ברצוננו להכיר בכך שהטכניקה זו תוארה לראשונה על ידי ספרטה et al., 2012 והותאמה בקלות לשימוש במעבדה שלנו.

* כל החומרים יחד עם יצרנים ו / או ספקים המפורטים להלן הפרוטוקול. 1. הרכבה של שתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת של אפוקסי סיבים האופטיים חום ניתן לריפוי על ידי הוספת 100 מ&quot;ג של מקשה ל1 גרם של שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד וחתכת כ 35 מ&quot;מ של סיבים אופטיים 125 מיקרומטר עם ליבת 100 מיקרומטר ידי ניקוד אותו עם סופר קרביד טריז קצה. מקם את ניצבת הסופר לסיבים האופטיים והניקוד בתנועה אחת, חד כיווני. חיתוך הסיבים לחלוטין יפגע בליבת הסיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס LC קרמיקת כפת מתכת עם 127 מיקרומטר קדח בסגן, צד קמור מופנה כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הסיב האופטי לתוך טבעת חזוק. הסיב האופטי צריך להחליק בצורה חלקה ושולי יבלוט מעבר לסוף הקמור של כובעון המתכת (האיור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפה אחת של אפוקסי סיבים האופטיים חום לריפוי לסוף והחום השטוח עם אקדח חום עד אפוקסי הופך לשחור. אפוקסי צריךלמלא את טבעת חזוק כפי שהוא מתחמם ולפני ריפוי. אפוקסי צריך לרפא בתוך ~ 1 דקות של יישום חום קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את איפוקסי צדי טבעת חזוק, כפי שיקשה התממשקות עם המצמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולני הסוף הקמור של טבעת חזוק באמצעות דיסק LC סיב אופטי ליטוש (FOPD) על יריעות אלומיניום תחמוצת ליטוש על משטח הליטוש (האיור 1b). הפוך דפוסי סיבוב מעגליים ולהבריק בארבע כיתות על פי הסדר הבא: 5, 3, חצץ 1 0.3 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הסיבים האופטיים בסוף השטוח לאורך כזה שהיא יהיה ממוקדת באזור של ריבית המתאים. האורך ניתן לקבוע באמצעות אטלס stereotaxic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השתל על ידי חיבורו לליזר דרך כבל המצמד המתואר להלן. הסוף המלוטש של השתל מוכנס לתוך השרוול של המצמד וצריך ליצור קשר ישיר עם טבעת חזוק יריב. השתל צריך להיות מסוגל לשמור על 10 mW של תפוקת אור, נמדד בקצה של הדואר סיבי שתל. שתל רע יהיה מוקד חלש ליד קצה הסיב האופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את השתלים המוגמרים (האיור 1 ג) בקצף עד לשימוש. </li></ol> 2. הרכבה של כבל מצמד סיבים אופטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת של אפוקסי סיבים האופטיים חום לריפוי כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ולחתוך אורך מתאים של סיבים אופטיים 220 מיקרומטר עם ליבת 200 מיקרומטר ידי ניקוד אותו עם סופר קרביד טריז קצה. אורכו של הסיב צריך לאפשר את העכבר כדי לנוע בחופשיות סביב הדיור, אך לא לאפשר את העכבר כדי ללעוס דרך הסיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הסיבים האופטיים לאורכו של צינור מזלוג מעט ארוך יותר מאורך הסיבים האופטי. הצינורות צריכים קוטר פנימי מעט גדול יותר מהסיבים האופטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצועה ~ 25mm בקצה אחד של הסיב האופטי והכניסו אותו לסוף המתכת של MM FC Multimode כפת מתכת אסיפה עם 230 מיקרומטר נשא עד שייעצר. הסיב האופטי צריך לבלוט באמצעות ferruסוף le (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאבטח את החיבור עם cyanoacrylate (דבק סופר) בסוף המתכת. כיסוי החיבור עם אתחול מחבר וללטש סוף טבעת חזוק עם FC FOPD. הפוך דפוסי סיבוב מעגליים ופולנים בארבע כיתות, לפי הסדר הבא: 5, 3, 1, 0.3 מיקרומטר חצץ (האיור 2b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתפשט ולהכניס את הקצה השני של הסיב האופטי לתוך LC קרמיקת כובעון מתכת (230 מיקרומטר id המשעמם) עם סוף דיסטלי הקמור. תחול ירידה של אפוקסי עד הסוף והחום השטוח עד שנרפא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולני הסוף הקמור של טבעת חזוק באמצעות FC FOPD על גיליונות ליטוש תחמוצת אלומיניום כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסט שרוול טבעת חזוק LC על הקצה הקמור של טבעת חזוק עד נקודת האמצע של השרוול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום חום לכווץ צינורות מעל צינורות מזלוג והשרוול וחום לאבטח ולהגן על החיבור (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המצמד על ידי חיבורו למקור הליזר ומדידת outp האורut דרך המצמד עם ספקטרופוטומטר. אובדן האור בין פלט הליזר ופלט המצמד נמדד לא יעלה על 30%. </li></ol> 3. השרשת כירורגים * מדובר בהליך טיפים בלבד. מכשירים הם סטרילי אבל כפפות לא צריכות להיות בגלל מניפולציה מתמדת בין המכשירים והציוד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכבר עם תערובת intraperitoneal הזרקת קטמין / Xylazine 100 ו 10 מ&quot;ג / קילו בהתאמה באמצעות מחט 30-מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גילוח הקרקפת עם קוצץ. נגב את הקרקפת עם אלכוהול רפואי 70% ואחריו Betasept לנגב (4% פתרון chlorhexidine) עבור 2 דקות, חוזר פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר באסדת sterotaxic ולאבטח את הראש, להבטיח כי הגולגולת היא רמה. החל משחת עיניים לעיניים, כדי למנוע יובש וכאב שלאחר ניתוח. לשמור על הרדמה באמצעות% volatized isoflurane (1-3 המדולל בחמצן בהתאם למצב הפיזיולוגי של mouse, שצריך להיות במעקב רציף על ידי תגובה לקמצוץ זנב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בקו האמצע של הקרקפת, וחושף את הגולגולת ממסלולי העיניים למבדה. לדחוף הצידה רקמות חיבור במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במהדק Serafin להחזיק לאחור את העור ולשמור על גישה לגולגולת (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחרוט תבנית משובצת לאורך פני השטח של הגולגולת עם מכוש שיניים. שטוף את הלכלוך משם עם מי מלח סטרילית. להתייבש היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מי חמצן (3%) לגולגולת החשופה עם קיסם אוזניים ל~ 2-3 שניות כדי ליצור micropores. לשטוף מספר פעמים ויבשות ביסודיות. לחלופין, ניתן עוגנים מוברגים לגולגולת, כמתואר בספרטה et al. (2012). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, לחרוט תבנית משובצת לאורך הגולגולת עם מכוש שיניים ולשטוף את הלכלוך עם מי מלח. להתייבש היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי סיבובי, להפוך את הקוץ קטן חור craniotomy (&lt;1 מ&quot;מ קוטר) עם מקדח סטרילי(Autoclaved) מעל האזור של עניין, נקבע על ידי אטלס stereotaxic המכויל לגבחת ומבדה. היזהר שלא לשבור את הדורה או לפגוע בכל רקמה. לשטוף לכלוך ויבש ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את טבעת חזוק הסיבים האופטית (שתל) לתוך מחזיק החללית ולהתחבר לזרוע stereotaxic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את השתל במקום ישירות מעל האזור של עניין באמצעות זרוע stereotaxic (איור 3 ב). אם החדרת הסיב האופטי ברקמת המוח, סיבים יש לקדם לאט בקצב של ~ 2 מ&quot;מ / דקה. טבעת חזוק צריכה לנוח על הגולגולת שנותרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת של מלט שיניים. התערובת צריכה להיות מספיק צמיגות נמוכה בקלות להחיל על פני הגולגולת. התערובת תהיה שמישה עבור 2-4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קיסם סטרילי, תחול, גם שכבה דקה של מלט שיניים על פני גולגולת ועל החלק התחתון של השתל. שכבת הבסיס של מלט שיניים צריכה לכסות את פני