עבודה זו נתמכה על ידי מדינת ניו יורק מחלקת בריאות (C026878). MS היה בחור ניו יורק לתאי גזע קרן-Druckenmiller. נתמך בחלקו על ידי מענק מחקר המס &#39;5-FY11-571 מהמצעד הפרוט קרן.

1. הכנת תאי Feeder שים לב שכל המגיבים המתוארים להלן צריכים להיות מוכנים בצורה סטרילית (ראה לוחות 1 ו 2). פרוטוקול זה מעסיק שורת תאי JK1 (Cell Biolabs, Inc, קטלוג # CBA-315) כמאכילים שהוא נגזר הפך לתאים בוגרים עכבר אשכים סומטיות וכבר תארו במקום אחר 3. שימו לב גם שכל הליכי בעלי החיים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות ותקנות מוסדיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> JK1 תאים יכולים להישמר בתרבות ובשמשו בהצלחה כמאכילים עד חלוף 39. תרבות JK1 תאים בצלחת 100 מ&quot;מ תא תרבות (BD פלקון, קטלוג # 353003) עם 10 מ&quot;ל של מדיום גידול מזין מסנן מעוקר-(DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי [FBS], 2 מ&quot;מ L-גלוטמין ואנטיביוטיקה). כשמגיעה למפגש התרבות 95%, לפצל את התאים 1:06 -1:10 יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסירו בינוני ממונו תא confluent JK1 מזיןשכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שכבת תאים פעם עם PBS בלי סידן ומגנזיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טריפסין מראש מחומם / EDTA, 1x (trypsin/0.53 mM EDTA 0.05%; קטלוג קורנינג Cellgro, # 25-051-CI), ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 5-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין עם נפח שווה של מדיום גידול מזין. איסוף תאים וסרכזת ב 300 XG למשך 5 דקות. Re-להשעות תאים במדיום גידול מזין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעייל צלחות רבות גם תא תרבות על ידי הוספת 0.4% פתרון ג&#39;לטין מספיק כדי לכסות היטב ומסירים אחרי 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת ~ 250 תאים למ&quot;מ 2 בצלחת תרבית תאי ג&#39;לטין המצופה (למשל בפורמט 48 היטב או 6-היטב). דגירת תרבות על 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תרבות בינונית מבארות. זהירות: כדי להשבית את גדילת תאים, להוסיף פתרון חדש של mitomycin-C ב 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל המדולל בDMEM לכל באר (200 μl למשל / גם לצלחת גם 48). Mitomycin-C היא רעילה. לטפל ולהיפטר ממנו בזהירות. לדגור על37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון mitomycin-C מתאים. לשטוף 3 פעמים עם DMEM לפני ציפוי תאי גזע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר DMEM מתאי מזין בארות ולהוסיף את המקור של תאי גזע (100 μl / גם של צלחת גם 48; ראה טבלה 3) מספיק כדי למנוע התייבשות של המאכילים במהלך passaging. הוסף SSCs באותו היום, כפי שיתואר להלן בסעיפי 3.1 או 3.4, באמצעות גדלים מצוינים של בארות המכילות מתקני האכלה. </li></ol> 2. התפרקות של רקמות אשך מאוס להשיג תאי ניבט תורם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשכי קציר מבוגרי עכבר בצורה סטרילית ולאחסן באופן זמני את האשכים בצלחת פטרי מכוסית (ללא נוזל הוסיף). המנה חייבת הניחה מייד על קרח כדי למנוע dessication ולשמור על כדאיויות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים עדינים סטריליים ומספרי קנס בברדס תרבית תאים, לעשות חתך רוחבי בalbuginea Tunica ללא חוצה את האשך (כלומר, לחתוך ~ ½ לחלוטין - ¾ מרחק through) ולהשתמש במלקחיים כדי לסחוט tubules seminiferous לפינה של הצלחת; Tunica נזרק ורקמות מצורפות. שמור על צלחת על קרח לאורך לשמור על רקמה מצוננת, ובכך השמירה על שלמותה ומניעת אידוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות לרכך tubules עם מספריים נאים של האביב לפחות 3 דקות לאשכים, תוך שמירה על צלחת על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את שהברים אבובית בצינור חרוטים 50 מ&quot;ל ולשטוף ב~ 40 מ&quot;ל של סרום שור% PBS / 1 מצונן אלבומין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 60 למשך 10 דקות כדי להפריד ברים אבובית מתאי זרע ופסולת. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור 15 מיליליטר חרוטים, resuspend גלול ב 3 מ&quot;ל לאשך של דיסוציאציה החיץ מראש התחמם (DMEM, טריפסין 0.05%, 0.03% סוג collagenase אני, שור אלבומין 80 U / מ&quot;ל של DNAse אני ו0.5% בסרום; ראה טבלה 2 לפרטים יותר ספציפיים של דיסוציאציה חיץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צינור החרוטים אופקיים במתלה בסט שייקר עד 150 סל&quot;ד על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות על מנת למקסםgitation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG ב 60 למשך 10 דקות לתאים יחידים נפרדים מגושי undissociated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הגלולה המכילים נתחים עד לשלב הבא. איסוף supernatant מהשלב 2.8 ולהוסיף DMEM/10% סרום 3 מיליליטר עוברים מבקרים לנטרל חיץ דיסוציאציה. הנח צינור על קרח באופן זמני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב 2.6-2.7 עם הגלולה הצילה מצעד 2.9 לנתחים מחדש לעכל שנותרו לאחר השלב 2.