These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).

<ol>
	<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools.">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147, 1446-1457 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+neural+interface:+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology.">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).</li><li>Sidor, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychiatry's+age+of+enlightenment:+optogenetics+and+the+discovery+of+novel+targets+for+the+treatment+of+psychiatric+disorders.">Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders.</a> J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li><li>Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+neural+circuits+underlying+emotional+valence+and+motivated+behaviors.">Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors.</a> Brain Res. 1511, 73-92 (2013).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li><li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477, 171-178 (2011).</li><li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).</li><li>Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+identification+of+striatal+projection+neuron+subtypes+during+in+vivo+recordings.">Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings.</a> Brain Res. 1511, 21-32 (2013).</li><li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins.">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nat Methods. 9, 159-172 (2012).</li><li>Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+principles+underlying+optical+stimulation+of+a+channelrhodopsin-2+positive+pyramidal+neuron.">Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron.</a> J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).</li><li>Tye, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety.">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li><li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).</li><li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463, 98-102 (2010).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).</li><li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-stable+neural+state+switches.">Bi-stable neural state switches.</a> Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).</li><li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue.">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> J Vis Exp. , e50004 (2012).</li><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).</li><li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Goshen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+retrieval+strategies+for+remote+memories.">Dynamics of retrieval strategies for remote memories.</a> Cell. 147, 678-689 (2011).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to report.

בחרו הקופצים הלייזר תאר הנוכחי ואסטרטגיות קשירה תואמות עם מגוון רחב של בדיקות התנהגותיות מכרסמים. ואכן, מגוון רחב של בדיקות התנהגותיות היה בשימוש הבא, או נלווה, in vivo גירוי optogenetic הכוללים משימות רגשיות התנהגותיים, אוויר התנהגות, בלמידה ובזכרון פרדיגמות, שינה, התעוררות, ומשימות תיאבון עד כמה שם (ראה אל Nieh et. 6 לסקירה מקיפה). Optogenetics שינה את הדרך בי בדיקות התנהגותיות מסורתיות שנערכו במחקרים רב-יום שעכשיו אפשר לתמצת פגישה אחת שבה התנהגות היא בהשוואה, בתוך-נושאים, בתקופות שונות של אור &#39;על&#39; לעומת &#39;off&#39; 5. תאים של לב, מנגנונים התנהגותיים המכילים פתחים, סגורים או מכשולים אחרים עשויים להיות שונה כדי להכיל מעבר של סיבים קשורים. Si היתר אסטרטגיות קשירה תארגירוי multaneous של עכברים מרובים מליזר יחיד. בדיקות התנהגותיות optogenetic תפוקה גבוהה ולכן יכולות להיות מושגות באמצעות השימוש בלייזר מרובה וציוד בדיקה. מספר בעלי החיים שיכולים להיות מגורה בו-זמנית, לעומת זאת, יהיה מוגבל על ידי כוח האור המקסימאלי שניתן להשיג בכל קצה סיב. כוח תפוקה מקסימלית בקצה הסיב תלויה 1 הכח מתחיל) של הלייזר; 2) יעילות צימוד ו 3) מספר פיצולי קורה. לליזר כחול 100 mW עם ~ 