שטח כל כך הרבה על הגולגולת כאפשרי. אל תתנה מלט השיניים באים במגע עם העור של העכבר. זה יוביל לקושי מוגבר בתפירה, כמו גם גירוי לעכבר. אם מלט השיניים אינו בא במגע עם העור, לאפשר לו להתייבש חלקית באופן שכל השכבה של מלט ניתן התקלפה לפני ההגדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לו להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחול אפילו שכבות של בטון שיניים ליצירת גבעה קטנה מעל הגולגולת וסביב השתל, המאפשר לכל שכבה להתייבש לחלוטין (איור 3 ג). השאר ~ 3-5 מ&quot;מ מהקצה הקמור של טבעת חזוק נקיה של מלט, כדי לאפשר חיבור חלק, ללא הפרעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור את הקרקפת על תלולית בטון שיניים וסביב השתל באמצעות תפרים סטריליים, שימוש יחיד משי קלועים (6-0) עם C22 מחט. הסר לאחר 7 ימים. אופציונלי: בונד וטרינר שימוש למחייבים נוסף לאחר תפירה. הקפד להשתמש בונד וטרינר מינימאלי. עודף יכול לגרום לניזק בעור חמור עקב גירוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immediately לאחר ניתוח, עכבר צריך להיות מוזרק מתחת לעור עם Ketprophen (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) כדי להקטין כאב שלאחר ניתוח. זה צריך להיות חזר 24 שעות מאוחר יותר. החל משככי כאבים אקטואליים (Bupivicaine) ואנטיביוטיקה (כוהל) לעור ונתפר מסביב לבסיס של השתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר בכלוב מעל שמיכת חימום להתאוששות מן ההרדמה. הנח את העכבר בכלוב התאוששות סטרילי, לאחר ניתוח. כלובי ההתאוששות לא צריכים להכיל כל מצעים כדי לשמור על טמפרטורה ולמנוע חנק. העכבר ניתן להחזירו לכלוב המקורי או כלוב פעם ערה חדש. </li></ol> הרכבה נכונה של שתל הסיבים האופטיים ותוצאות מצמד באובדן פוטון מינימאלי בין מקור האור וסופו של הסיב האופטי באזור של עניין. סיבים אופטיים מלוטש היטב צריך להעביר אור במדים, קונצנטרי העיגול (איור 2 ד). עם השתלה ותפירה זהירות, לא גורם לגירוי השתל גלוי להעכבר ויכול להישאר במקום למחקרים ארוכי טווח (איור 3D,&gt; 1 חודש, תצפיות שלא פורסמו) ללא כל שפלה משמעותית של הסיבים האופטיים או כמות האור המועבר. השתלה או תפירה לא נכונה יכולה לגרום לגירוי ויכולה לגרום לעכבר מגרד את הקרקפת שלה, וחושפת את שיני מלט, או שבירה של טבעת חזוק מבטון השיניים בגלל מניפולציה מתמשכת. תרשים סכמטי של המערכת המורכבת שניתן לראות באיור 4. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> איור 1. עצרת של סיבים אופטיים להשתלה. () הסיב האופטי מוכנס לתוך טבעת חזוק, שולי בולטת מעבר לקצה הקמור שצוין על ידי ראש החץ. (ב) הסוף הקמור של כובעון המתכת מלוטש באמצעות FOPD בכיתות בהדרגה מעודנות יותר של גיליונות ליטוש. (ג) opt הסיבים המושתל המוגמרIC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> איור 2. עצרת של מצמד סיבים אופטיים המשמש לקשור את המפרק הסיבובי הסיבים האופטי לשתל. (א) דבק סיבים אופטי דרך הרכבת טבעת חזוק. (ב) צד טבעת חזוק של ההרכבה מוכנס לתוך הכיתות בהדרגה העדינה FOPD ומלוטשות באמצעות נייר ליטוש. (ג) שרוול טבעת חזוק מצויד מעל טבעת חזוק ומאובטח עם צינורות חום פסיכולוג. (ד) מצמד הסיבים האופטיים סיים צריך לייצר אור קונצנטרי עם אובדן פוטון מינימאלי. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> איור 3. השתלת כירורגים בסיבים האופטיים. (א) את כל פני השטח של craniuמ &#39;חשוף ורקמות חיבור אינה מסומנות. (ב) שתל הסיבים האופטי מוחזק בעמדה עם זרוע stereotaxic. (ג) מלט שיניים מיושם תיקון שתל הסיבים האופטי לגולגולת. (ד)&gt; 1 חודש לאחר השתלה, העור נרפא סביב השתל ואין סימנים של גירוי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> איור 4. תרשים סכמטי של המערכת התפקודית

