Name: step-specific sorting of mouse spermatids by flow cytometry
Uploaded: 2015-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר לאוניד וולקוב ואריק Bouchard לייעוץ הטכני שלהם בנוגע למיקרוסקופיה epifluorescence. תמיכה כלכלית ממומן על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (מענק # MOP-93,781) לGB

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+fertile+sperm+from+murine+spermatogonial+stem+cell+lines.">In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines.</a> Nat. Commun. 2, 472 (2011).</li><li>Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -. J., Yang, W. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+actin+and+myosin+during+spermatogenesis.">The role of actin and myosin during spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+junction+dynamics+in+the+testis:+Sertoli-germ+cell+interactions+and+male+contraceptive+development.">Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development.</a> Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).</li><li>Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+the+murine+testis+during+the+first+wave+of+spermatogenesis.">Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li><li>Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+during+chromatin+remodeling+in+elongating+spermatids+of+mice.">DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice.</a> Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).</li><li>Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+transition+nuclear+proteins+in+spermiogenesis.">Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis.</a> Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).</li><li>Gr&#233;goire, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-driven+de+novo+mutations+in+haploid+germ+cells.">Male-driven de novo mutations in haploid germ cells.</a> Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).</li><li>Simard, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+trinucleotidic+repeats+during+chromatin+remodeling+in+spermatids.">Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids.</a> Hum. Mutat. , (2014).</li><li>Wykes, S. M., Krawetz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cells+from+adult+transgenic+mouse+testes+using+unit-gravity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation.</a> Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Moreno, R. D., Lizama, C., Urz&#250;a, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+throughout+the+first+wave+of+spermatogenesis+in+the+rat.">Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat.</a> Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).</li><li>Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+specific+stages+of+spermatids+from+vitamin+A-synchronized+rat+testes+for+assessment+of+nucleoprotein+changes+during+spermiogenesis.">Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis.</a> Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).</li><li>van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+the+seminiferous+epithelium+after+vitamin+A+replacement+in+vitamin+A-deficient+mice.">Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice.</a> Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Kovtun, I. V., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+expansion+in+haploid+germ+cells+by+gap+repair.">Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair.</a> Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lef&#232;vre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+method+to+isolate+round+spermatids+from+mouse+testis.">Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis.</a> Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