80% יעילות צימוד ועד 4 פיצולי קרן (כמתואר באיור 4C), הספק ממוצע בקצה הסיב יכול לנוע בין 5-10 mW בעת שימוש 200 מיקרומטר ליבה, 0.22 מיתרי תיקון סיבי NA (Nb מצפה אובדן הולכה ממפרקים סיבוביים להיות &lt;15%). מדידת תפוקת אור בקצה הסיב היא חיונית לקביעת כוח אור מספיק להפעלת opsin כopsins שונה ברגישותם לאור ולכן צפיפות הספק האור (mW/ 2 מ&quot;מ) הנדרש להפעלה 11. לדוגמא, opsin צעד הפונקציה היציבה (SSFO) פועל כמצברי פוטון ולכן דורש כוח צפיפות מעט מאוד אור להפעלה (&lt;8 μW / מ&quot;מ 2) 8. תשווה את זה לרודופסין הערוץ המסורתי (ChR2) שדורש מינימום של 1 mW / 2 מ&quot;מ של אור כדי לעורר פוטנציאל פעולה 2. טבלת 1 מסופקת כהתייחסות מהירה לirradiances אור המינימום ידוע יידרש להפעיל opsins הנפוץ ביותר כיום ב להשתמש. לבסוף, יש לקחת בחשבון שמפזרים אור וסופג כשהוא עובר דרך רקמת המוח כך שהכח אור יותר נדרש למבנים מוחיים עמוקים יותר 3. משאב מקוון שימושי זמין <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">בhttp://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> אשר לחשב את עוצמת האור בעומקים שונים באמצעות רקמת מוח על ידי לקיחה בחשבון את גודל ליבת סיבים, צמצם מספרי, אורך גל של אור המשמש, וכוח האור מתחיל בקצה הסיב. לסקירה מצוינת של העקרונות התיאורטיים שבבסיס חישובים אלה, ראו אל Foutz et. (2012) 12. דוגמאות כיצד ליישם עקרונות אלה וחישובים לעיצוב ניסיוני הם הפגינו באל Aravanis et. (2007) 3 וטיי et al. (2012) 13. ביצוע חישובים אלה לפני תחילת ניסוי הוא חיוני כדי להבטיח irradiance אור מספיק להפעלת opsin. בהתחשב בשיקולים אלה, זה יתרון לרכוש לייזרים מופעלים גבוהה יותר כדי להבטיח פלט כוח מתאים. לייזרים עם תפוקת חשמל בין 100-200 mW הם בדרך כלל מספיק כדי לפצות על סיבים קטנים ליבה, פיצול סיבים מרובה, חוסר יעילות צימוד ושידור מאבד 7. אם אתם משתמשים בלייזרים בהספק גבוהים, לעומת זאת, יש להקפיד כדי למנוע נזק עצבי או חום והאור-עמיתממצאי ד שעלול להתרחש עם ממושכת ו / או גבוהה תאורת אור מופעל 7. טווח בטוח לניסויי in vivo הוא עד 75 mW / 2 מ&quot;מ. 14 החלטה על הסוג של לייזר לרכישה יכולה להיות עניין מסובך כמו שיש גורמים שצריכים להתחשב. לדוגמא, דיודות לייזר ישיר לספק פלט פעם יותר יציב ודיר מאשר מצב מוצק לייזרים-נשאב דיודה (DPSS), ובם אמינות יותר לאורך הזמן בסביבת מעבדה. בחלק מהמקרים, עם זאת, לייזרי דיודה פולטים ישירים עלולים כוח אור נמוך, ~ 0.1 mW, גם כאשר מתח הפקודה הוא 0 V בשל הטיה קבועה נוכחית שנשלחו לדיודה על ידי האלקטרוניקה השליטה של ​​הלייזר. יש פליטה &#39;ספונטנית&#39; זה ספקטרום רחב יותר מאשר פליטת לייזר מאותה הלייזר, כך ניתן לצמצם באופן ספציפי על ידי התקנת להקה עוברת צר (או &#39;ניקוי&#39;) מסנן בין הלייזר והמצמד (ראה רשימת חלקים). מסנן זה גם יהיהלהפחית את תפוקת חשמל על ידי ~ 50% כאשר lasing, כך לרכוש לייזר מופעל גבוהה יותר בהתאם. יש לציין כי לייזרי DPSS צהובים רגישים במיוחד ועשויים להתנהג באופן לא סדיר וצמצמו את תוחלת חיים אם מווסת במהירות על ידי מחולל פעימות. התאמה של כוח הלייזר צהוב צריך להיעשות באמצעות גלגלי מסנן צפיפות חיצוניים ממוקמים בנתיב הקרן (סעיף 1.7) בעת הפעלת הלייזר בTTL + מצב. לחלופין, רכישת לייזר DPSS ננומטר ירוק 532 היא חלופה חסכונית שניתן להפעיל את שניהם halorhodopsins וarchaerhodopsins. הצמצם המספרי (NA) של סיבים חשוב לשקול בעת תכנון ורכישת רכיבי סיבים להגדרת הרכבה לייזר. NA של סיבים אופטיים קובע את הזוויות של קרני אור שיכול להתקבל ונפלט בקצה סיב. אם סיבים גבוהים-NA הוא הזדווגו לסיבים תחתון NA, אובדן משמעותי יתרחש בממשק ש, ולכן חשוב להיות עקבי wi<html> סיבי ה NA בתוך הגדרה אחת (או כדי להבטיח שNA מגדיל לאורך נתיב האור). ההשפעה של הסיבים NA בנפח של רקמת המוח המוארת היא פחות חשובה, שכן רקמת המוח היא מאוד פיזור, ומאחר שהאור בשילוב ממקור לייזר נוטה גבוהים NA סיבים &#39;underfill&#39;; סיבים אופטיים ואולם עם NA של 0.22 ו0.37 נמצאים בשימוש נפוץ. בדומה לכך, צימוד מגדול-ליבה לסיבים קטנות יותר ליבות יהיו גם לגרום להפסדים ניכרים, כך שתמיד הקפידו להשתמש בקטרי ליבת הגדלת או שווים כאשר מתקדמים ממקור הלייזר לשתל בעלי החיים. בנימה כללית, תמיד צריכים להיות כתרים קצות סיבים כאשר אינו בשימוש כדי למנוע אבק והצטברות חלקיקים. זה רעיון טוב באופן קבוע קצות סיבים נקיים ומחברים (70% אלכוהול איזופרופיל עובד היטב) כדי להבטיח פלט כוח האור מקסימאלי, וכדי