הפרוטוקול הנוכחי תורם לחקר המנגנונים המוחיים העומדים בבסיס ההתנהגות המוטורית המיומנת. אופטוגנטיקה אלחוטית מאפשרת מניפולציה של נוירונים ספציפיים בזמן שהנבדקים מבצעים משימה בתנועה חופשית. בשילוב עם וידאוגרפיה במהירות גבוהה, ניתן לקבל ניתוח מפורט של התנהגות מוטורית עדינה.
השיטה יכולה לעזור להבין בעיות מוטוריות בהפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות. ניתן להשתמש בטכניקות אלה כדי לחקור את תפקוד המוח גם בפרדיגמות התנהגותיות אחרות. דיאנה רודריגז-מוניוז, סטודנטית לתואר ראשון מהמעבדה שלי, תסייע בניסוי.
עבור ההליכים הכירורגיים, התחל על ידי הכנת צינורית LED באורך הרצוי על פי הקואורדינטות הגביות-גחוניות של מבנה העניין. לשם כך, חותכים את סיבי הזכוכית לאורך ארוך יותר מהגודל הסופי הרצוי וטוחנים את קצה הסיבים לאורך המטרה באמצעות נייר זכוכית מחוספס. לאחר מכן, יש ללטש את קצה הסיבים בנייר זכוכית עדין.
עבור microinjections, למלא פיפטה עם שמן מינרלי ולהניח את פיפטה ב microinjector. ודא שהמיקרו-גנרטור פועל כראוי על ידי הזרקת מעט שמן מינרלי. לאחר מכן, להכין את העכבר המרדים לניתוח על ידי החלת משחת עיניים והסרת שיער מהקרקפת עם גוזם וקרם להסרת שיער.
לאחר מכן, נגבו את הקרקפת עם צמר גפן עם 8% יוד פובידון ו-70% אתנול לסירוגין שלוש פעמים כל אחת. לאחר החיטוי, הניחו את העכבר במנגנון הסטריאוטקסי ואבטחו את הראש, תוך הקפדה על כך שהגולגולת תיישר בצירים המדיאליים-רוחביים והקדמיים-אחוריים. השתמשו באזמל כדי לבצע חתך של סנטימטר אחד דרך הקרקפת ברמת העיניים לאורך ציר הסגיטלי.
לאחר מכן, נסוגו מהעור כדי לחשוף את הגולגולת ונקו את הפריוסטאום עם צמר גפן. נקו את משטח הגולגולת בעזרת תמיסת מלח ומטושים מכותנה ופתרו כל דימום על פני השטח באמצעות חניתות עיניים סופגות סטריליות. לאחר מכן, יש למרוח טיפה של 2.5% מי חמצן עם ספוגית צמר גפן ולתת לו לפעול במשך כמה שניות כדי להפוך את תפרי הגולגולת לגלויים ויש להם התייחסות טובה יותר.
לאחר מספר שניות, יש לנקות את האזור ביסודיות בעזרת צמר גפן נקייה. עם פיפטת זכוכית בקוטר קצה סופי של 15 מיקרון, אתרו את ברגמה ולמבדה כדי לבדוק שהגולגולת מפולסת בציר הקדמי-אחורי. לאחר מכן, ציירו נקודת ייחוס בקרקפת מעל הקואורדינטות שנבחרו באמצעות סמן.
בנקודת הייחוס, בצע גולגולת בקוטר מילימטר אחד המפעיל לחץ עדין על הגולגולת עם כלי סיבובי במהירות נמוכה עד בינונית עם מקדחה דנטלית קטנה ועגולה. לאחר שתסיים, הזז את הנימים לכיוון הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות שנבחרו, או AP, והקואורדינטות המדיאליות-רוחביות, או ML. טען את הנימים עם 300 עד 400 ננו-ליטרים של הנגיף הקשור ל-CreE הקשור לאדנו, או AAV, כגון AAV1, D-flox channelrhodopsin mCherry כדי להביע channelrhodopsin באזור העניין.
AAV יכול לשמש כבקרה לביטוי חלבון הכתב. לאחר שווידאתם כי הקצה אינו סתום, הציגו את פיפטת הזכוכית במוח בקואורדינטות הגב-גחון מינוס 3.35 מילימטרים בסטריאטום הגבי-רוחבי והזיקו 200 ננוליטרים של הנגיף באמצעות מזרק אוטומטי בקצב של 23 ננוליטרים בשנייה. יש להמתין 10 דקות לאחר ההזרקה לפני שתמשכו את פיפטת הזכוכית באיטיות כדי למנוע שפיכה.