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2.">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy.">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li><li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li><li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking.">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall.">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li></ol>

Optogenetics היא טכניקה חדשה ורבת עצמה המאפשרת שליטה חסרת תקדים על תת עצבי ספציפיים. זו יכולה להיות מנוצלת כדי להשפיע על מסלולים עצביים עם דיוק האנטומי וזמני, תוך הימנעות מתא מהסוג חסר הבחנה ואפקטים פולשניים של גירוי חשמלי באמצעות אלקטרודה. השרשה של סיבים אופטיים מאפשרת ל?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב או הציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שרוול LC כובעון מתכת </td><td> מוצרי סיבי דיוק (PFP) </td><td> SM-CS125S </td><td> מזהה מ&quot;מ 1.25 </td></tr><tr><td> FC MM מחבר מראש התאסף </td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230 מיקרומטר כפת מתכת </td></tr><tr><td> מילר FOPD-LC דיסק </td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> לLC ferrules </td></tr><tr><td> צינורות מזלוג </td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900 מיקרומטר od, שם מיקרומטר 250 </td></tr><tr><td> MM LC סטיק כפת מתכת 1.25 מ&quot;מ </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-1270 </td><td> זיהוי מיקרומטר 127 Bore </td></tr><tr><td> MM LC סטיק כפת מתכת 1.25 מ&quot;מ </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230 מיקרומטרזיהוי Bore </td></tr><tr><td> אפוקסי חום לריפוי, מקשה ושרף </td><td> PFP </td><td> ET-353ND-16OZ </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC וSC / מחשב דיסק ליטוש מחבר </td><td> ThorLabs </td><td> D50-FC </td><td> לFC ferrules </td></tr><tr><td> כוח אופטי דיגיטלי ומד אנרגיה </td><td> ThorLabs </td><td> PM100D </td><td> ספקטרופוטומטר </td></tr><tr><td> הפוליש Pad </td><td> ThorLabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;x 13&quot; 50 מד קשיות </td></tr><tr><td> תחמוצת אלומיניום מלחך פחים (פוליש): 0.3, 1, 3, 5 גריסי מיקרומטר </td><td> ThorLabs </td><td> LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P </td><td></td></tr><tr><td> סיבי Multimode חיפוי קשיחים סטנדרטיים </td><td> ThorLabs </td><td> BFL37-200 </td><td> OH נמוך, Core מיקרומטר 200, 0.37 NA </td></tr><tr><td> כלי עקירת סיבים </td><td> ThorLabs </td><td> T10S13 </td><td> לבוש / Coב: מיקרומטר 200/300 מיקרומטר </td></tr><tr><td> סיבי סיליקה / אופטיים סיליקה </td><td> טכנולוגיות Polymicro </td><td> FVP100110125 </td><td> הגבוה OH, UV משופר, 0.22 NA </td></tr><tr><td> 1x1 משותף רוטרי fiberoptic </td><td> עדשות דוריים </td><td> FRJ_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> מונה fiberoptic Patchcord </td><td> עדשות דוריים </td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> מחמם לכווץ צינורות, סנטימטר 1/8 </td><td> בעלות הברית אלקטרוניקה </td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td> אקדח חום </td><td> בעלות הברית אלקטרוניקה </td><td> 972-6966 </td><td> 250 ואט; 750-800 ° F </td></tr><tr><td> הכותנה הטתה applicators </td><td> הפוריטנית רפואית מוצרי חברה </td><td> 806-ב&quot;ש </td><td></td></tr><tr><td> דבק רקמות VetBond </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td> אקריליק בסיס התותב פלאש </td><td> ייטס Motloid </td><td> ColdPourPowder + liq </td><td></td></tr><tr><td> בון מיניאטורות מספרי איריס </td><td> Miltex Integra </td><td> 18-1392 </td><td> 3-1/2 &quot;(8.9cm), ישר, להבי 15 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> ג&#39;ונס הופקינס בולדוג קלאמפ </td><td> Miltex Integra </td><td> 7-290 </td><td> 1-1/2 &quot;(3.8 סנטימטרים), התעקל </td></tr><tr><td> MEGA-מומנט חשמלי מעבדת מוטור </td><td> וקטור </td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td> פנתר burs-Ball # 1 </td><td> קלרקסון מעבדה </td><td> 77.1006 </td><td></td></tr><tr><td> ויולט בלו ליזר מערכת </td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-O </td><td> אורך גל: 473 ננומטר </td></tr><tr><td> ספק כוח הליזר </td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td> דומון # 2 מלקחי Laminectomy </td><td> Fהגדרות משיווק מדעים </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> בדיקה </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 10140-02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 &quot;מלקחי סטרייט </td><td> Excelta </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td> מלחציים עם בסיס משוקלל </td><td> Altex אלקטרוניקה </td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue

דפוסי הבהרה של קישוריות עצבית כבר אתגר למדעי המוח קליניים ובסיסיים. אלקטרופיזיולוגיה כבר את תקן הזהב לניתוח דפוסים של קישוריות הסינפטית, אבל הקלטות אלקטרו לזווג יכולות להיות גם מסורבלות וניסוי מגביל. הפיתוח של optogenetics הציג שיטה אלגנטית כדי לעורר נוירונים ומעגלים, הוא ב1 מבחנת in vivo 2,3. על ידי ניצול פעילות תא ספציפית אמרגן סוג לנהוג ביטוי אופסין באוכלוסיות עצביות נפרדות, ניתן לעורר דווקא תת עצבי מוגדר גנטי במעגלים שונים 4-6. שיטות שתוארו היטב כדי לעורר נוירונים, כולל גירוי חשמלי ו / או מניפולציות תרופתיות, לעתים קרובות ללא הבחנת תאי סוג, פולשני, ויכולות להזיק לרקמות מסביב. מגבלות אלה עלולות לשנות את התפקוד נורמלי הסינפטי ו / או התנהגות מעגל. בנוסף, בשללאופי של המניפולציה, השיטות קיימות הן לעתים קרובות חריפות וסופנים. Optogenetics מקנה את היכולת לעורר נוירונים בצורה יחסית לא מזיקה, ובנוירונים ממוקדים מבחינה גנטית. רוב המחקרים שכלל בoptogenetics vivo כרגע להשתמש סיב אופטי מודרך דרך צינורית 6,7 מושתל, אולם מגבלות של שיטה זו כוללות רקמות פגועות מוח עם כניסה חוזרת של סיב אופטי, ושבירת פוטנציאל של הסיבים בתוך הצינורית. בהתחשב בתחום המתפתח של optogenetics, שיטה אמינה יותר לגירוי כרוני יש צורך להקל על מחקרים ארוכי טווח עם ניזק לרקמות ביטחונות מינימאליים. כאן אנו מספקים הפרוטוקול השונה שלנו כמאמר וידאו כדי להשלים את השיטה המתוארת ביעילות ובאלגנטיות בספרטה et al. 8 עבור הייצור של שתל סיבים אופטיים וקיבועו הקבוע על הגולגולת של עכברים מורדמים, כמו גם את ההרכבה של סיבמצמד אופטי חיבור השתל למקור אור. השתל, מחובר עם סיבים אופטיים לליזר מצב מוצק, מאפשר שיטה יעילה כרוני לphotostimulate מעגלים עצביים פונקציונליים עם ניזק לרקמות פחות 9 באמצעות חבלים, קטנים, נתיקים. קיבוע קבוע של שתלי הסיבים האופטיים מספק עקבי, לטווח ארוך במחקרי vivo optogenetic של מעגלים עצביים בעכברים, ערים מתנהגים 10 עם ניזק לרקמות מינימאלי.

Watch this Scientific Journal Video about Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue at JoVE.com

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

הפיתוח של optogenetics מספק כעת את האמצעים בדיוק כדי לעורר נוירונים ומעגלים מוגדרים גנטי, שני<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em&gt;. כאן אנו מתארים את ההרכבה וההשתלה של סיבים אופטיים לphotostimulation הכרוני של רקמת מוח.

השרשה של סיבים אופטיות לגירוי Optogenetic כרוני של רקמת המוח

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

44.6K Views.  Baylor College of Medicine (BCM). הפיתוח של optogenetics מספק כעת את האמצעים בדיוק כדי לעורר נוירונים ומעגלים מוגדרים גנטי, שני במבחנה ו In vivo. כאן אנו מתארים את ההרכבה וההשתלה של סיבים אופטיים לphotostimulation הכרוני של רקמת מוח.

Video: Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית לווסת את ההתנהגות בעכברים נעים בחופשיות

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Behavior

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Functional MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain's global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.

This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

MRI פונקציונלי optogenetic

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

אין ויוו יישוב ביטוי של חלבונים Optogenetic באמצעות סרטי משי/AAV

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these tasks require sensory-motor integration and involve precise control of bilateral brain circuits. Implementing unimanual behavioral paradigms in animal models will improve the understanding of the contribution of brain structures, like the striatum, to complex motor behavior as it allows manipulation and recording of neural activity of specific nuclei in control conditions and disease during the performance of the task. 
Since its creation, optogenetics has been a dominant tool for interrogating the brain by enabling selective and targeted activation or inhibition of neuronal populations. The combination of optogenetics with behavioral assays sheds light on the underlying mechanisms of specific brain functions. Wireless head-mounted systems with miniaturized light-emitting diodes (LEDs) allow remote optogenetic control in an entirely free-moving animal. This avoids the limitations of a wired system being less restrictive for animals' behavior without compromising light emission efficiency. The current protocol combines a wireless optogenetics approach with high-speed videography in a unimanual dexterity task to dissect the contribution of specific neuronal populations to fine motor behavior.

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

The present protocol describes how to use wireless optogenetics combined with high-speed videography in a single pellet reach-to-grasp task to characterize the neural circuits involved in the performance of skilled motor behavior in freely moving mice.

In Vivo שליטה אופטוגנטית אלחוטית בהתנהגות מוטורית מיומנת

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these ...

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective neural modulation or monitoring. As specific types of neuronal cells can be genetically modified to express opsin proteins, optogenetics enables optical stimulation or inhibition of the selected neurons. There have been several technological advances in the optical system for optogenetics. Recently, it was proposed to combine the optical waveguide for light delivery with electrophysiological recording to simultaneously monitor the neural responses to optogenetic stimulation or inhibition. In this study, an implantable optrode array (2x2 optical fibers) was developed with embedded multichannel electrodes. 
A light-emitting diode (LED) was employed as a light source, and a microfabricated microlens array was integrated to provide sufficient light power at the tip of the optical fibers. The optrode array system comprises the disposable part and the reusable part. The disposable part has optical fibers and electrodes, while the reusable part has the LED and electronic circuitry for light control and neural signal processing. The novel design of the implantable optrode array system is introduced in the accompanying video in addition to the procedure of the optrode implantation surgery, optogenetic light stimulation, and the electrophysiological neural recording. The results of in vivo experiments successfully showed time-locked neural spikes evoked by the light stimuli from hippocampal excitatory neurons of mice.

Here, we present the fabrication method of an optrode system with optical fibers for light delivery and an electrode array for neural recording. In vivo experiments with transgenic mice expressing channelrhodopsin-2 show the feasibility of the system for simultaneous optogenetic stimulation and electrophysiological recording.

מערך Optrode לאפנון אופטוגנטי סימולטני והקלטה עצבית חשמלית

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

ניתוחי חוט שדרה והשתלת שוק אופטי במכרסמים

Implantation of Optoelectronic Devices in the Rodent Spinal Cord

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the spinal cord remains relatively unexplored. The inherently delicate and mobile spinal cord tissue imposes constraints that make the precise implantation of neural probes challenging. Despite recent advances in neuromodulation devices, particularly flexible bioelectronics, opportunities to expand their use in the spinal cord have been limited by the surgical complexities of device implantation. Here, we provide a series of surgical protocols tailored specifically for the implantation of a custom-made optoelectronic device that interfaces with the spinal cord in rodents. The steps to place and anchor an optical shank on a specific segment of the spinal cord via two different surgical implantation methods are detailed here. These methods are optimized for a diverse range of devices and applications, which may or may not require direct contact with the spinal cord for optical stimulation. To elucidate the methodology, the vertebral anatomy is referenced first to identify prominent landmarks before making a skin incision. The surgical steps to secure an optical shank over the cervical spine in rodents are demonstrated. Procedures are then outlined for securing the optoelectronic device connected to the optical shank in a subcutaneous space away from the spinal cord, minimizing unnecessary direct contact. Behavioral studies comparing animals receiving the implants to those undergoing sham surgeries indicate that the optical shanks did not adversely affect hindlimb or forelimb function seven days post-implantation. The present work broadens the neuromodulation toolkit for use in future studies aimed at investigating various spinal cord interventions.

מחבר זרקור: מתודולוגיה חדשנית להשתלה ואבטחה של בדיקות עצביות בחוט השדרה של מכרסם

This protocol details a surgical procedure for performing spinal cord surgery and for implanting and securing an optical shank over the spinal cord in rodents.

השתלת מכשירים אופטואלקטרוניים בחוט השדרה המכרסם

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the ...