לבדוק את כוח תפוקת אור באמצעות &#39;שתל דמה&#39; לפני תחילת הניסויים של כל יום. &quot;&gt; במהלך בדיקות התנהגותיות, קיים הכרח כי יש לנקוט בצעדים כדי לשלוט על ההשפעות של זיהום ויראלי, ביטוי חלבון אקסוגני, אור הנראה, ואת השפעות אפשריות חימום רקמות וחפצים על התנהגות בעלי חיים. לכן, קבוצת הבקרה הנאותה צריכה להיות מורכבת של בעלי חיים transduced עם וירוס שליטה (לדוגמא, GFP, EYFP, mCherry) שמקבל פרמטרים גירוי אור זהים. אימות ניסיוני היא שלב סופי מכריע כנתונים התנהגותיים המשמשים לניתוח תלוי לחלוטין בopsin הנכון ומיקום סיבים אופטי באזור של עניין . באופן ספציפי, בבעלי חיים שבו אין אות immunohistochemical מזוהה, או שבו מיקום של אות או סיבים הוא לא באזור של עניין, נתונים אז התנהגות לבעלי החיים שיש להסיר מהניסוי. בנוסף, זה הכרחי כדי לבדוק את תפוקת אור ב טיפ הסיבים הן לפני השתלה כירורגית ושוב שלאחר המוות, כדי להבטיח כוח האור מספיק להפעלת opsin. באנימהls שבו אובדן אור חמור התרחש באמצעות הסיבים לאחר ניסויים (&gt; 30%) 9, נתונים לבעלי החיים שיש לשקול להסרה. קריטריונים להסרת יש לקבוע מראש. לבסוף, יש לקחת בחשבון את תדירות הדופק נדרשת לווסת ירי עצבי, אשר יהיו תלויה במבנה המוח ותת-סוגים עצביים ממוקדים. פרמטרים גירוי אור פורסם optogenetic קיימים תת-סוגים עצביים מרובים, עם זאת, את היכולת לווסת את הירי עצבי צריכה להיות מאושר באופן עצמאי באמצעות in vivo או קלטות אלקטרו פרוסת המוח. כאחד הופך מיומן בשימוש בלייזר ושינוי של הגדרה קופצים לייזר, שילובים של אורכי גל שונים יכולים להיות קשורים לסיבים מרובים על בעלי חיים בודדים או נמסרו במורד אותו הסיב לoptogenetics קומבינטורית 8. גירוי רב-גל יהפוך חשוב יותר ויותר בהתחשב בהתפתחות המהירה של אדום-משמרתed channelrhodopsins 8, ההנדסה של opsins hyperpolarizing העביר הכחול 15, השימוש בopsins צעד פונקצית bistable 8,16,17, ורשימת הרחבת הכללית של opsins עם ספקטרום הפעלה שונה 11. הרחבה זו של ארגז הכלים optogenetic תאפשר שליטה חסרת תקדים של תת-סוגים עצביים מרובים בתוך ועל פני אזורים במוח כדי לקבוע את תפקידם בשלטון מדינות התנהגות מורכבת.

Optogenetics יש מהפכה במדעי מוח ברמת מערכות בחיפוש שלה לרכיבי מעגל העצביים נהיגה מדינות התנהגות נורמלית ומחלה-רלוונטית. הגילוי שopsins חיידקים רגיש לאור 1 יכול לבוא לידי ביטוי מבחינה תפקודית בתאי יונקים סיפק את הפלטפורמה לשימוש באור כדי לקבל שליטה חסרת תקדים של פעילות עצבית בדייקנות מרחב ובזמן גבוהה 2. שלא כמו גישות אלקטרו או תרופתיות מסורתיות למניפולציה של פעילות עצבית, optogenetics מאפשר שליטה של ​​סוגי תאים מסוימים (על פי תחזית גנטית לזהות או מרחבית) בתוך אוכלוסיות הטרוגניות ובלוחות זמנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. המבוא הבא של ממשק עצבי-אופטי הניתן כלי מעשי למסירה של אור למתנהג בעלי חיים 3. זו אפשרה לאפנון של מעגלים עצביים מוגדרים במכרסמים מתנהגים ער בזמן אמת על מנת לבדוק קשר סיבתיתפקיד של מעגלים העצביים אלה בממשל של מדינות התנהגות רלוונטיות למחלה נוירולוגית והפסיכיאטרית 4-6. Optogenetics, לכן, מהווה כלי רב עוצמה להקדמה לכל מעבדה מעוניינת לחקור את הקשר הפונקציונלי בין פעילות המוח ואמצעים התנהגותיים או פיסיולוגיים במודלים של בעלי חיים. עיצוב והשלמה מוצלחים של ניסוי optogenetic כרוך בפעולות שונות ושיקולים (ראה איור 1). המטרה של הפרוטוקול הנוכחי היא לספק לאנשים את הכלים והרכיבים, יחד עם הידע התיאורטי ומעשי, יש צורך לבצע גירוי optogenetic במכרסמים מתנהגים ער. נכון לעכשיו, יש שני טווחי אורך גל דומיננטיים המשמשים להפעלת ערוצי opsin חיידקים: בספקטרום הכחול (בדרך כלל 473 ננומטר) וספקטרום ירוק-צהוב (בדרך כלל 532 או 591 ננומטר). לייזרים ודיודות פולטות אור (LEDs) שניהם יכולים לשמש כמקורות אור לדeliver אורכי גל מסוים של אור לרקמת מוח. האור שאינו קוהרנטית הנפלט על ידי נוריות, לעומת זאת, עושה העברת יעילה של אור קשה כאשר צימוד לתוך סיבי ליבה הקטנים הנדרשים לin vivo גירוי מכרסמים. החלטה על ההרכבה הלייזר המתאימה היא צעד ראשון חיוני ויהיו תלויה בשימוש המיועד של optogenetics במעבדה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שתי תצורות בסיסיות שונות בקלותם של הרכבה ושימוש: לייזרים מצמידים מראש אחת ומערכות לייזר כפול (ראה איור 2). מערכות לייזר יחידים שהם מצמידים מראש על ידי היצרן הן בעצם מוכנות לללכת עם הגעה עם לא מעט הגדרה הנדרשת, אבל יש לי החסרון של התאמה