תאי זרע ראשוניים תמיד היו מאתגרים ללמוד בהתחשב במורכבות של אפיתל seminiferous, כמו גם ההצלחה המוגבלת של תרבות במבחנה. במהלך השנים, גישות רבות כדי לטהר תאי נבט ממינים שונים פותחו. טכניקות שקיעה באמצעות טיהור הכבידה עם Percoll או הדרגתיים אלבומין בסרום שור בדרך כלל מספקות תשואה טובה של תאים נבטי שלמים, אבל חוסר הגדרה ראויה בין כמה סוגי תאים כמו תאי tetraploid meiotic וspermatids 10. יתר על כן, טכניקות אלה דורשים מכשירים מיוחדים (לעתים קרובות תוצרת בית), שעשויה לא להיות זמין למעבדות רבות, אשר הופכת אותם קשים לשחזר בלי ניסוי וטעייה מסורבלים. שיטות אלה הן גם זמן רב, רגיש מאוד לתנודות ונוחות כמנגנון בדרך כלל שמר על 4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על כדאיות תא. כאשר מוצלח, שיטות שקיעה עם זאת לספק כמה מיליון ג החי המטוהראמות לאוכלוסייה. עם זאת, רמת העשרה הנמוכה תא שניתן להשיג הוא החסרון העיקרי של שיטות אלו כפי שרק לעתים רחוקות מגיעים טוהר יותר מ 80-90%. במקרים מסוימים, זיהום של 10-20% מסוגי תאים אחרים הוא הווה כאשר נמדדו על ידי ה- DNA, RNA או חלבון תוכן, המייצג את המכשול עיקרי לניתוחים מולקולריים. כאשר מבקש לשפר את טוהר של אוכלוסיות תאים, חלק מהחוקרים בשילוב שקיעת כובד לשיטות אחרות. אחת הגישות יעילות ביותר הוא להשתמש בעכברים בוגרים להגביל את המספר של אוכלוסיות תאים שונות המייצגות שלבים מאוחר יותר. אפשר לנצל את הגל הראשון של יצירת תאי זרע ולקבל הכנת תא המכילה תאים נבטי עד שלב התמיינות נתון המבוסס על המראה הרציף לאחר לידה. עם זאת, גישה משולבת זו דורשת יותר חיות כדי לפצות על הכמות המוגבלת של חומר מוצא ועדיין לא פותרת את חוסר definition של שיטות שקיעה. בנוסף, גישה זו לא יכולה להיות כמעט הגישה בקשה לסוגי תאים אחר כך כגון spermatids, אבל משמשת בעיקר לspermatogonia וspermatocyte העיקרי. יתר על כן, יש כמה עדויות לכך שהגל הראשון של יצירת תאי זרע עלול נמל תאים בעלי תכונות שונות מעט מזה של האפיתל הרכיבה על אופניים של עכברים בוגרים 11,12. סנכרון ויטמין יצירת תאי הזרע שימש גם כדי לשפר את טיהור תא נבטי כנוהל זה מצמצם את מספר השלבים הנוכחיים באשכים של בעלי חיים שטופלו. עם זאת, הליך זה היה בעיקר משמש לסנכרון יצירת תאי זרע בחולדות, בהצלחה מסוימת דיווחה בעכברי 13,14. מהניסיון שלנו, ויטמין סנכרון בעכברים הוא זמן רב, לעתים רחוקות נותן תוצאות לשחזור ומייצר תופעות לוואי מזיקות העלאת חשש היושרה הסלולרית של האפיתל seminiferous. טיהורr קבוצות השתמשו בהצלחה cytometry זרימה לטהר תאי נבט מעכבר 15-18. עם זאת, אף אחד מהם דיווח טיהור של אוכלוסיות spermatid עבר צעדי spermatids העגולה. אסטרטגית gating שלנו מאפשרת לטהר ארבע אוכלוסיות תאי הפלואידים נקיות במיוחד מייצגות את שלבים בידול חשובים ניתנים למחקרים מולקולריים. המגבלה העיקרית של השיטה המתוארת במאמר זה עשויה להיות התשואה המוגבלת של תאים ממוינים. הרמה הגבוהה של טוהר מתקבלת במידה מסוימת על חשבון מספר התאים ממוינים. עם זאת, לוודא כי תנאי מיון הם אופטימליים, הוספנו כמה עצות קריטיות לפרוטוקול. כל עצות הטכניות אלה במטרה להגדיל או המספר או טוהר spermatids מסודרים. לדוגמא, השימוש בFBS מצופה צינורות במהלך מיון מאוד מפחית את האובדן של תאים שמקלים על הצינורות. כמו כן, ריכוז באמצעות להרוות של SYTO16 עוזר להפחית את הווריאציות של עוצמת מכתים DNA וכתוצאה מכך populat היציב יותריונים כפי שניתן לראות על מגרשי FACS ותשואה טובה יותר וטוהר spermatids ממוין על פני תקופה מיון 8 שעות. בנוסף, העצות טכניות הניתנות להגדרת סדרן FACS בהחלט לסייע להגביר את היעילות הכוללת של מיון על ידי הימנעות קבקבי תא או זיהום צולב באיסוף צינורות. לחלופין, ניתן להרחיב שערים כדי להגדיל את מספר התאים ממוינים, סופו של דבר וכתוצאה מכך ירידה קטנה בטוהר אוכלוסייה, שיכול להיות מקובל על חלק ממחקרים. יתר על כן, בתאי נבט קבוע אתנול מוכתם בSYTO16 הם יציבים מאוד על 4 מעלות צלזיוס וניתן למיין עבור שעות יותר מ -8 עם התאמות gating מוגבלות ופיקוח. סופו של דבר, יכולים להיות נקוו כמה ימי מיון לקבלת מספר מספיק של תאים לכל יישום. spermatids זרימה מסודרים מתקבל כפי שמתואר כאן יכול לשמש למגוון רחב של ניסויים. ה- DNA מהתאים אלה יכולים בקלות להיות חילוץ באמצעות ערכות טיהור DNA הגנומי מסחריות והפגיןלהיות באיכות ראויה לPCR ניתוחים 9 ורצף הדור הבא (מידע לא מוצג). spermatids מסודרים יכול לשמש גם לחלבון מנתח 9 שבו ביצענו כמה immunoblots נגד סמנים בשלב מסוים כדי לאשר את טוהר הגבוה של spermatids מסודרים. אנו מאמתים את השלמות הסלולרית של spermatids המיון ומצאנו כי הגרעין והציטופלסמה של כל האוכלוסיות יישארו ללא שינוי. עם זאת, מצאנו שיעור של צעדים 13-14 spermatids וחלק קטן יותר מצעדים 15-16 spermatids שחסרות השוטון שלהם (מידע לא מוצג). לפיכך, אוכלוסיות תאי נבט טהורות ביותר מסודרים שימוש בגישה זו מתאימות לניתוח proteomic וגנומי, כמו גם יישומים אחרים.

