אנו מכירים בתמיכת מועצת המלגות הסינית (CSC) ל- J.Z. ולמרכז הגנומיקה לסרטן בהולנד (CGC). NL) לפ.ט.ד.

1. ניתוח של זרחון SMAD2 הנגרמת על ידי TGF-β באמצעות סופג מערבי
הערה: תאי MCF10A-Ras של השד האנושי הפרה-מיניים שימשו כדוגמה לחקירת תגובות איתות TGF-β33. באופן עקרוני, השיטות המתוארות להלן חלות גם על קווי תאים אחרים בעלי תגובה β TGF.
<ol><li>תרבות קו תא אפיתל השד MCF10A-ראס ב 37 °C (77 °F) במדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)/F12 המכיל L-גלוטמין עם 5% סרום סוס, 20 ng/mL גורם גדילה אפידרמיס (EGF), 10 מ"ג / מ"ל אינסולין, 100 ng / mL כולרה enterotoxin, 0.5 מ"ג / מ"ל הידרוקורטיזון, ו 1:100 פניצילין-סטרפטומיצין (עט-סטרפטוצין).</li>
	<li>טריפסינייז MCF10A-ראס תאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA במשך 1 דקה ולספור תאים קיימא באמצעות מונה התא.</li>
	<li>תאי זרע לתוך צלחות 6-באר בצפיפות של 5×105 תאים / גם.</li>
	<li>לאחר צמיחה של לילה, לטפל בתאים עם או TGF-β (5 ng/mL) או חיץ ליגנד (4 mM HCl, 0.1% שומן ללא חומצת שומן סרום אלבומין (BSA)) במשך 1 שעה, ולאחר מכן להסיר מדיום תרבות בעדינות לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS).</li>
	<li>תאים מגניבים בצלחות 6 בארות על קרח ומוסיפים 150 μL של מבחני משקעים חיסוניים רדיו (RIPA) מאגר תמוגה (150 mM NaCl, 0.1% טריטון X-100, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% SDS, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8.0, וקוקטייל מעכב פרוטאז מיני הוסיף טרי). אפשר לתמוגה להמשיך על הקרח במשך 10 דקות.</li>
	<li>לגרד תאים חסידים את המנה באמצעות מגרד תא פלסטיק, ואז בעדינות להעביר את המתלה התא לתוך צינור microcentrifuge precooled.</li>
	<li>צנטריפוגה התא lysate במשך 10 דקות ב 150 כוח צנטריפוגלי (x g) ב 4 מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatant לצינור טרי 1.5 מ"ל microcentrifuge.</li>
	<li>למדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת מבחני חלבון תואמת חומר ניקוי (DC).</li>
	<li>טען 30 מיקרוגרם חלבון מכל דגימה על 10% נתרן דודקיל סולפט פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'ל ולהפעיל את הג'ל במתח של 100 V במשך 1.5-2 שעות.</li>
	<li>מעבירים את החלבונים מהג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלוריד (PVDF) של 45 מיקרומטר במתח של 110 וולט למשך 1-1.5 שעות.</li>
	<li>מעבירים את קרום PVDF למיכל מתאים עם צד החלבון (הצד שפונה לג'ל) למעלה, ושוטף בקצרה את הקרום במים מזוקקים.</li>
	<li>להשליך את המים, להוסיף פתרון פונסאו S, ולשים את הממברנה על פלטפורמת נדנדה במשך 1-2 דקות.</li>
	<li>דה כתם הממברנה עם מים מזוקקים על ידי שטיפה מהירה ולאחר מכן לשטוף אותו במשך 1 דקה.</li>
	<li>לאחר מכן, שים את קרום PVDF על קופסת אור, וצלם תמונה כדי לבדוק אם יש עומסי חלבון שווים.</li>
	<li>לשטוף את הממברנה עם מלוחים טריס-אגירה עם Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, ו 0.1% Tween 20) עד שאין כתמים גלויים.</li>
	<li>שים את הממברנה בחסימת חיץ (5% חלב רזה בתמיסת TBST) ודגירה אותו במשך שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את הממברנה פעמיים עם TBST.</li>
	<li>דגירה הממברנה עם נוגדנים ראשוניים נגד זרחן-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, תוצרת בית 34),סה"כ SMAD2/3 1:1000 ו glyceraldehyde 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH; 1:1000), לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף את הממברנה פעמיים עם TBST ולהדגיר את הממברנה עם נוגדן משני נגד ארנב או עכבר (1:5000) במשך 2 שעות.</li>
	<li>דגירה קרום PVDF עם מצע ECL המערבי במשך 30 שניות, ולזהות את האות באמצעות מערכת הדמיה.</li>
	<li>חזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים כדי להשיג משולשים ביולוגיים.</li>
</ol>2. ניתוח של תגובות תמלול תלויות SMAD3 הנגרמות על ידי TGF-β
<ol><li>בצע את ה-CAGA12תלוי SMAD3/SMAD4 -לוציפראז שעתוק כתב assay.<ol>
<li>תרבות ותאי MCF10A-Ras עם ניסיון כמתואר בשלב 1. תאי זרע לתוך צלחות 24-באר ב 5×104 תאים / באר ולאפשר לתאים לדבוק בן לילה.</li>
		<li>יום לאחר הזריעה, cotransfect התאים בכל באר עם 100 ng של TGF-β / SMAD3-בלתי ניתן להקרבה (CAGA)12 כתב שעתוק לוציפראז לבנות35 ו 80 ng של מבנה ביטוי β-גלקטוזידאז באמצעות פוליאתילנימין (PEI). ההעתקה של β-גלקטוזידאז משמשת לנרמול הבדלים ביעילות התת-הדבקה בין בארות שונות. להקים כל קבוצת ניסוי משולשת.</li>
		<li>לאחר 24 שעות של דגירה, תאים גוועים ברעב עם גלוקוז גבוה DMEM ללא סרום, 6 שעות מאוחר יותר, להוסיף TGF-β (5 ng/mL) או חיץ ליגנד (4 mM HCl, 0.1% BSA) כבקרת רכב לתאים.</li>
		<li>לאחר עוד 24 שעות של דגירה, לשטוף תאים פעמיים עם PBS מראש.</li>
		<li>מוסיפים 120 μL / גם 1× מאגר תמוגה בעדינות לנער את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.</li>
		<li>העבר 30 μL של lysate לכל באר של microplate 96-well לבן assay כדי למדוד פעילות לוציפראז באמצעות לומינומטר.</li>
		<li>העבר 50 μL של lysate לכל באר של צלחת שקופה 96-היטב כדי למדוד פעילות β-גלקטוזידאז.</li>