אישית של משתמש הקצה מינימאלית. מערכת לייזר כפולה מאפשרת משלוח של שני אורכי גל שונים במורד אותו הסיב. זה יהיה חשוב יותר ויותר עם כניסתו של optogenetics קומבינטורית לפי ניתן להשתמש באורכי גל שונים כדי להפעיל / לעכב distincסוגי תאי T שהם מרחבית-מקומי במשותף. זה חיוני גם לשימוש עם opsins פונקציה דו-יציב צעד שבו photocurrents הם יזמו והופסק על ידי אור כחול וצהוב, בהתאמה 7,8. מערכות לייזר כפולה הן גם להתאמה אישית כמשתמש יכול להוסיף או להסיר רכיבים (לדוגמא, תריסים חיצוניים, מסנני קרן, מטרים כוח מוטבע) מנתיב הקרן כנדרש. בשל צדדיות שלה, הגדרת הלייזר הכפול מומלצת אם optogenetics הולכת להיות כלי המשיך בשימוש במעבדה. צימוד של הלייזרים, לעומת זאת, יכול להוות אתגר וכך מנגנון צימוד מהיר, קל, ואמין מסופק בפרוטוקול זה. שים לב, פרוטוקול זה מפרט את ההרכבה של רכיבים אופטיים ומנצל מיתרי תיקון ורכיבים שאינם מותאמים לסיבי multimode צעד-מדד עם ליבה 200 מיקרומטר וצמצם מספרי (NA) של 0.22. גדלי ליבה שונים וNA זמינים לרכישה, אולם כל הרכיבים רצוי להתאים במונחים של ליבהגודל וNA כדי למנוע אובדן אור בנקודות חיבור סיב. לחלופין, בחיבור סיב, אור יכול לעבור מקטן לגודל ליבה גדול יותר; ו / או מנמוך-NA לסיבי NA-גבוהים ללא הפסד נוסף. אסטרטגיות קשירה מסופקות המאפשרות גירוי בו זמנית של עכברים מרובים עבור בדיקות התנהגותיות תפוקה גבוהה. הפרוטוקולים הניתנים להניח שימוש בסיבים מושתלים כרוניים לבדיקות התנהגותיות אבל יכולים להיות שונה עבור פרוטוקולי גירוי חריפים. סיבים מושתלים בחריפות הם יתרון לשילוב גירוי optogenetic עם מניפולציה תרופתית, מאז אותו הצינורית יכולה לשמש כדי לספק תרופות וקצה סיב אופטי לאותו מיקום. השימוש בסיבים כרוניים מושתלים הוא, עם זאת, מומלץ מאוד לבדיקות התנהגותיות מרובה-יום כפי שהיא מקטינה את ניזק לרקמות הקשורים להכנסה וההסרה חוזרות ונשנות של סיבים, ומגבירה את דיוק במונחים של מיקום העקבי של סיבים לרקמת תאורה 3. בשילוב עם תצורות הקשירה המתוארות כאן, התנהגות יכולה להיות מוקלטת באופן מהימן על פני מספר ימים. חודשים ואכן, העברת אור אמינה דווחה לאחר השתלת סיבים 9 כך שגירוי כרוני ופרדיגמות בדיקות התנהגותיות יכולים, באופן תיאורטי, יבוצעו על פני ימים ושבועות רבים. הערות נוספות על רכיבי חומרה נוספו לפרוטוקול, כדי לאפשר בחירת הקורא במוצר הטוב ביותר שיתאים לצרכימים האישיים שלהם, כוללים חלופות חסכוניות ומוצרים שניתן לעשות בבית. טיפים חשובים כי הם שימושיים במהלך התקנה והיישום גם מסופקים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">1. Laser Set-up</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , &#60;2% Stability</td>
			<td style="width:59px;">Omicron</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">Luxx/Phoxx 473/488-100</td>
			<td style="width:245px;">Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">100mW 594nm DPSS laser</td>
			<td style="width:59px;">Colbolt</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0594-04-01-0100-300</td>
			<td style="width:245px;">04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability</td>
			<td style="width:59px;">Shanghai Lasers</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">GL532T3-200</td>
			<td style="width:245px;">Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Non-contact style laser to multimode fiber coupler&#160;</td>
			<td style="width:59px;">OZ Optics</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td>
			<td style="width:245px;">For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 12&#34; x 18&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1213</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 10&#34; x 12&#34; x 1/2&#34;. 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1012</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 4&#34; x 6&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">MB4</td>