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece3, cell junction dynamics4, RNA dynamics5, chromatin remodeling process6,7 or genomic stability8. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size. 
Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.
A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group9.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>For mouse anesthesia before euthanasia</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>For tube coating</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>DNA staining</td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round bottom tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Sorted cells collection</td></tr><tr><td>15 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>TEC4 anaesthetic vaporizer</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>Homemade mouse gas chamber</td><td></td><td></td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Falcon cell strainer</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m sample line filters</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>Dynac centrifuge</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 &amp;micro;m filters</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser-euipped cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop Fluorescent Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 &amp;mu;m filtered and keep at 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

step-specific sorting of mouse spermatids by flow cytometry

הבידול של spermatids העכבר הוא תהליך קריטי אחד לייצור תא מין זכרי פונקציונלי עם הגנום שלם כדי להיות מועבר לדור הבא. עד כה, מחקרים מולקולריים של מעבר מורפולוגיים זה כבר הקשו על ידי חוסר שיטה המאפשרת הפרדה נאותה של צעדים החשובים אלה של בידול spermatid לניתוחים שלאחר מכן. הניסיונות קודמים בgating התקין של תאים אלה באמצעות cytometry זרימה ייתכן שהיו קשים בגלל עלייה מוזרה בקרינת ה- DNA בspermatids עובר שיפוץ הכרומטין. המבוססים על התבוננות זו, אנו מספקים פרטים של זרימה פשוטה cytometry תכנית, המאפשרים טיהור שחזור של ארבע אוכלוסיות של spermatids עכבר קבוע עם אתנול, המייצג כל מדינה אחרת בתהליך שיפוץ הגרעיני. העשרת אוכלוסייה אישרה באמצעות סמני צעד ספציפי וקריטריונים מורפולוגיים. Spermatids המטוהר יכול לשמש להגנומי וproteomIC ניתוחים.