לאחר מכן, נקו ויבשו את כל השאריות עם צמר גפן. לאחר מכן, חברו את צינורית ה-LED מזכוכית לזרוע הסטריאוטקסית וכיילו את הקואורדינטות באמצעות bregma כהפניה. לאחר מכן, הכנס את הצינורית באיטיות כדי למנוע נזק לרקמות והניח אותה 100 מיקרומטר מעל אתר ההזרקה.
לאחר שצינורית ה-LED נמצאת במקומה, הוסיפו טיפה של 100 מיקרוליטרים של דבק רקמה בקצה הגולגולת. השתמשו במברשת סטרילית כדי למרוח תערובת מלט דנטלית טרייה שהוכנה סביב מחבר הצינורית לאט לאט, ובנו שכבות עד שהגולגולת מכוסה והמחבר מחובר היטב לגולגולת, מה שמשאיר את הפינים חופשיים לחלוטין. כאשר המלט מתייבש לחלוטין, סגרו את העור סביב השתל באמצעות דבק רקמה.
לאחר מכן, הניחו את העכבר בכלוב התאוששות מעל כרית חימום בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס תוך ניטור סימני אי נוחות או כאב. תעד את התנהגות החיה עם מצלמה רגילה ותצלם 30 עד 60 פריימים לשנייה מחזית החדר. ניתן להציב מראה מתחת לתא האימון בזווית של 45 מעלות כדי לעקוב אחר תנוחת החיה.
כאשר עכברים מתחילים להגיע לכדור, סובבו את צינורית ה-LED באופן ידני עם השלט הרחוק כדי לקבל גירוי רציף למשך הזמן שבו ההתנהגות מתבצעת למשך לא יותר משתי שניות. מכשיר הגירוי מפעיל נורית LED של 470 ננומטר בעוצמה בקצה של מילי-וואט אחד למילימטר מרובע. ההתנהגות המוטורית העדינה של החיה תחת מניפולציות אופטוגנטיות נחקרה במשימת ההגעה לתפיסה.
העכברים למדו לבצע את המשימה תוך מספר ימים והשיגו דיוק של יותר מ-55%, והגיעו למישור לאחר חמישה ימי אימונים. מסלול התנועות היה במעקב באמצעות וידאוגרפיה במהירות גבוהה, מה שאיפשר לנתח קינמטיקה. בוצעה ההערכה הניתנת לכימות של פרמטרים כגון מרחק נסיעה, מהירות, תאוצה, נקודת קצה ומסלול.
בניסויים שהוחמצו, העכברים התחילו את תנועת האחיזה רחוק יותר מהכדור מאשר מניסויי הפגיעה. בנוסף, טעויות היו קשורות באופן משמעותי לתנוחת העכבר, שהוכחה על ידי הבדלים בזווית הגוף במהלך ניסויי פגיעה והחמצה. ההפעלה הקונטרה-צדדית של דופמין D1 המבטאת נוירוני הקרנה קוצניים, או SPNs, הפחיתה את הצלחת האחיזה בהשוואה לתנאי הבקרה.
במהלך גירוי אופטוגנטי, מסלול הכפות גדל במרחק הנסיעה, מה שהוביל לחוסר היכולת לכוון את הכדור ולעלייה בסוג השגיאה הראשונית 1. ניתוח רכיבים עיקריים, או PCA, הראה כי כל מסלולי הניסויים במהלך הפעלת D1 SPNs קונטרלטרלית מופרדים באשכול כמעט ללא חפיפה עם אשכול הבקרה, מה שמעיד על דמיון נמוך. הפעלת ה-DSPNs בצד ה-ipsilateral הובילה לעלייה בפיזור המסלולים שהראה ניתוח PCA.
לפיכך, הפעלת D1 SPNs ipsilateral שינתה את מסלול ההגעה מבלי לשנות את התוצאה ההתנהגותית. בעת ביצוע פרוטוקול זה, הקפידו למקם את הצינורית בצורה נכונה כדי שלא תתנתק במהלך האימונים. ניתן להשתמש בשיטה זו בפרדיגמות התנהגותיות אחרות כדי לחקור התנהגות מוטורית, עיבוד חושי, למידה וזיכרון.
אופטוגנטיקה אלחוטית תאפשר לחקור את ההתנהגות הנטורליסטית ואת היסודות הנוירוביולוגיים שלה בנושאים הנעים בחופשיות אמיתית.