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של DMEM/10% FBS לנטרל חיץ דיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית recombine מצעד 2.11 עם השעית תא הציל מצעד 2.9. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במדיום בתאי גזע בנפח של 16 מ&quot;ל לזוג אשכים (ראה טבלה 3). </li></ol> 3. ציפוי של השעית תא אשכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מיליליטר צלחת של השעית תא להיטב בתאים מזינים 6-כן צלחת המכיל mitotically-להיכבות עם mitomycin-C ומקום בתא תרבות חממה ב 37 &amp;מעלות; C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות בינוניות, aspirate, להוסיף 2 מ&quot;ל בינוני טרי ולחזור לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 48 שעות, להוסיף 0.5 מ&quot;ל בינוני טריה בתאי גזע לכל באר ולחזור לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות, לאחר מכן להאכיל את התאים שלוש פעמים בשבוע לאחר מכן, כמפורט להלן עד מושבות גדולות, דיסקרטיות (&gt; 50 תאים) מופיעות (תוך 7 עד 21 ימים). להאכלה ראשון והשני בכל שבוע (למשל יום שני ויום רביעי) להסיר ~ 50% הבינוניים ולהוסיף 50% בחזרה על ידי נפח בינוני טריה. להאכלה שלישית (לדוגמא יום שישי), לשאוב כל המדיום ולהחליף עם 2 מ&quot;ל בינוני טריה. גישה זו מבוססת על הנימוק שהימנעות משינויים בינוניים מלאים ממזערת תנודות בריכוזים של אותות paracrine שמופרשים למדיום התרבות 9. </li></ol> 4. קטיף מושבה למעבר ראשון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ממושבות בארות המכילות להיות passaged ולהוסיף את מקור תאי גזע טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את המושבות באמצעות אובייקטיבי 10x. עם מיקרוסקופ מעט דה ממוקדת, מושבות SSC בקצה גם תופענה כגושים בהירים הומוגניים, מורכבים מהרבה תאי 11-12 קוטר מיקרומטר, שבם קשה או בלתי אפשרי להבחין בגבולות התא הבודדים, שכן התאים מופיע התמזג יחד (איור 1 א). מושבות ללא SSC עשויות להופיע כהות יותר, מפורטות יותר, או פחות הומוגני, ניתן להבחין בגבולות (איור 1 א, הבלעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה פיפטה 200 μl, עם סט pipetteman עד 50 μl, לקחת 1 עד בינוני מהבאר ולגרש להרטיב את הקצה. ואז, בעדינות לדחוף את המושבה עם הקצה לפני הנסיגה של 50 μl בינוני במהירות כדי לסלק את המושבה על ידי יניקה לקצה (1B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש את המדיום המכיל את המושבה לאחת גם בצלחת 48-גם מזין המכילה תאים מומתים עם 100 μl של מדיום תאי גזע (האיור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב4.3 ולהוסיף עד 8 מושבות לאותו גם בלי העולה על 500 μl לטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.3-4.5 להכין בארות נוספות של הצלחת גם 48 עם מושבות קטע אחד SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוולס יהיה מוכן לפצל ב7-14 ימים או אחרי גושים גדולים של עד 500 תאים צמחו (1D איור). </li></ol> 5. לאחר ההרחבה וPassaging של SSCs ידי טחינה דקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים בקטע אחד יש subcultured על מתקני האכלה טריים לאחר עד 14 יום בביחס פיצול של 01:02 ל3 הקטעים הראשונים ולאחר מכן 1:04-01:06 (כל 7 ימים) לאחר מכן כדלקמן. עדינות triturate מושבות off היטב למחצה confluent (למשל ~ 300.000 SSCs / היטב צלחת 6-היטב) עם טיפ 1 מיליליטר פיפטה ידי שטיפה בינונית על פני התאים. מושבות ניתן לראות ניתוק. יותר מדי כוח עם הזרם של נוזל יגרום לתאים מזינים בלתי רצויים לבוא גם ממנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים נכתשו בצינור וצנטריפוגה חרוטים ב 300 XG עבור5 דקות. הערה: צעד trypsinization ניתן להוסיף בבטחה כאן אם רצוי על ידי החוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות במדיום תאי גזע טרי על ידי pipetting יסודיות למעלה ולמטה כדי לשבש מושבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SSCs צלחת על תאים מזינים טרייה מומתים עם mitomycin-C כמתואר בסעיף 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את התאים שלוש פעמים בשבוע, כמפורט להלן. להאכלה ראשונה ושנייה (לדוגמא יום שני ורביעים) להוסיף 50% לפי נפח בינוני טריה. להאכלה שלישית (לדוגמא יום שישי), לשאוב כל המדיום ולהחליף עם 2 מ&quot;ל בינוני טריה. צלחות תהפוכנה confluent כעבור 7-10 ימים. תרבויות צריכות להיות מורכבות מתאים&gt; 98% ניבט (כלומר, תאים &lt;1% מזהמים גופניים) אחרי 5-7 קטעים, המבוססים על immunostaining (למשל באמצעות העכברי ניבטו תא סמן GCNA) כדי להבדיל תאי ניבט מתאים הסומטיים 10. הערה: שיטות אלו פותחו בעמידה בתקנות ובדרישות שנקבעו על ידי המכוןטיפול בבעלי חיים ואל הוועדה השתמש ב-Weill Cornell Medical College. </li></ol>