		<li>לנרמל את פעילות לוציפראז לפעילות β-גלקטוזידאז ולחזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים כדי להשיג משולשים ביולוגיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנתח את הביטוי של TGF-β גנים היעד באמצעות תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת פולימראז (qRT-PCR).<ol>
<li>תרבות ותאי MCF10A-Ras עם ניסיון כמתואר בשלב 1. תאי זרע לתוך צלחות 6-באר ב 5×105 תאים / באר ולאפשר לתאים לדבוק בן לילה.</li>
		<li>לטפל בתאים עם TGF-β (5 ng/mL) או מאגר ליגנד (4 mM HCl, 0.1% BSA) במשך 6 שעות, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS.</li>
		<li>לבודד את ה-RNA הכולל באמצעות ערכת בידוד RNA.</li>
		<li>לקבוע את ריכוז RNA עם NanoDrop ולבצע סינתזת cDNA עם 1 מיקרוגרם של RNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA גדיל הראשון.</li>
		<li>השתמש במערכת זיהוי PCR בזמן אמת כדי לבצע כמותי בזמן אמת PCR (qRT-PCR) עם cDNA מדולל פי עשרה בתערובת תגובת μL 10 הכוללת פריימרים אנושיים ספציפיים קדימה והפוך עבור GAPDH (לנורמליזציה), SERPINE1 (קידוד חלבון PAI-1, גן יעד TGF-β/SMAD), SMAD7 (גן יעד TGF-β/SMAD) ו- qPCR מאסטר מיקס. להקים כל קבוצת ניסוי משולשת. הערה: רצפי פריימר המשמשים לזיהוי גנים אנושיים ממוקדים ב qRT-PCR מפורטים בטבלה 1.</li>
		<li>השתמש בתנאי התגובה הבאים qPCR: אתחול, 95 °C (69 °F) במשך 3 דקות; דנטורציה, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות; חישול, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; והרחבה, 80 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות; דנטורציה, חישול והרחבה חוזרים על עצמם 40 פעמים.</li>
		<li>חזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים כדי להשיג משולשים ביולוגיים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ניתוח של EMT הנגרמת על ידי TGF-β
<ol><li>לנתח את הביטוי של סמני EMT ברמת החלבון באמצעות סופג מערבי. הערה: הניתוח של EMT הנגרמת על ידי TGF-β מוצג באמצעות תאי אפיתל NMuMG העכבר כדוגמה36,37.<ol>
<li>תרבות NMuMG תאים ב 37 °C (70 °F) במדיום גלוקוז DMEM גבוה בתוספת 10% סרום שור עוברי ו 1:100 עט סטרפטוקוקוס. השתמש בשיטות המתוארות בשלב 1 לבידוד וזיהוי חלבונים. הערה: הנוגדנים הבאים משמשים בניסוי זה: E-cadherin, 1:1000; נ-קדרין, 1:1000; חילזון, 1:1000; שבלול, 1:1000; טובולין, 1:1000(איור 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>נתח את הביטוי של סמני EMT ברמת mRNA באמצעות PCR כמותי בזמן אמת כמתואר בשלב 2.2. הערה: כל פריימרים לעכברים המשמשים עבור qRT-PCR, כולל CDH1 (קידוד חלבון E-cadherin), SNAILו- ZEB2 (איור 3) מפורטים בטבלה 1.</li>
	<li>לנתח את תהליך EMT באמצעות שפעת חיסונית עקיפה וכתם פלואורסצנטי ישיר.<ol>
<li>כתמי כשל חיסוני עקיף של E-cadherin<ol>
<li>מניחים כיסויי זכוכית מרובעים סטריליים בגודל 18 מ"מ בצלחות של 6 בארות (כיסוי אחד לבאר).</li>
			<li>זרע 1×105 תאי NMuMG עם 2 מ"ל של DMEM מלא לכל צלחת 6 באר ולאפשר לתאים לדבוק בן לילה.</li>
			<li>מעבירים בעדינות את הכיסויים עם תאים דבקים לצלחת חדשה של 6 בארות ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום תרבות לבארות.</li>
			<li>לטפל בתאים עם TGF-β (5 ng/mL) או מאגר ליגנד (4 mM HCl, 0.1% BSA) במשך 2 ימים.</li>
			<li>הסר את מדיום התרבות בעדינות לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS מראש.</li>
			<li>לתקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde ודגרת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS.</li>
			<li>לחלחל לתאים הקבועים עם 0.1% טריטון X-100 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.</li>
			<li>חסום את התאים עם 5% BSA ב PBS במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.</li>
			<li>הוסף את הנוגדן העיקרי נגד E-cadherin (מדולל 1:1000 ב PBS) לחלק העליון של כל כריכה דגירה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>הסר את הנוגדן העיקרי ולשטוף את הכיסוי עם PBS שלוש פעמים.</li>
			<li>הוסף את הנוגדן המשני Alexa Fluor 555 (מדולל 1:500 ב- PBS) לחלק העליון של כל כיסוי ודגר במשך שעה בטמפרטורת החדר תוך כיסוי בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.</li>
			<li>הסר את הנוגדן המשני ולשטוף את הכיסוי עם PBS שלוש פעמים.</li>
			<li>הר את הכיסוי (תאים הפונים כלפי מטה) על שקופיות זכוכית באמצעות מדיום הרכבה עם 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) ולאחסן את השקופיות רכוב בתיבה ב 4 °C (6 °F), מוגן מפני אור.</li>
			<li>שימו לב לכתמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית SP8.</li>
		</ol>
</li>
		<li>כתמי פלואורסצנטיות ישירים של סיבים (F)-actin.<ol>
<li>הכן דגימות לפי שלבים 3.3.1.1. ל-3.3.1.9.</li>
			<li>הכתים את התאים על ידי הוספת Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך כדי לדמיין אקטין סיבי (F-actin).</li>
			<li>לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS.</li>
			<li>טען את החלקה על שקופיות זכוכית באמצעות מדיום הרכבה עם DAPI וצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית SP8.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