			<td style="width:245px;">For blue laser; dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact variable height clamp, 1/4&#34;-20 Tapped</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">CL3</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">3/4&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TR075</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">TR1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">PH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Pedestal Base Adapter</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BE1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Small Clamping Fork</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">CF125</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics with visible laser quality mirror</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">KM100-E02</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Neutral filter density wheel</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">NDC-50C-2M</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; Longpass dichroic mirror 50%</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DMLP505</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">KM100</td>
			<td style="width:245px;">For dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">20-piece hex wrench kit with stand</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TC2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1/4&#34;-20 cap screw and hardware kit</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HW-KIT2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Mounting base 1&#34; x 2.3&#34;x3/8&#34;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">BA1S</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">ADAFCB1</td>
			<td style="width:245px;">Dual FC/PC L-bracket also available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Breadboard lifting handles</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BBH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">&#216;1&#34; Bandpass Filter, CWL = 450 &#177; 2 nm, FWHM = 10 &#177; 2 nm</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FB450-10</td>
			<td style="width:245px;">For use with diode lasers that spontaneously emit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">2. Laser Coupling</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">! Laser protective eyewear</td>
			<td style="width:59px;">Various</td>
			<td style="width:65px;">One for every user at each wavelength</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;">! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Fiber optic cable tester</td>
			<td style="width:59px;">Eclipse</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">902-186N</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">One-step fiber connector cleaner</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FBC1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.75 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.5 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode&#160;</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Doric mini cube</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">DMC_1x2_FC-2FC</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact power and energy meter console</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">PM100D</td>
			<td style="width:245px;">Digital 4&#34; LCD</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">C-series slim power sensor 5-500mW</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">S130C&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Multiple detectors types are available; check with vendor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">3. In vivo Optogenetic Stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Multimode fiber splitters</td>
			<td style="width:59px;">FONT Canada</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Arbitrary waveform function generator (2 channel)</td>
			<td style="width:59px;">Rigol</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DG1022</td>