<ol>
	<li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells.">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li><li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125++germline+progenitors.">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li><li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells.">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li><li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines.">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+aging+is+detrimental+to+mouse+spermatogonial+stem+cell+function.">In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function.</a> Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).</li><li>Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+male+germ+line+stem+cells+in+mice.">Aging of male germ line stem cells in mice.</a> Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).</li><li>Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plzf+regulates+germline+progenitor+selfrenewal+by+opposing+mTORC1.">Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1.</a> Cell. 142, 468-479 (2010).</li><li>Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mouse+male+germ+line+stem+cells+in+vitro.">Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro.</a> Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).</li><li>Csaszar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells+by+automated+control+of+inhibitory+feedback+signaling.">Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling.</a> Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).</li><li>Enders, G. C., May, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+expression+of+a+mouse+germ+cell+nuclear+antigen+examined+from+embryonic+day+11+to+adult+in+male+and+female.">Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female.</a> 163, 331-340 (1994).</li><li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+in+mammals.">Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).</li><li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation.">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).</li><li>Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+Cell+Transplantation+and+Testis+Tissue+Xenografting+in+Mice.">Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice.</a> J. Vis. Exp. (60), e3545 (2012).</li><li>Arnold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2(+)+adult+stem+and+progenitor+cells+are+important+for+tissue+regeneration+and+survival+of+mice.">Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice.</a> Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).</li><li>Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+short-term+in+vitro+assay+for+mouse+spermatogonial+stem+cells.">Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).</li></ol>

MS מקבל תמלוגים ממכללה רפואית ווייל קורנל דרך רישיון לסלולרי Biolabs, Inc להפיץ JK1 תאים.