TGF-β/SMAD איתות ממלא תפקיד מרכזי בהתקדמות סרטן השד, כפי שהוא יכול לקדם את פולשניות התא סרטן השד גרורות על ידי גרימת EMT7. כאן, תיארנו זרימת עבודה הגיונית כדי לחקור איתות ביוזמת TGF-β מהפעלת SMAD הנגרמת על ידי קולטן לתגובות שעתוק וביולוגיות בתיווך SMAD. התחלנו בתיאור הניתוח של זרחון SMAD2, המשכנו עם תגובות שעתוק תלויות SMAD3 הנגרמות על ידי TGF β וביטוי סמן EMT הן ברמת הגן והן ברמת החלבון כדי לנתח את תגובת האיתות TGF-β / SMAD, ולבסוף בדקתי את ה- EMT המושרה על ידי TGF-β. השתמשנו כתב שעתוק CAGA12-luciferase המכיל תיבות CAGA נגזר מקדם PAI-1, כדי לפקח על הפעילות של TGF-β / SMAD איתות מסלול35. מבנה כתב זה דורש SMAD3 ו- SMAD4 להפעלה. מחקרים קודמים הראו כי ההפלה של SMAD4 מוחלש TGF-β-induced CAGA12-luciferase פעילות37. בנוסף לבדיקת הכתב, קביעת מצב הזרחן של SMADs אנדוגני, כולל SMAD2 ו SMAD3, היא דרך נוספת לחקור את תגובת איתות TGF-β. ואכן, חברים אחרים במשפחת TGF-β, כגון גורם צמיחה ובידול (GDF)-8/מיוסטטין ו- GDF-9, גם מתמר אותות באמצעות חלבוני SMAD2/3 על ידי עיסוק TβRI42,43,44. בנוסף לכתב CAGA12-luciferase, מספר כתבים דומים שימשו כדי לזהות את ההפעלה של איתות TGF-β. לדוגמה, כתב שעתוק (SBE) 4 -Lux עם רכיביתגובההנגזרים ממקדם JunB יכול להיגרם ביעילות על ידי TGF-β, activins ו BMPs45.
כתמים מערביים ו qPCR שימשו לניתוח TGF-β-induced EMT, שהן שיטות קלאסיות לחקור את הביטוי של סמני אפיתל (כלומר, E-cadherin) וסמנים mesenchymal (כלומר, N-cadherin, חילזון, שבלול ו Zeb2). ביצענו גם כתמי כשל חיסוני עקיף של E-cadherin וכתם פלואורסצנטי ישיר של F-actin. מבחנים אלה עוד יותר אימת את פנוטיפ mesenchymal של תאים לאחר טיפול TGF-β. המגבלה של כתמי כשל חיסוני היא שיש לתקן תאים לפני הדגירה עם נוגדנים והדמיה, וקשה לחקור שינויים בביטוי סמן EMT בתאים חיים. לאחרונה, העיצוב של קווי תא כתב EMT, כגון A549 ריאות אדנוקרצינומה-vimentin-RFP, אפשר לפקח על הטרנספורמציה של תאי אפיתל לתאים mesenchymal בזמן אמת באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP)מתויג vimentin. פלטפורמה זו יכולה להיות מנוצלת עבור הקרנת סמים ופיתוח תרופות חדשות46. צבע LifeAct, פפטיד 17-חומצת אמינו, שיכול להכתים מבני F-actin בתאים חיים, הופך לכלי רב ערך כדי לדמיין את ציטוסקלטון actin בזמן אמת מבלי להפריע לתהליכים הסלולר47. במחקר זה, השתמשנו בשני מעכבי מולקולה קטנה, SB431542 ו- GW788388, כדי לאמת את ההשפעה המעכבת שלהם על איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי TGF-β. יש לציין כי GW788388 מעכב בעוצמה את פעילות TβRI ו- TβRII, בעוד של- SB431542 יש השפעה מעכבת רק על TβRI (ו- ALK4 ו- ALK7). מחקרים קודמים גילו כי GW788388 הוא חזק יותר vivo מאשר SB43154240. בנוסף לעיכוב של EMT, GW788388 הפחית את הביטוי של סמני פיברוזיס בכליה, ואת הממשל אוראלי של GW788388 בעכברים סוכרתיים ירד במידה ניכרת גלומרולופתיה25,48.
EMT ממלא תפקיד חיוני בקידום פלסטיות תא סרטן ותוצאות עמידות לתרופות גרורות 49. לכן, מיקוד תאים נגזרי EMT עם תרופות ציטוטוקסיות ספציפיות50 או גרימת חלוקה מחדש באמצעות מעבר mesenchymal-to-אפיתל (MET)51 הוצע כגישה להתגבר על גרורות תאים סרטניים והתנגדות לטיפול. עם זאת, MET תורם לשגשוג של תאים סרטניים מופצים באיברים רחוקים52, אשר עשוי להיות מועיל בעת שימוש בהיפוך הטיפולי של EMT. לאחרונה, מחקר חדש דיווח על גישה טיפולית transdifferentiation על ידי מיקוד ישיר EMT נגזר תאים סרטניים השד עבור בידול לתוך adipocytes30. מחקרו של ישי-רונן ואח' Al.30 השתמשו בתאי סרטן אפיתל מורין Py2T שעברו מעבר לתאים mesenchymal בתגובה לטיפול ארוך טווח עם TGF-β. הם הראו כי rosiglitazone בשילוב עם מעכבי MEK משופרת בידול אפיתל ו adipogenesis. עם זאת, מצאנו כי rosiglitazone לבד היה מספיק כדי לגרום transdifferentiation של תאים מורין Py2T mesenchymal לתוך adipocytes.
לסיכום, השיטות המשמשות במחקר זה סיפקו זרימת עבודה הגיונית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי TGF-β. שני המעכבים, SB431542 ו- GW788388, יכולים לחסום תגובות הנגרמות על ידי TGF-β ו- EMT. בנוסף, הדגמנו גם rosiglitazone לבד גורם adipogenesis מסוימים TGF-β-induced תאים סרטן השד mesenchymal. למרות שהשתמשנו רק בכמה קווי תאים סרטניים בשד כדי לחקור תגובות TGF-β, השיטות המתוארות כאן יכול להיות extrapolated לתאים אחרים (סרטן). כאן, השתמשנו בריכוזים שונים של β TGF כדי לגרום לתגובות סלולריות. ברוב סוגי התאים, TGF-β מפעילה את פעילותה הביולוגית בטווח הריכוז של 0.01-10 ng/mL53 וגורם לאיתות בתבנית תגובת מינון. בתאי אנדותל ראשוניים, כולל תאי אנדותל אבי העורקים שור, TGF-β המושרה הביטוי המשמעותי של SMAD2 phosphorylated ב 0.025 ng/mL, הגיע למקסימום ב 0.25 ng/mL, ונשאר ברמה זו בתגובה ריכוזים גבוהים יותר53. במחקר שלנו, השתמשנו בריכוז גבוה של TGF-β (5 ng/mL) בתאי MCF10A-ראס לבדיקת הכתב שעתוק כדי לקבל תגובות חזקות. SMAD2 זרחון וביטוי גנים היעד יכול להיגרם על ידי TGF-β במינון נמוך; לכן, השתמשנו 2.5 ng/mL TGF-β לטיפול בתאים. עם זאת, ריכוז העבודה המתאים ביותר תלוי בסוג התא ובאפקטים המשוערים. כדי לקבוע את הריכוז הטוב ביותר של TGF-β, מומלץ לטפל בתאים במינונים שונים (מנמוך לגבוה).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