			<td style="width:245px;">Can control up to 2 lasers at once</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Fiber optic rotary joint (commutator)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC*</td>
			<td style="width:65px;">6 to 8</td>
			<td style="width:127px;">FRJ_1X1_FC-FC</td>
			<td style="width:245px;">*Also available through Thorlabs and Prizmatix</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:304px;">Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">8</td>
			<td style="width:127px;">MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg)</td>
			<td style="width:59px;">Precision fiber Products</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">SM-CS1140S</td>
			<td style="width:245px;">Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Clear dust caps for &#216;2.5 mm ferrules (25/pkg)&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">CAPF</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">CAPF1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">Thick-jacketed patch cords (custom order)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

תוצאות התנהגות שהושגו עם in vivo גירוי optogenetic הן תלויות לחלוטין במעגלים העצביים ממוקדים, מודל החיה בשימוש, ופרמטרי האפנון. למטרות הנוכחיות הפגנתיות, נוירונים דופאמין באזור tegmental הגחון, או VTA, של hydroxylase טירוזין :: עכברי Cre היו transduced עם opsin צעד פונקציה יציבה (SSFO) 8, או וירוס שליטה (EYFP), ושתל סיבים היה כרוני מושתל. השימוש בעכברים הטרנסגניים TH :: Cre מבטיח כי opsin ביטוי מוגבל לTH + תאים (דופמין) בVTA. איור 7 מציגים תוצאות התנהגות נציג שהושגו באמצעות הגדרת הלייזר תיארה הנוכחית לגירוי בו זמנית של עכברים מרובים. כאן, עכברים היו קשורים ומגורה באותו הזמן באמצעות לייזרים נפרדים (3 עכברים / לייזר כמו באיור 4C) והתנהגות של תנועה נרשמה עבור שעה 1. גירוי חוזר ונשנה של תאי עצב דופמין בVTA הביאפנוטיפ היפראקטיבי שנמשך לאורך זמן גירוי. אין שינוי בהתנהגות של תנועה נתפס בעכברי EYFP (ראה וידאו 1). בעקבות בדיקות התנהגותיות, אימונוהיסטוכימיה בוצעה כדי לוודא מיקוד נגיפי מדויק לנוירונים VTA דופמין ומיקום סיבים חזותי אושרו (ראה איור 7). <img alt="איור 1" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig1highres.jpg" /> איור 1. צעדים ניסיוניים עבור in vivo גירוי optogenetic. יש מעורבים בעת תכנון וביצוע בגירוי optogenetic vivo ארבעה צעדים כלליים. פרוטוקול זה במיוחד מפרט את השלבים כרוכים במשלוח של אור ממקור אור הלייזר למבני מוח עמוקים במכרסם מתנהג וכולל 1) הרכבה מערכת לייזר וצימוד אור; 2) אסטרטגיות קשירה לגonnecting בעלי חיים רבים למקור אור לבדיקת התנהגות תפוקה גבוהה ו 3) מספק הנחיות כדי לאשר את אסטרטגית מיקוד למסירת אור - צעד חיוני לפרשנות הנתונים. הערה: למרות שפרוטוקול זה אינו בלעדי לסיבים מושתלים כרוניים למטרות קשירה, מומלץ והניח בעת שילוב גירוי optogenetic עם בדיקות התנהגותיות. ראה גם Ung &amp; Arenkiel, 2012 18 וספרטה et al., 2012 9 לייצור והשתלה של סיבים אופטיים כרוניים בבית. קווים מוצקים = ​​צעדים מכוסים בפרוטוקול זה. <img alt="איור 2" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig2highres.jpg" /> 2. מערכות איור לייזר המשמשות לin vivo גירוי optogenetic. () מערכת לייזר יחידה לגירוי in vivo. לייזר זה ph<html> ysically מראש בשילוב על ידי יצרן ודורש הגדרת משתמש קצה קטנה. מערכת לייזר (B) כפולה. שני לייזרים הם מצמידים לסיב בודד באמצעות מראות הפועלות לנווט כל נתיב קרן למצמד סגנון ללא מגע. זה הגדרה כפי שניתן להסיר רכיבים אופטיים או להוסיף לפי צורך, אבל מציג יותר אתגר במונחים של צימוד לייזר יעיל. (ג) סכמטי ביותר צדדי של מערכת לייזר כפולה מוצגת ב( B) המיקום המציין של לייזרים ומראות עם נתיב קרן אור הלייזר המקביל (חיצים) מתואר. הנה, ראי dichroic &quot;D&quot; משמש כדי להסיט אורכי גל כחולים של אור תוך העברת אורכי גל צהוב ועד ל&quot; C &quot;המצמד ולתיקון כבל מצמד המצורף. B = לייזר כחול; C = מצמד סגנון ללא מגע; D = מראה dichroic; גלגל = מסנן FW; M = Mirror; Y = לייזר צהוב.