אסטרטגית gating שימוש עם cytometry הזרימה איור 1 מייצג את אסטרטגית gating המשמשת בcytometry הזרימה למיין ארבע אוכלוסיות spermatid טהורות ביותר. בקצרה, תאים עם מכתים DNA חיובי (אלקסה פלואוריד 488-A) נבחר ראשון עם שער 1. Spermatids מspermiogenesis מרתיע 1-12 נבחרים (שער 2) על מגרש נקודה מראה granulosity (SSC-) לעומת גודל (FSC -A) מהשער 1. אז, spermatids מspermiogenesis צעדים 1-9 וspermiogenesis צעדים 10-12 ניתן להפריד אחד מהשני על פי הווריאציה של עוצמת מכתים DNA (גייטס 5 ו -6). Spermatids מspermiogenesis צעדים 13-14 ו15-16 נבחר ישירות מהתאים מוכתמים חיובי על גודל עלילת נקודה מראה (FSC-A) לעומת צביעת DNA (אלקסה פלואוריד 488-A) (גייטס 3 ו -4). כל האוכלוסיות מסודרים הם הגדירו מחדש עם אלקסה פלואוריד 488-W לעומת כתמי 488-נקודת אלקסה פלואוריד כדי להגדיל<html> טוהר IR. אימות של תכנית הטיהור על ידי מיקרוסקופ epifluorescence איור 2 מייצג מכתים DAPI של אוכלוסיות המיון של spermatids ידי cytometry זרימה. Spermiogenesis צעדים 1-9 spermatids להציג את הגרעין העגול בצורה האופיינית לspermatids העגול וגרעין בצורה סגלגלה של צעד spermiogenesis 9 spermatids. Spermiogenesis צעדים 10-12 spermatids להראות גרעין מתארך בצורת וו גדול. Spermiogenesis צעדים יש 13-14 ו15-16 spermatids גרעין בצורה דומה, אך שונה במקצת בעוצמת כתמי DNA, שאיפשר מיונם. צעדי הבידול וטוהר של אוכלוסיות מיון השונות גם הובררו באמצעות סמנים ביולוגיים ספציפיים, כמתואר במחקר קודם 9. טוהר של אוכלוסיות spermatid מיון מתואר בטבלה 1. אוהל &quot;FO: לשמור-together.within עמודים =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53379/53379fig1.jpg" /> איור 1. אסטרטגית gating מפורטת כדי למיין אוכלוסיות spermatid ultrapure. ייצוג סכמטי של אסטרטגית gating משמשת כדי למיין spermiogenesis צעדים 1-9 spermatids, על שלבים 10-12 spermatids, על שלבים 13-14 spermatids וצעדי 14-16 spermatids בו זמנית עם ננומטר 488 מצויד לייזר סדרן תא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53379/53379fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53379/53379fig2.jpg" /> spermatids הממוין איור 2. ויזואליזציה של spermatids מסודר על ידי epifluorescence. הם cytospined בשקופיות מיקרוסקופ, מוכתם עם DAPI ודמיין באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence עם המסננים המתאימים לDAPI ומצויד בCA CCDMera. תאים מוצגים בקנה מידה אפורה הפוכה. בר = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53379/53379fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td></td><td> סוג התא שנצפה ברוב </td><td> טוֹהַר </td><td> מספר משוער של תאים (8 מיון HR) </td><td> מזהמים </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אוכלוסיית 1 </td><td> צעדים 1-9 spermatids </td><td> 99-100% </td><td> 4,000,000 </td><td> שלב 10 spermatids </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אוכלוסייה 2 </td><td> צעדים 10-12 spermatids </td><td> 95-98% </td><td> 1,000,000 </td><td> Spermatocytes </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Population 3 </td><td> צעדים 13-14 spermatids </td><td> 99-100% </td><td> 800,000 </td><td> Spermatocytes, על השלבים 1-9 spermatids </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אוכלוסייה 4 </td><td> צעדים 15-16 spermatids </td><td> 98-100% </td><td> 1,500,000 </td><td> Spermatocytes </td></tr></tbody></table> אוכלוסיות ממוין spermatid והמזהמים שלהם: טבלה 1.

Watch this Scientific Journal Video about Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry at JoVE.com

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

step-specific-sorting-of-mouse-spermatids-by-flow-cytometry

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.5K Views.  Université de Sherbrooke. We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Video: Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Biology

<meta charset="utf8"></head><body>הליך הזרקת זרע עגול Murine לחקר התפתחות עוברית

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>הזרקת זרע עגולה לעכבר

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

הזרקת זרע עגולה לעכבר

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי Electroporation

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

הזרקת זרע עגולה לעכבר

הזרקת זרע עגולה לעכבר

הזרקת זרע עגולה לעכבר

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים