). השתל עלול להידבק לקנה, אז הרים בעדינות צד אחד הוא חשוב לוודא השתל נשאר מחובר למיטת הפצע. השתל הוא די יציב לאחר שלושה ימים וצריך להציג את הקושי בעת הסרת האיפור. צמיחת שיער חזקה צריכה להיות שנצפתה לאחר שלושה שבועות (האיור 2C). השמטה או mDCs או KCs תגרום אתר פצע החלים ללא כל שיער (האיור 2D) 11. מוות של תאים או אובדן תא באחדסוגי תאים גם תוצאות לא שיער, בניגוד להתחדשות שיער מופחתת במציאת עור-SMO כפי שמוצג בתרשים 1B. כדי להבטיח assay מוצלח, זה קריטי כדי להשיג יותר מ 90% זיהום נגיפי של תאים עם ביטוי יתר מתאים או יעיל מציאה לפני ההשתלה. בשל אילוצי הזמן של הליך ההשתלה, אנו ממליצים יעילות זיהום ויראלי צרות ירי לפני התחלת ניסוי השתלה, ותמיד לשמור חלק קטן מתאים ביום של השתלת הליך כדי לוודא פסד או רווח, לביטוי. כייל lentiviral ישתנה בהתאם לשימוש, ולבנות צריך להיקבע לפני זיהום כדי להשיג יעילות 90-100%. אנו מנטרים את יעילות זיהום ויראלי עם GFP coexpressed מוקטור lentiviral. אנחנו לבצע באופן שגרתי כתם מערבי PCR ו / או כמותית כדי לקבוע את היקף מציאה או ביטוי יתר. ניצול וקטורים כפולי ביטוי עם תגי ניאון לתייגתאים נגועים באופן ויראלי מספקים דרך לדווח perdurance של אות ומספר התאים להביע מבנינו בשתלים בוגרים. אנו משתמשים GFP מונע על ידי אמרגן CMV מוקטור lentiviral pSicoR-CMV-GFP 10 בשילוב עם SMO shRNA. באיור 3, אנו מראים שתל ישן 3-שבוע עור ספציפי שבו GFP-הביע lentivirally בפטמית עור של זקיק שערה יציגה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> איור 1. ניתוח היסטולוגית של צמיחת זקיקי שיער. () צפה בשתל התחדשות שיער שליטה עם תאי עור נגוע בוקטור lentiviral ריק והקרטינוציטים שלא טופלו. (ב) מציאה תתפוגג באמצעות shRNA lentiviral בתאי עור בשילוב עם תוצאות הקרטינוציטים לא טופלו בהפסד של זקיקי שיער. (ג) Hematoxylin ומכתים eosin מראים f שיער anagen<html> ollicles בשתלי בקרה להאריך לתוך הדרמיס ו( ד &#39;) זקיקי שיער מציאה יתפוגגו יישארו ננסיים וברובו נעדר. כל התמונות הן שלושה שבועות לאחר ההשתלה. סרגל קנה מידה מציין 100 מיקרומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> איור 2. השתלת תאים ראשוניים. () עכבר נו / נו עם תאים תפר קאמריים דיור עיקריים עור והקרטינוציטים. (ב &#39;) להסרה של תאי עור שנוצרה חושפת הוא עמום ומעורפל בדמות חדשה. (C) שערות גדלו באופן מלא על שתל באמצעות פרועות הקלד תאים ראשוניים עור והקרטינוציטים בשלושה שבועות לאחר ההשתלה. (ד &#39;) תוספת של תאי עור ראשוניים ללא הקרטינוציטים מובילה לשום שיער לאחר שלושה שבועות. תוצאות דומות נצפו עם תוספת של הקרטינוציטים ראשוניים ללא תאי עור. עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig3.jpg" /> איור 3. תחזוקה של ביטוי של GFP בגבשושיות עור. תמונות confocal של גבשושיות עור משתל 3-בן שבוע מחדש. GFP לידי ביטוי באוכלוסיית תאי העור מוקטור lentiviral וזוהה בפטמית עורי (ירוק). Versican (אדום) תוחם את הגבשושיות וגרעיני עורי היו תווית עם Hoechst (כחול). GFP ההערה מתבטא במיוחד בתאי עור, אך לא בקרטינוציטים שמסביב. סרגל קנה מידה מציין 20 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration at JoVE.com

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

ניתוח רקמות ספציפית של מודל התחדשות זקיקי שיער באמצעות lentivirus לתווך רווח או פסד--of-פונקציה.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  Stanford University School of Medicine. ניתוח רקמות ספציפית של מודל התחדשות זקיקי שיער באמצעות lentivirus לתווך רווח או פסד--of-פונקציה.

Video: Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של Planarian Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

הפקה וניתוח של קורטיזול מאדם וקוף השיער

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

טכניקה חדשה לניתוח כמותי של נשירת שיער בעכברים באמצעות ניתוח גווני אפור

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...