תקבל = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig3highres.jpg" /> איור 3. בודק כבל () משמש בפרוטוקול הצימוד שאינו פיזי תחתון:. בודק כבל מחובר ישירות לכבל תיקון. הכנס מתאר נקודת הבוחן לכבל חיבור חוטי תיקון (B) המכונים בכל פרוטוקול מחיצוני לפנימיים:.. מפצל סיבי Multimode, סוף החוט השחור במעייל בעלי החיים תיקון שרוול zirconia פיצול לבן הצמוד לדירה-קליב (FC), כבל עבה במעייל תיקון (המכונה גם &quot;כבל מצמד&quot;). מיתרי תיקון עבים במעייל מצופים בפוליוויניל כלוריד צינורות (PVC) עבור הגנה נוספת. לכבלים אלה, קודי צבע סטנדרטיים בתעשייה משמשים להבחין בין סוגי סיבים שונים, שבו כתומים = סיבים רבים. מיתרי תיקון בעלי החיים הם<html> במעייל דק יותר, כדי לאפשר גמישות לתנועת בעלי החיים במהלך בדיקות התנהגותיות. הערה אבק שכובעים מונחים על FC / PC מסתיים כאשר כבלים אינם בשימוש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig4highres.jpg" /> איור 4. אסטרטגיות קשירה לגירוי optogenetic in vivo של () חיה אחת, (ב) שני בעלי חיים; . תצורות אפשריות (C) שלושה או ארבעה בעלי חיים אינן מוגבלות לאלה שהוצגו לעיל - תצורות מרובות אפשריות באמצעות שילוב הייחודי של מתאמים, מפצלי סיבים, וחוטי תיקון הסתעפות כי הם זמינים באופן מסחרי או על ידי סדר מותאם אישית. הערה: מיתרי תיקון ומפצלי סיבים מכילים מחברים / PC FC בשני הקצוות (רק אחד הסוף מתואר).&quot;Target =&quot; ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig5highres.jpg" /> איור 5. חיבור נכון ולא נכון (x האדום) של תיקון כבל לסיבים אופטיים להשתלה באמצעות מפוצל שרוול. (פנל משמאל) zirconia מפוצל השרוול משמש לחיבור כבל תיקון לטבעת חזוק של אופטי מושתל סיבים (שמוצג כאן לא מודבקת בעלי חיים). מצביע חץ נקודת החיבור בין כבל התיקון וסיבים האופטיים להשתלה. השוואה ל( פנל מימין) שבו קיים פער בין תיקון הכבל וסיבים האופטיים מושתל, כמו דמיינו באמצעות הפיצול של שרוול החיבור. שים לב לזליגת האור שעלול להתרחש עם חיבור לא תקין (מימין למטה). הכנס תחתון על upper פנל מהשמאל מתאר רכיבים בודדים בשימוש. מלמעלה עד למטה של כנס: צינורית סיבים אופטי מושתלת דוריים, zirconia מפוצל שרוול לבן, (כבל מלא תיקון מתואר באיור 3) סוף שטוח Cleeve (FC) של תיקון כבל בעלי חיים במעיילים שחור. בכל הלוחות, לציין כי שרוול החיבור הוא לא מיושר עם קצה FC של תיקון הכבל. השאר ~ 0.5 סנטימטר של לחיבור לסיבים האופטיים להשתלה מודבקת לחיה-לתלות מעל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig6highres.jpg" /> צד איור 6. (משמאל) וקדמי תצוגה (מימין) של עכבר עם סיבים אופטיים מושתל מחובר לכבל תיקון. השתמש בפיצול על שרוול חיבור כדי לעזור לדמיין חיבור נכון של t תיקון הכבלo טבעת חזוק של סיבים אופטיים שהושתל. נקודת החיבור מודגשת על ידי תיבה מקווקות אדומה וגם מתוארת בעלון העליון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig7highres.jpg" /> איור 7. נציגי תוצאות. (משמאל) קריאת התנהגות של in vivo גירוי optogenetic. דוגמא להתנהגות שניתן להשיג באמצעות הגדרת הלייזר תאר ופרוטוקול קשירה. הפעילות של תנועה נרשמה במהלך גירוי optogenetic של אזור tegmental הגחון (VTA) בhydroxylase טירוזין (TH) :: עכברי Cre (n = 7-8 / קבוצה) transduced עם או opsin צעד-פונקציה (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) או וירוס שליטה (AAV5-DIO-EYFP) בVTA. קבוצות של שלושה עכברים קשורים בו-זמנית ליחידלייזר כמתואר באיור 4C ומגורה עם דופק 5 שניות של 447 או 473 ננומטר אור מועבר פעם אחת כל 15 דקות. מדידות חוזרות דו-כיווניות ANOVA גילו אינטראקציה קבוצה משמעותית זמן x (F = 3,39 15.27, p &lt;0.0001) והשפעה העיקרית משמעותית של זמן (F 3,39 = 4.67, p = 0.007) לפיה גירוי optogenetic מוגבר פעילות של התנועה רק בעכברי SSFO (עמ &#39;פוסט הוק-Bonferroni &lt;0.0001, ביחס לt = 0-15 בן זמן) וכתוצאה מכך גידול הכולל בפעילות של תנועה בהשוואה לעכברי EYFP (השפעה העיקרית של קבוצה: F = 1,39 10.69, p = .0061; P Bonferroni פוסט הוק-&lt;0.01 בt = 15-30 וp &lt;0.001 בזמן t = 30 - 45 וt = 45 - 60). מפרט סיבים: 200 מיקרומטר ליבה, 0.22 NA. irradiance = 6 אור - 66 mW / 2 מ&quot;מ, מתאים למרחק קצה סיב של 0.1-0.6 מ&quot;מ מאתר הזרקה נגיפי עם כוח אור 5 mW נפלט בקצה סיב לפני הקשירה. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע. EYFP<html> לעומת SSFO: ** p &lt;0.01; *** P &lt;0.001; השפעת זמן: p #### &lt;0.0001 (מימין) אישור היסטולוגית של מיקום נגיפי וסיבים אופטיים.. תמונת הקרינה Confocal נרכשה על מיקרוסקופ לייזר סריקת SP5 Leica TCS שימשה לדמיין מיקום סיבים (מקווקו-line) וביטוי בתיווך נגיפי (ירוקה) באזור tegmental הגחון העכבר הבא in vivo גירוי optogenetic. נוירונים דופאמין (TH +) נראים בכחול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> וידאו 1. בגירוי optogenetic vivo:. היפראקטיביות במהלך גירוי VTA באמצעות SSFO בעכברי TH :: Cre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/JOVE_video_1.mov" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a> <table border="0" cellpadding="0" cells</html style=";text-align:right;direction:rtl">צעדה = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="5"> 1. irradiances אור השולחן יידרש להפעיל opsins נפוץ. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Opsin Variant </td><td rowspan="2"> λ </td><td rowspan="2"> צפיפות הספק (/ 2 מ&quot;מ) </td><td></td><td rowspan="2"> מאפיינים </td></tr><tr><td> הפעלה / הכיבוי קינטיקס </td></tr><tr><td colspan="5"> עירור אופטי: channelrhodopsins המהיר-משחק </td></tr><tr><td> ChR2 2 </td><td> 470 </td><td> 1 - 5mW </td><td> 1.21 אלפיות שניים / 12 </td><td> שריפות עד 40 הרץ </td></tr><tr><td> ChETA 19 </td><td> 490 </td><td> 5 mW </td><td> 0.86 / 8.5 msec </td><td> שריפות עד 200 הרץ </td></tr><tr><td> ראש 20 </td><td> 450 </td><td> 1.65 mW </td><td> 1.62 אלפיות שניים / 12 </td><td> צורה הלא מרדים של ChR2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> C1V 18 </td><td rowspan="2"> 540-630 </td><td> 8 mW (540nm) </td><td> 5/34 אלפיות שניים על 540nm </td><td rowspan="2"> עבר-אדום </td></tr><tr><td> 3.2 mW (630nm) </td><td> 67 אלפיות שני (על) ב630nm </td></tr><tr><td colspan="5"> עירור אופטי: rhodopsins ערוץ איטי-הפועל </td></tr><tr><td> opsin פונקצית צעד היציב (SFO) 8 </td><td> 470/590 </td><td> 8 μW (470nm) </td><td> 20 msec דקות / 29 </td><td> גרסת SFO חדשה; מדינה כבר פתוחה. נפתח על-ידי 470 ננומטר, נסגר על ידי 590 ננומטר </td></tr><tr><td colspan="4"> עיכוב אופטי </td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> eNpHR3.0 21 </td><td rowspan="2"> 560-630 </td><td rowspan="2"> 3 - 5 mW </td><td rowspan="2"> 2.5 msec / &lt;10 אלפיות שני </td><td> עיכוב מתמשך למשך 30 דקות 22 עם אור קבוע * </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 11 ArchT3.0, 23 </td><td> 520-560 </td><td> 1 - 5 mW </td><td> 2 / &lt;10 אלפיות שניים </td><td> יותר רגיש עם photocurrents גדול מeNpHR3.0 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td colspan="5"> לוח זה ניתן כמדריך בלבד; irradiances אור הספציפי הנדרש לאפנון עצבי צריך להיות מאושר באופן עצמאי. </td></tr><tr><td colspan="5"> אימות ניסיוני חשוב לוודא שopsin, אסטרטגית מיקוד, ופרמטרי גירוי אור לווסת ירי עצבי באופן שהתכוון 5. </td></tr><tr><td colspan="5"> צפיפות הספק (mW / 2 מ&quot;מ) מתייחסת לכוחו של האור האיר על שטח נתון של רקמת המוח ואינו מתייחסת לכוח האור הנפלט מקצה הסיב. </td></tr><tr><td colspan="5"> * תמיד להשתמש בעוצמת האור הנמוכה ביותר האפשרי, במיוחד עם גירוי אור ממושך. </td></tr></tbody></table> 1. irradiances אור השולחן יידרש להפעיל opsins נפוץ. קיצורים AAV = וירוס adeno הקשורים = DPSS מצב מוצק-נשאב דיודה <br/&gt; חלבון ניאון צהוב EYFP = משופר FC / PC = תדבק שטוח / מגע פיזי GFP = חלבון ניאון ירוק מלח = פוספט שנאגרו PBS PVC = פוליוויניל כלוריד mW = milliwatt NA = צמצם מספרי SSFO = opsin צעד פונקציה היציב TH = hydroxylase טירוזין היגיון = טרנזיסטור-טרנזיסטור TTL V = מתח VTA = אזור tegmental הגחון

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System at JoVE.com

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

in-vivo-optogenetic-stimulation-of-the-rodent-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

58.9K Views.  University of Pittsburgh Medical Center. Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Video: In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

תרופות משלוח מערכתית מקומי לטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית מודלים מכרסמים

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

עצב הראייה חיתוך רוחב: מודל של אפופטוזיס Neuron למבוגרים במערכת העצבים המרכזית

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...