ציטוקינים שינוי פקטורי גדילה-β (TGF-β) הוא אב טיפוס של קבוצה גדולה של פוליפפטידים רגולטוריים הקשורים מבנית ותפקודית כולל TGF-βs (כלומר, TGF-β1, -β2 ו -β3), חלבונים מורפוגניים עצם (BMPs) ו activins1,2. ציטוקינים אלה ממלאים תפקידים חשובים בהתפתחות העוברית ובתחזוקת הומאוסטזיס רקמות ואיברים3. misregulation של TGF-β יכול להוביל למגוון רחב של מחלות, כולל סרטן4,5. TGF-β ממלא תפקיד מורכב, כפול בהתקדמות סרטן: בתאי אפיתל נורמליים טרום מלמיניים, TGF-β מתנהג כמו מדכא גידול על ידי עיכוב התפשטות וגרימת אפופטוזיס6,7; עם זאת, בשלב המאוחר של התקדמות הגידול, כאשר תגובות ציטוסטטיות נחסמות על ידי הפעלה של אונקוגנים או אובדן של גנים מדכאי גידולים, TGF-β פועלת כמשפרת גידולים על ידי קידום מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT) בתאי סרטן, ובכך לאפשר פלישת תאים סרטניים גרורות, הפועל על תאים microenvironment הגידול, וגירוי אנגיוגנזה והתחמקות החיסון8,9,10.
TGF-β מופרש כמו מולקולת קודמן לא פעיל המכיל את β TGF-מסוף קרבוקסיה בוגרת ופפטיד הקשורים להשהיה (LAP)11. קומפלקס קטן זה יכול להיות כבול בקובאליות על ידי חלבון סמוי TGF-β מחייב (LTBP)12. שחרורו של בוגר TGF-β יכול להיות מתווך על ידי פעולה של פרוטאזות ספציפיות כי cleave LAP או על ידי משיכה מכנית של LAP בתהליך תלוי integrin13,14. בנוסף ל- LTBP, גליקופרוטאין A חוזר דומיננטי (GARP) מתבטא מאוד על פני השטח של תאי T רגולטוריים (Tregs) וממלא תפקיד דומה לזה של LTBP בוויסות ההפעלה של TGF-β15,16. GARP נקשר ישירות β TGF-β סמויים באמצעות הצמדה דיסולפידית ושיוך לא-קוולנטי. ההפעלה של TGF-β ממתחם GARP / TGF-β דורשת אונטגרינים17. בוגרת TGF-β נקשר TGF-β קולטני סרין / threonine קינאז, כלומר, TGF-β סוג I (TβRI) ו TGF-β סוג II (TβRII) קולטנים18 ליזום איתות. הכריכה של TGF-β ל- TβRII מקדמת את גיוס TβRI והקמת מתחם הטרומרי. לאחר מכן, TβRI הוא phosphorylated על ידי קינאז TβRII על שאריות סרין ותרונין במוטיב קצר גליצין- וסרין עשיר (GS), וכתוצאה מכך הפעלתו19,20. עם ההפעלה, TβRI מופעל מגויסים phosphorylates המצעים שלה: שני SMADs ספציפי לקולטן (R-SMADs) הכוללים SMAD2 ו SMAD3 (איור 1). R-SMADs חולקים מבנה כולל דומה עם שני תחומים שנקראים Mad homology, MH1 ו- MH2, המופרדים באמצעות אזור קישור עשיר בפרולין (איור 2). מוטיב כריכת ה- DNA בתחום MH1 של SMAD3 אינו נשמר בין SMAD2 ל- SMAD3, ו- SMAD2 אינו יכול לאגד ישירות DNA עקב שתי הוספות בתחום MH1 שלו (exon 3 ו- L1). SMAD2 ו-SMAD3 יכולים להיות מופעלים על ידי הזרחון של מוטיב ה-SSXS בטרמיני C שלהם (איור 2). Phosphorylated SMAD2/3 יוצר מתחמים הטרומריים עם מתווך SMAD משותף, SMAD4, אשר טרנסלוקציה לתוך הגרעין כדי לווסת את שעתוק של גנים היעד (איור 1)7,21. מסלול איתות SMAD קנוני זה מוסדר במדויק ומייצר תגובות ספציפיות לתאים ולרקמות כגון ויסות גורל התא וגרורות תאים סרטניים ופלישה22. בנוסף לאיתות TGF-β-SMAD, מסלולי איתות שאינם SMAD יכולים להיות מופעלים ישירות גם על ידי קולטנים כדי לווסת תגובות סלולריות במורד הזרם23.
במהלך התקדמות הגידול, ההפעלה של TGF-β-induced SMAD-induced מסלולים עצמאיים SMAD נדרשים אינדוקציה של EMT. EMT הוא תהליך הפיך שבו תאים סרטניים dedifferentiate מפנוטיפ אפיתל, אשר קשורה לאובדן של מגעים תא-תא וירידה קוטביות אפית-בסיסית, כדי פנוטיפ mesenchymal עם תנועתיות משופרת ויכולת הפלישה24. EMT מאופיין בביטוי מוגבר של חלבוני סמן mesenchymal, כולל N-cadherin, vimentin, Zeb2 ו חילזון1/2, ואת הסרת הפיקוח בו זמנית של סמני אפיתל, כגון E-cadherin ו β-catenin (איור 3)25. עם זאת, המעבר מאפיתל למצב mesenchymal הוא לעתים קרובות לא שלם, ותאים לקבל מאפיינים אפיתל מעורב mesenchymal (E/M). מאמר שפורסם לאחרונה על ידי האגודה הבינלאומית EMT הציע לתאר את התהליך של תאים שעברו מצבי ביניים E / M phenotypic כמו פלסטיות אפיתל-mesenchymal (EMP)26. פלסטיות זו מתייחסת EMT חלקית, מצב E / M היברידית, מצב EMT metastable, רצף EMT ספקטרום EMT26. במהלך EMT, תאים סרטניים להשיג תכונות תא גזע סרטני (CSC) ולהיות עמידים יותר אפופטוזיס הנגרמת על ידי ניתוק27. בעוד EMT אחראי על רכישת פנוטיפ פולשני בתאים סרטניים ראשוניים ומניע התקדמות סרטן, לעומת זאת, מעבר mesenchymal-אפיתל (MET) הוכח לשחק תפקיד חשוב בצמחייה של תאים סרטניים שהופצו באתרים גרורתיים רחוקים28,29. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאים סרטניים השד נגזר EMT ניתן transdifferentiated לתוך adipocytes, אשר עשוי להציע הזדמנות לעכב גרורות להתגבר על עמידות לטיפול בתאי הגידול וסרטן התדרדר30. בשל התפקיד החשוב של TGF-β איתות בהפעלה של EMT ב carcinogenesis השד, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים עבור סופג המערבי, בדיקת שעתוק לוציפראז, תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת פולימראז (qRT-PCR), ו immunofluorescence לחקירה של TGF-β איתות, TGF-β-induced EMT, ואת transdifferentiation של תאי גידול אפיתל השד מורין נגזר EMT לתוך אדיפוציטים. טכניקות אלה הן הכלים האנליטיים הנפוצים ביותר בתחום הביולוגיה של התא. qRT-PCR משמש לזיהוי, אפיון וכימות רמות ביטוי mRNA באופן כמותי. בהשוואה ל- PCR כמותי (qPCR), טכניקה חלופית, ניתן להשתמש בתעתיק ההפוך (RT)-PCR כדי לקבוע ביטוי mRNA באופן חצי כמותי31,32. כתמים מערביים משמשים לבחינת רמות חלבון ספציפיות במדגם ליסנט תא נתון עם יתרונות של רגישות וספציפיות, באופן חצי כמותי. לכן, אנו מציגים זרימת עבודה שיטתית כדי לנתח שינויים מביטוי גנים לביטוי חלבון כדי לעזור לחקור איתות TGF-β שניתן להחיל גם על מסלולי איתות אחרים.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm-side square glass coverslips</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td>631-1331</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td></td></tr><tr><td>anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-N-cadherin antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610920</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Slug antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9585</td><td></td></tr><tr><td>anti-SMAD2/3 antibody</td><td>Becton Dickinson</td><td>610842</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Snail antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tubulin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2148</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Cholera enterotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000111</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039047</td><td></td></tr><tr><td>epidermal growth factor (EGF)</td><td>Merck Millipore</td><td>01-107</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>BioWest</td><td>S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>PROMEGA</td><td>A600X</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II kit</td><td>BIOKE&amp;acute;</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>557366-M</td><td></td></tr><tr><td>Skimmed milk</td><td>Campina: Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td>17001402</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr></tbody></table>

studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells

שינוי פקטורי גדילה-β (TGF-β) הוא גורם רב תכליתי מופרש הממלא תפקיד מפתח בתקשורת בין-תאית. הפרעות של איתות TGF-β יכול להוביל לסרטן השד. TGF-β מעורר את השפעותיו על התפשטות ובידול באמצעות משטח תא ספציפי TGF-β סוג I קולטנים מסוג II (כלומר, TβRI ו TβRII) המכילים תחום פנימי סרין / threonine קינאז. על היווצרות מורכבת הטרומרית הנגרמת על ידי TGF-β, מופעל TβRI מעורר איתות תאי על ידי phosphorylating SMAD2 ו SMAD3. אלה SMADs מופעל טופס קומפלקסים הטרומריים עם SMAD4 כדי לווסת גנים היעד ספציפי, כולל מעכב הפעלת פלסמינוגן 1 (PAI-1, מקודד על ידי הגן SERPINE1). האינדוקציה של מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT) מאפשר תאים סרטניים אפיתל באתר הראשי או במהלך קולוניזציה באתרים מרוחקים כדי להשיג פנוטיפ פולשני ולהניע התקדמות הגידול. TGF-β פועל כגרום חזק של פלישה לסרטן השד על ידי נהיגה EMT. כאן, אנו מתארים שיטות שיטתיות לחקור TGF-β איתות ותגובות EMT באמצעות תאים MCF10A-RAS אנושיים קדם-מיניים (M2) ותאי אפיתל NMuMG העכבר כדוגמאות. אנו מתארים שיטות כדי לקבוע TGF-β-induced SMAD2 זרחון על ידי סופג המערבי, SMAD3 / SMAD4 תלוי פעילות שעתוק באמצעות פעילות כתב לוציפראז ו SERPINE1 ביטוי גנים היעד על ידי תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת פולימראז (qRT-PCR). בנוסף, מתוארות שיטות לבחון את ה- EMT הנגרמת על ידי TGF-β על ידי מדידת שינויים במורפולוגיה, ביטוי סמן אפיתל ומזנכימלי, כתמי אקטין סיביים וכתם כשל חיסוני של E-cadherin. שני מעכבי קינאז קולטן TGF-β מולקולה קטנה סלקטיבית, GW788388 ו- SB431542, שימשו לחסימת זרחון SMAD2 המושרה β על ידי TGF, גנים ממוקדים ושינויים בביטוי סמן EMT. יתר על כן, אנו מתארים את ההשתנות של השד mesenchymal Py2T תאי גידול אפיתל מורין לתוך adipocytes. שיטות לבחון TGF-β-induced איתות EMT בסרטן השד עשוי לתרום גישות טיפוליות חדשות לסרטן השד.