שיטה זו להפקת SSCs המבוגר באמצעות תאים מזינים המופקים מאשך למבוגרים היא חזקה והצליחה כאשר רקע גנטי משותף (למשל FVB, C57Bl6 ו129SV/C57Bl/6 המעורב) וזנים מוטנטים שונים הועסקו 2,3,7,14. למעשה, microenvironment נוצר על ידי מערכת התרבות הוא מספיק כדי להתגבר על כמה מהמחסומים הגנטיים לשמ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> קורנינג </td><td> 10-013 </td><td> Diluent לניתוק חיץ </td></tr><tr><td> טריפסין / EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-051-CI </td><td></td></tr><tr><td> בינוני בסיס תאי גזע (StemPro-34) </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 10639-011 </td><td> דורש תוספת לפי Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> גזע תוספים בינוניים סלולריים </td><td> שונה </td><td> ראה טבלה 3 </td><td> דורש תוספת לפי Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 תאים </td><td> תא Biolabs, Inc </td><td> CBA-315 </td><td> יכול להחליף עם תאי סטרומה אשכי מבוגרים כלSeandel et al. (2007) </td></tr><tr><td> mitomycin-C (זהירות) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> M4287 </td><td> רעיל; טפל בזהירות. </td></tr><tr><td> ג&#39;לטין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G1890 </td><td> 0.4% פתרון במים </td></tr><tr><td> EVOS xl דיגיטלי מיקרוסקופ ההפוך </td><td> קבוצה מיקרוסקופית מתקדמת </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. ריאגנטים וציוד ספציפיים. * ראה טבלה 3 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> קורנינג </td><td> 10-013 </td><td> Diluent לניתוק חיץ </td></tr><tr><td> טריפסין (1:250) </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 27250-018 </td><td> דיסוציאציה חיץ: 0.05% סופיים wt / כרך </td></tr><tr><td> collagenase, הקלד, 235 U / ml </td><td> וורטינגטון </td><td> CLS1 235 </td><td> דיסוציאציה חיץ: 0.03% סופיים wt / כרך </td></tr><tr><td> אני DNAse </td><td> Sigmאולדריץ </td><td> DN25 </td><td> דיסוציאציה חיץ: גמר 80 U / ml </td></tr><tr><td> שור אלבומין </td><td> ICP יו </td><td> ABRE-100g </td><td> דיסוציאציה חיץ: 0.5% סופיים wt / כרך </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלה 2. דיסוציאציה חיץ </td></tr><tr><td> StemPro-34 SFM </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 תוסף תזונתי </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> תוספים נוספים ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> פתרון MEM ויטמין </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> שור אלבומין </td><td> ICP יו </td><td> ABRE </td><td> 0.50% </td></tr><tr><td> פתרון לאנטיביוטיקה Antimycotic </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) גלוקוז </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G8769 </td><td> 6 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> β-אסטרדיול </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> E2758 </td><td> 30 ng / ml </td></tr><tr><td> פרוגסטרון </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 ng / ml </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> משתנה </td><td> n / </td><td> 1% </td></tr><tr><td> שור הולוגרמות transferrin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T1283 </td><td> 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> ג&#39;מיני Bio-מוצרים </td><td> 700-112P </td><td> 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> GDNF האנושי </td><td> החיים technologies </td><td> PHC7041 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF האנושי </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> PHG0023 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> העכבר EGF </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> PHG0313 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> פוטרסין </td><td> Organics מחקר </td><td> 0778P </td><td> 60 מיקרומטר </td></tr><tr><td> סלניום </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S5261 </td><td> 30 ננומטר </td></tr><tr><td> חומצת pyruvic </td><td> אלפא Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> חומצה לקטית DL- </td><td> JT בייקר </td><td> 0196-04 </td><td> 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 21985-023 </td><td> 50 מיקרומטר </td></tr><tr><td> חומצה אסקורבית </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A4544 </td><td> 100 מיקרומטר </td></tr><tr> &lt;td&gt; D-ביוטין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> B4639 </td><td> 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> לוח 3. גזע בינוני תא </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * הערה: הוספת תוספים מתחת לפני שימוש בינוני. סננו לעקר ולשמור אותו ב 4 ° C. הבינוני הוא יציב במשך לפחות 2 שבועות. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** יש לנו מועסקים יצרנים שונים, פורמולציות, ו / או מספרים הרבה ריאגנטים אלה ללא כל השפעות מזיקות לכאורה. באופן כללי, ריאגנטים כיתת תרביות תאים צריכים להיות מועסקים. </td></tr></tbody></table>

serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines

גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) של האשך מייצגים דוגמה קלסית לתאי גזע של יונקי בוגרים ולשמר פוריות לכמעט כל החיים של בעלי החיים. בעוד המנגנון המדויק ששולט בהתחדשות עצמית ובידול in vivo מאתגר למחקר, מערכות שונות שפותחו בעבר כדי להפיץ SSCs Murine במבחנה באמצעות שילוב של אמצעי תקשורת תרבות מיוחד ותאים מזינים 1-3. רוב הגיחות במבחנה לביולוגיה של SSCs שנבעו משורות תאי ילודים, אולי בשל הקושי בהשגת שורות תאי בוגרים 4. עם זאת, האשך ממשיך להבשיל עד ~ 5 שבועות של גיל ברוב הזנים של עכברים. בתקופה הראשונה שלאחר הלידה, שינויים דרמטיים בארכיטקטורה של האשך ובביולוגיה של תאים והן גופניים spermatogenic, כוללים שינויים ברמות הביטוי של גזע רב הקשור לתאגנים. לכן, קווי SSC נגזרים-neonatally לא יכולים לסכם באופן מלא את הביולוגיה של SSCs המבוגר כי נמשך לאחר האשך המבוגר הגיע למצב יציב. מספר גורמים שעכבו את הייצור של קווי מבוגרי SSC מבחינה הסטורית. ראשית, חלקם של תאי גזע פונקציונליים עשוי לרדת במהלך הבגרות, או בשל גורמים פנימיים או חיצוניים 5,6. יתר על כן, כמו בתאי גזע בוגרים אחרים, זה כבר קשה להעשיר SSCs מספיק תאים מאשכים בוגרים כלל ללא שימוש בשילוב של אסטרטגיות מיון immunoselection או אחרות 7. אסטרטגיות מועסק נפוץ כוללות שימוש בעכברים טמירים כמקור לתאי תורם בשל יחס גבוה יותר של תאי גזע לתאים מסוגים אחרים 8. בהתבסס על ההשערה כי הסרת תאים הסומטיים מהתרבות הראשונית משבשת אינטראקציות עם נישת תאי הגזע שהם חיוניים להישרדות SSC, פתחו שיטות עבר כדי להפיק ליטר מבוגראינס, שאינו דורש immunoselection או תורמים טמירים אלא להעסיק העשרה סידורית של SSCs בתרבות, המכונה להלן כSESC 2,3. השיטה המתוארת להלן כרוכה הליך פשוט לגזירת קווי SSC במבוגרי dissociating תורם המבוגר seminiferous tubules, ואחריו ציפוי של תאים במתקני ההאכלה המורכבות משורת אשכי סטרומה תא (JK1) 3. דרך סידורי passaging, חזק נדבק, לזהם תאי ניבט שאינו מתרוקנים מהתרבות עם העשרה קשורה של SSCs. תרבויות שנוצרו בדרך זו מכילות תערובת של spermatogonia בשלבים שונים של התמיינות, המכילות SSCs, המבוסס על יכולת התחדשות עצמית לטווח ארוך. עיקרה של שיטת SESC הוא שהוא מאפשר SSCs לבצע את המעבר הקשה מהתחדשות עצמית in vivo להתחדשות עצמית לטווח ארוך במבחנה בmicroenvironment שונה בתכלית, מייצר קווי SSC לטווח ארוך, ללא זיהוםתאים הסומטיים, ובכך מאפשר מניפולציה ניסויית הבאה של SSCs.

הופעתו של זן בר חלוף אפס, מושבות בוגרות SSC לאחר 7 ימים מוצגת באיור 1. מושבות תלת ממדיות מורכבות משכבה של תאים שטוחים המחוברים למתקני ההאכלה או המטריצה ​​זוטרה תאית שהפקידו את מתקני ההאכלה בשכבות מרובות של SSCs גידול בראש. בעוד SSCs הבריא הם בהיר ואחיד refractile 11-12 קו?...

Watch this Scientific Journal Video about Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines at JoVE.com

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

שיטה פשוטה לגזור ולשמור גזע spermatogonial ושורות תאי אב מעכברים בוגרים מוצגת כאן. השיטה מנצלת תאים מזינים שמקורם מתא תא סומטי מאשכי העכברים הבוגרים. טכניקה זו היא ישימה זנים נפוצים, כוללים עכבר מהונדס מוחץ, ולדפוק בעכברים.

העשרה סידורית של גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) בתרבות לגזירת קווי SSC מאוסים למבוגרים לזמן ארוך

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

serial-enrichment-spermatogonial-stem-progenitor-cells-sscs-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

13.7K Views.  Weill Cornell Medical College. שיטה פשוטה לגזור ולשמור גזע spermatogonial ושורות תאי אב מעכברים בוגרים מוצגת כאן. השיטה מנצלת תאים מזינים שמקורם מתא תא סומטי מאשכי העכברים הבוגרים. טכניקה זו היא ישימה זנים נפוצים, כוללים עכבר מהונדס מוחץ, ולדפוק בעכברים.

Video: Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...