ניתוח איתות TGF-β השלב המרכזי באיתות TGF-β הוא הזרחון של שתי שאריות הסרין של מסוף הקרבוקסי ביותר במוטיב SSXS(איור 2)מאת TβRI kinase38,39. כדי לחקור תגובות איתות TGF-β, ביצענו סופג המערבי של SMAD2 זרחן. בתאי ה-MCF10A-Ras של השד האנושי, הזרחן של SMAD2 גדל באופן משמעותי בתגובה לגירוי β TGF במשך שעה, בעוד שהביטוי של SMAD2/3 הכולל לא הושפע מטיפול TGF-β (איור 4A). על ידי שימוש ב-SMAD3/4-induced TGF-β-induced CAGA-luc שעתוק הכתב assay, מצאנו כי TGF-β המושרה במידה ניכרת כתב לוציפראז בקו תאים MCF10A-ראס בהשוואה לתאים שאינם מטופלים (איור 4B). יתר על כן, ראינו כי מטרות גנים שעתוק ישיר מאופיין היטב של TGF-β כולל SMAD7 ו SERPINE1 (קידוד חלבון PAI-1), באו לידי ביטוי מאוד בתאי MCF10A-Ras שטופלו β TGF(איור 4C).
ניתוח של EMT הנגרמת על ידי TGF-β הערכנו את ה- EMT המושרה על ידי TGF-β בשיטות שונות, כגון שינויים מורפולוגיים, ביטוי של סמני EMT ברמות mRNA וחלבון וכתמים אימונופלואורסצנטיים של סמני EMT36. תאי אפיתל NMuMG שטופלו β TGF במשך יום ויומיים השתנו ממורפולוגיה אפיתל קלאסית למורפולוגיה דמוית מסנצ'יאל בצורת ציר, כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופיית ניגוד פאזה (איור 5A). בהתאם לשינויים המורפולוגיים, ראינו כי טיפול TGF-β הוביל לעלייה בביטוי החלבון של סמנים mesenchymal, כולל N-cadherin, חילזון, ו שבלול37 (איור 5B). לעומת זאת, E-cadherin, סמן אפיתל, היה downregulated בתאי NMuMG לאחר 2 ימים של טיפול TGF-β (איור 5B). בנוסף, ביצענו תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת פולימראז (qRT-PCR) כדי לחקור את ביטוי הגנים של סמני EMT. CDH1 (קידוד חלבון E-cadherin) ירד באופן משמעותי, בעוד סמנים mesenchymal כגון SNAIL ואבץ אצבע E-box מחייב homeobox 2 (ZEB2) גדלו במידה ניכרת לאחר גירוי TGF-β בתאי NMuMG לעומת תאים לא מטופלים(איור 5C). TGF-β-induced EMT בתאי NMuMG אושרה עוד יותר על ידי כתמי כשל חיסוני של E-cadherin. לאחר גירוי TGF-β במשך יומיים, תאי NMuMG הביעו פחות E-cadherin מאשר תאים בקבוצת הביקורת uninduced, כפי שנותח על ידי מיקרוסקופיה confocal (איור 5D). יתר על כן, תאי NMuMG בנוכחות TGF-β יצרו יותר סיבי מתח אקטין, כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 5E).
SB431542 ו- GW788388 מעכבים איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי TGF-β SB431542 הוא מעכב תחרותי ATP של תחום קינאז של TβRI, המכונה גם קולטן activin כמו קינאז 5 (ALK5), בעוד GW788388 מעכב פעילות TβRI ו TβRII קינאז. שני המעכבים יכולים לעכב קולטן TGF-β איתות40. לכן, טיפלנו בתאי NMuMG עם ריכוזים שונים של GW788388 בנוכחות TGF-β במשך שעה אחת. כצפוי, GW788388 עיכב זרחון SMAD2 הנגרמת על ידי TGF-β באופן תלוי מינון (איור 6A). בנוסף, הזרחן בתיווך β TGF של SMAD2 נחסם על ידי טיפול SB431542 (איור 6A). Phosphorylated SMAD2/3 יוצר קומפלקס הטרומרי עם SMAD4 ו translocates לתוך הגרעין כדי לווסת את שעתוק של גנים היעד. לכן, חקרנו את הטרנסלוקציה של SMAD2/3 בתאי NMuMG על ידי כתמי כשל חיסוני של SMAD2/3. הנתונים הראו כי הן SB431542 והן GW788388 עיכבו באופן משמעותי את הטרנסלוקציה הגרעינית הנגרמת על ידי TGF β והצטברות של SMAD2/3 בתאי NMuMG (איור 6B). יתר על כן, ההשפעות המעכבות של SB431542 ו- GW788388 נצפו גם ברמות הביטוי mRNA של גנים חשובים של יעד TGF-β המעורבים ב- EMT, כולל PAI-1, SNAIL, E-cadherin ו- Fibronectin (איור 6C). נתונים אלה הראו כי SB431542 ו- GW788388 חסמו איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי TGF-β.
ניתוח של transdifferentiation של תאים מסרטן השד mesenchymal לתוך adipocytes EMT ממלא תפקיד חיוני בשיפור הפלסטיות התאית בסרטן ותוצאות התפתחות עמידות לטיפול. פלסטיות תא סרטן יכול להיות ממוקד ישירות מעוכב עם גישה טרנס בידול, כגון אדיפוגנזה כפויה30. השתמשנו בתאי סרטן השד Py2T מורין, אשר נגזרו בלוטת החלב של גידול החלב של העכבר וירוס פוליומה התיכון גידול אנטיגן (MMTV-PyMT) עכבר מהונדס, כמודל הסלולר של פלסטיות תאים סרטניים הנגרמת על ידי EMT. בהתבסס על פרוטוקול הוקמה41, טיפלנו EMT נגזר Py2T מורין סרטן השד תאים עם התרופה נגד סוכרת rosiglitazone במשך 10 ימים כדי לגרום אדיפוגנזה. Adipogenesis הוערך על ידי הדמיה טיפות השומנים באמצעות שמן אדום O כתמים. תאי שומן זוהו בקלות בתאי סרטן השד Py2T מורין שטופלו ברוזיגליטזון (איור 7), אשר הראו כי טיפול עם rosiglitazone לבד מספיק כדי לקדם את התעתיק של תאים סרטניים בשד נגזר EMT לתוך אדיפוציטים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig01.jpg"> איור 1: איתות TGF-β/SMAD. איתות TGF-β יוזם עם מחייב של TGF-β לקולטן מסוג TGF-β II (TβRII), קינאז פעיל מכונן, כי phosphorylates TGF-β סוג אני קולטן (TβRI). לאחר מכן, מופעל TβRI קינאז זרחן SMAD2/3. פפטיד המכיל את מוטיב SSXS של SMAD2 עם שתי שאריות סרין מסוף קרבוקסיה שימש להשגת אנטיסרה פוליקלוני זיהוי זרחן-SMAD2 (p-SMAD2). לכן, ניתוח של ביטוי p-SMAD2 על ידי סופג מערבי יכול לשמש כדי לקבוע את ההפעלה של מסלול איתות TGF-β. Phosphorylated SMAD2/3 יכול ליצור קומפלקסים הטרומריים עם SMAD4, אשר לאחר מכן טרנסלוקציה לתוך הגרעין כדי לווסת תגובות שעתוק. CAGA12-luciferase כתב assay ו PCR בזמן אמת כמותי (qRT-PCR) עבור ביטוי mRNA של TGF-β גנים היעד כגון SMAD7 ו SERPINE1 (קידוד חלבון PAI-1), ניתן להשתמש כדי לנתח TGF-β-induced SMAD3-induced תגובות שעתוק תלויות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig02.jpg"> איור 2: מבנה סכמטי של מזהי R-SMAD (SMAD2 ו-SMAD3). התחומים MH1 (כחול) ו- MH2 (צהוב) נשמרים בין מזהי R-SMAD, אך אזור המקשר (אפור) אינו נשמר. תחום MH1 של SMAD3 מכיל מוטיב מחייב DNA, בעוד ש- SMAD2 אינו יכול לאגד דנ"א ישירות, עקב הכנסה (exon 3) בתחום MH1 שלו. תחום MH2 מתווך אוליגומריזציה SMAD, אינטראקציה עם קולטני TGF-β, מחייב חלבון והוא מעורב ברגולציה שעתוק. SMAD2 ו SMAD3 יכול להיות מופעל על ידי זרחון של מוטיב SSXS (באדום) בטרמיני C שלהם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig03.jpg"> איור 3: EMT הנגרמת על-ידי β TGF. במהלך מעבר אפיתל-mesenchymal הנגרמת על ידי TGF-β (EMT), התאים עוברים אובדן אפיתל ורכישת מאפיינים mesenchymal עם תנועתיות תאים משופרת ויכולת פלישה. האינדוקציה של EMT מובילה לביטוי של סמנים mesenchymal כגון N-cadherin, Zeb2, ו חילזון1/2, כמו גם downregulation של סמני אפיתל כולל E-cadherin, β קטנין, קלודין-1. ההפסד המצטבר או הרווח של מאפייני אפיתל/mesenchymal (E/M) גורם לתא להיכנס למצבי ביניים באופן הפיך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig04.jpg"> איור 4: תגובות איתות β TGF בתאי MCF10A-Ras. (A)תאי MCF10A-Ras טופלו עם או בלי TGF-β (2.5 ng/mL) במשך שעה אחת, ו lysates התא היו immunoblotted עבור SMAD2 זרחן (p-SMAD2), סה"כ SMAD2/3 ו GAPDH (כבקרת טעינה). סמן הגודל מוצג מימין. קון: קבוצת בקרה ללא טיפול TGF-β. (ב)ניתוח של פעילות TGF-β (5 ng/mL) באמצעות פעילות CAGA12-luciferase (LUC) התלויה ב- SMAD3-SMAD4 בתאי MCF10A-Ras. הערכים מנורמלים לפעילות β-גלקטוזידאז (βGal). הנתונים מבוטאים כ ממוצע ± s.d, n = 3. מבחן t של התלמיד, ***P ≤ 0.001 (C) qRT-PCR ניתוח של TGF-β גנים היעד SMAD7 ו SERPINE1 (קידוד חלבון PAI-1) בתאי MCF10A-ראס שטופלו TGF-β (2.5 ng/mL) במשך 6 שעות. GAPDH שימש כפקד פנימי. הנתונים מבוטאים כ ממוצע ± s.d, n = 3. מבחן התלמידים, ***P ≤ 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig05.jpg"> איור 5: EMT הנגרמת על-ידי β TGF בתאי NMuMG. (A) מורפולוגיה של תאי NMuMG שטופלו β TGF (2.5 ng/mL) במשך יום או יומיים. בנוכחות TGF-β, תאי NMuMG transdifferentiated לתוך פנוטיפ mesenchymal. סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר (B) תאי NMuMG טופלו עם או בלי TGF-β (5 ng/ mL) במשך 2 ימים, וסמני EMT נותחו על ידי סופג מערבי. סמן הגודל הוא כפי שצוין מימין. קון: קבוצת בקרה ללא טיפול TGF-β. (C) ניתוח ביטוי גנים של סמני EMT (CDH1 (קידוד חלבון E-cadherin), חילזון ו ZEB2) בתאי NMuMG שטופלו במשך יומיים עם TGF-β (5 ng/mL). GAPDH שימש כפקד פנימי. התוצאות מבוטאות כ ממוצע ± s.d., n = 3. *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. (D)תאי NMuMG הוכתמו על ידי אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות את הביטוי של סמן אפיתל E-cadherin (אדום) לאחר טיפול TGF-β (2.5 ng/mL) במשך 2 ימים. גרעינים היו מוכתמים ב- DAPI (כחול). תמונות נלכדו במיקרוסקופיה קונפוקלית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (E) תאי NMuMG היו מוכתמים בפלואורסצנטין-פאלודין (ירוק) כדי לדמיין F-actin. גרעינים היו מוכתמים ב- DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 50 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig05large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig06.jpg"> איור 6: TGF-βsignaling ו- EMT הנגרמת על ידי TGF-β עכבות על ידי SB431542 ו- GW788388. (A)תאי NMuMG טופלו עם 10 מיקרומטר של SB431542 (SB) או הריכוזים המצוינים של GW788388 (GW) בנוכחות או היעדר TGF-β (5 ng/mL) במשך שעה אחת. lysates התא היו immunoblotted עבור p-SMAD2, SMAD2/3 ו GAPDH. (B)תאי NMuMG טופלו עם 5 מיקרומטר של SB431542 (SB) או 10 מיקרומטר של GW788388 (GW) בנוכחות או היעדר 5 ng/mL של TGF-β במשך שעה אחת מוכתם על ידי immunofluorescence כדי לזהות את ההעתקה הגרעינית של SMAD2/3 (ירוק). תמונות נלכדו במיקרוסקופיה קונפוקלית. (C) ביטוי של גנים היעד TGF-β, כולל PAI-1 וגנים קידוד סמני EMT, כולל SNAIL, E-Cadherin ו Fibronectin, נותחו על ידי תגובת שרשרת פולימראז תעתיק הפוך (RT-PCR) בתאי NMuMG לאחר טיפול SB או GW וגירוי TGF-β במשך 48 שעות. GAPDH שימש כבקרת טעינה. הפקד מציין תאים שאינם מטופלים. נתון זה שונה מ פיטרסן M. ואח' . 34 באישור המפרסם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig07.jpg"> איור 7: ניתן לגרום לתאי סרטן השד מורין Py2T שמקורם ב-EMT להבדיל ביניהם לאדיפוציטים. Py2T מורין סרטן השד תאים היו מגורה עם 2 ng/mL TGF-β במשך 20 ימים כדי לגרום EMT להשלים. לאחר מכן, התאים טופלו גם עם DMSO כבקרת רכב או rosiglitazone (2 מיקרומטר) במשך 10 ימים כדי לאפשר את הבידול של תאים סרטניים mesenchymal ולעורר אדיפוגנזה. המדיום הוחלף כל יומיים. לאחר 10 ימים של טיפול, התאים היו מוכתמים בשמן אדום O. Scale bar = 50 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig07large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מינים</td>
			<td>שם גנים</td>
			<td colspan="2">קדימה (5' עד 3')</td>
			<td colspan="2">הפוך (5' עד 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">אנושי</td>
			<td>גאפ-די</td>
			<td colspan="2">TGCACCACCAקטגקטגC</td>
			<td colspan="2">GGקטגקטגקטגאג</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMAD7</td>
			<td colspan="2">TCCAגאטגTCC</td>
			<td colspan="2">GTCCגאטגקטג'קג'יק</td>
		</tr>
<tr>
<td>סרפין1</td>
			<td colspan="2">קקאוטגאגג'קקט</td>
			<td colspan="2">קטרג'יג'גטגטגאקאק</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">העכבר</td>
			<td>גאפ-די</td>
			<td colspan="2">TGGקאגטגאטגאטגג'ק</td>
			<td colspan="2">אאגאטגטגאטגגקטקטקג'ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>CDH1</td>
			<td colspan="2">ACCAAAGTCGCTGAAGTC</td>
			<td colspan="2">גאגאטגטקאטגאטג</td>
		</tr>
<tr>
<td>חילזון</td>
			<td colspan="2">קגקטגקאקטגט</td>
			<td colspan="2">GCGAGGGCCCCGGAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZEB2</td>
			<td colspan="2">TTCTGCAAGCTCTGTAGCC</td>
			<td colspan="2">TTCTGGCCCCTGCAT</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: פריימרים המשמשים עבור qRT-PCR.

Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-Î² Signaling and TGF-Î²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

אנו מתארים זרימת עבודה שיטתית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי β TGF על ידי לימוד ביטוי החלבון והגנים המעורבים במסלול איתות זה. השיטות כוללות סופג מערבי, בדיקת כתב לוציפראז, qPCR, וכתמי כשל חיסוני.

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.6K Views.  Leiden University Medical Center. אנו מתארים זרימת עבודה שיטתית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי β TGF על ידי לימוד ביטוי החלבון והגנים המעורבים במסלול איתות זה. השיטות כוללות סופג מערבי, בדיקת כתב לוציפראז, qPCR, וכתמי כשל חיסוני.

Video: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Medicine

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Developmental Biology

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic plasticity drives invasion, dissemination and metastasis. Indeed, while most of the studies of phenotypic plasticity have been in the context of epithelial-derived carcinomas, it turns out sarcomas, which are mesenchymal in origin, also exhibit phenotypic plasticity, with a subset of sarcomas undergoing a phenomenon that resembles a mesenchymal-epithelial transition (MET). Here, we developed a method comprising the miR-200 family and grainyhead-like 2 (GRHL2) to mimic this MET-like phenomenon observed in sarcoma patient samples.We sequentially express GRHL2 and the miR-200 family using cell transduction and transfection, respectively, to better understand the molecular underpinnings of these phenotypic transitions in sarcoma cells. Sarcoma cells expressing miR-200s and GRHL2 demonstrated enhanced epithelial characteristics in cell morphology and alteration of epithelial and mesenchymal biomarkers. Future studies using these methods can be used to better understand the phenotypic consequences of MET-like processes on sarcoma cells, such as migration, invasion, metastatic propensity, and therapy resistance.

We present here a cell culture method for inducing mesenchymal-epithelial transitions (MET) in sarcoma cells based on combined ectopic expression of microRNA-200 family members and grainyhead-like 2 (GRHL2). This method is suitable for better understanding the biological impact of phenotypic plasticity on cancer aggressiveness and treatments.

אינדוקציה של מעברי אפיתל- mesenchymal בתאי סרקומה

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

הבידול של השד העכבר האפיתל HC11 ו EpH4 תאים

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

תפוקה גבוהה המתיחה כוח מיקרוסקופ באמצעות PDMS מגלה השפעות תלויי מינון של שינוי מקדם הצמיחה-β על המעבר אפיתל-to-מעבר משנה

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Bioengineering

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Biology

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

אנדותל בתיווך TGF-β למעבר מסנצ'ימלי (EndMT) וההערכה הפונקציונלית של אפקטי EndMT באמצעות עריכת גנים CRISPR/Cas9

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video