המחקר דיווח בפרסום זה היה נתמך על ידי מכון הלאומי לחקר הסרטן של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר הפרס R01CA174385. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

1. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן RPMI-PLGH ידי ערבוב 500 מיליליטר מיליליטר RPMI-1640 ו 5 כל אחד מפניצילין-סטרפטומיצין, L-גלוטמין, ופתרון HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן R10 פתרון על ידי ערבוב RPMI-PLGH עם סרום שור עוברי (10% FBS). FBS הוא חום מומת בגיל 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני תוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם על 37 מעלות צלזיוס 50 מ&quot;ל של RPMI-PLGH, 15 מ&quot;ל של PBS, ו15 מ&quot;ל של R10 בצינורות חרוטים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצאה של מערכים של nanowells בPDMS: אב סיליקון היא מפוברקת באמצעות photolithography למעשה כפי שתואר קודם לכן 10. מערבב היטב את בסיס Sylgard 184 אלסטומר ערכה וסוכן ריפוי ביחס 10:01 משקל בכוס חד פעמית באמצעות סכין פלסטיק. דגת התערובת בתא ואקום לשעה 1. יוצק את התערובת על גבי מערך nanowell, לאטום עם שקופית זכוכית ולתת לו לשבת במשך 30 דקות. העברת ההרכבה לתנור ל 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ומצננים בטמפרטורת חדר למשך השעה 1. אלסטומר יהיה נוכדואר בתקופה זו ורצון קשר לשקופית הזכוכית. שקופיות הזכוכית המכילות את מערך nanowell PDMS היא הרים בזהירות את אדון סיליקון, מכוסה בנייר דבק ומאוחסנים עד לשימוש עתידי. </li></ol> 2. יעד סלולרי תיוג (ט) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן 5000000 תאי מטרה מתרבית תאים באמצעות hemocytometer וגלולת התאים במבחנה סטרילית 15 מיליליטר חרוטים ידי צנטריפוגה XG ב 340 למשך 5 דקות. תרבית התאים מתחלקת ביום הקודם בנפח כולל מ&quot;ל 5 (צפיפות = 1 מ&#39;/ מ&quot;ל) ותרבית בבקבוק T-25 (VWR). פרוטוקולים לספירת תאים באמצעות hemocytometer תוארו בפירוט בעבר 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת העודפת שמשאירה אחרי כ 50 μl של תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון עובד של תא Tracker אדום (CTR) על ידי ערבוב מניית ק&quot;ל μl 0.5 (מ&quot;מ 1) עד 150 μl RPMI-PLGH (ריכוז סופי 2.5 מיקרומטר). הוסף 150 μl של הפתרון עובד לתאי המטרה ומערבבת היטב באמצעות פיפטה P200.לחלופין, PKH 26 (ריכוז סופי של 2 מיקרומטר) ניתן להשתמש בתאי מטרת תווית בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות% 5 / CO 2 למשך 20 דקות. </li></ol> 3. (ה) סימון תא מפעיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן 5000000 תאי מפעיל מתרבית תאים באמצעות hemacytometer וגלולת התאים במבחנה סטרילית 15 מיליליטר חרוטים ידי צנטריפוגה XG ב 340 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת העודפת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון עובד של פתרון כתם DyeCycleViolet Vybrant ידי הוספת μl 1 מתוך מניות יולטו Vybrant 5 מ&quot;מ ל1 מ&quot;ל של R10 תקשורת (ריכוז סופי של 5 מיקרומטר). הוסף פתרון עובד לתאים וresuspend באמצעות P200 פיפטה. לחלופין, PKH 67 (ריכוז סופי של 2 מיקרומטר) ניתן להשתמש בתאי מטרת תווית בהתאם להוראות היצרן. אם PKH 67 משמש, אז SYTOX ירוק לא צריך להיות בשימוש מאז שהם נמצאים באותו הערוץ פלואורסצנטי. הספירה של מטרות אפופטוטיים נעשית באופן בלעדי באמצעותמכתים nnexinV במקרה זה. הערה: אם ביצוע זמן לשגות ולא מדידות נקודתי קצה, צבעי UV כמו ותולט Vybrant יש להימנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות% 5 / CO 2 למשך 20 דקות. </li></ol> 4. הפרדה של תאי חיים ומלח באמצעות שיפוע צפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6.8 מ&quot;ל ו 6.0 מ&quot;ל של RPMI-PLGH ליעד ותאי מפעיל, בהתאמה ומערבב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.5 מיליליטר השכבה של Paque FICOLL פלוס לתחתיתו של כל צינור חרוטים המכיל תאי יעד ומפעיל. שכבת FICOLL לאט כדי להבטיח היווצרות טובה של שכבות בין FICOLL ותקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שני הצינורות ב340 XG למשך 30 דקות. ללא בלם ותאוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, להעביר 7 מ&quot;ל של PBS מראש שחומם לצלחת 4-כן. הכן מערך nanowell (מפוברק בPDMS): תחתון נקי של שקופיות זכוכית עם אתנול והחמצן PDMS בהגדרת RF גבוהה באמצעות חמצן פלזמה לדקה 1. צעד זה STErilize מערך nanowell גם בעת מתן PDMS הידרופילי. מייד להעביר את מערך nanowell לצלחת המכילה PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הצלחת לארון בטיחות ביולוגי ולשאוב PBS העודף. הפוך 1% אגר 10 מ&quot;ל אציל על ידי הוספת האבקה אגר מ&quot;ג 100 ל מי 10 מ&quot;ל DI ולאחר מכן אותו למיקרוגל 30-45 שניות. החל לחמם 1% אגרו אצילי על קצה עליון ותחתון של שקופיות זכוכית המכיל את מערך nanowell כדי לשתק את המערך ולחכות 10 דקות לאגר לביסוס. הוסף 3 המ&quot;ל PBS ואגר עודף aspirate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של R10 אל גגו של מערך nanowell ולתת לו לאזן ל~ 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר FICOLL צנטריפוגה, לשאוב 5 מיליליטר תקשורת מהשכבה העליונה של כל צינור. היזהר שלא לשאוב את השכבה המכילה את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את התאים (שכבה לבנה) על ידי מחל מ&quot;ל 1-2 מהשכבה בין FICOLL ותקשורת עם P1, 000 פיפטה ומעבר לצינורות חרוטים סטריליים חדשים. חזור על פעולה זו עבור שתי הקבוצות של תאים תוך הקפדה שהאמרהize תאי ההתאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של טרום התחמם RPMI-PLGH לכל צינור, לערבב ידי pipetting וגלולה ידי צנטריפוגה XG ב 340 במשך 5 דקות בהאצה ובלמים מלאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת העודפת, מוסיף 5 מ&quot;ל של טרום התחמם RPMI-PLGH לכל צינור וחזור צנטריפוגה ב XG 340 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת העודפת וresuspend התא גלול ב 500 μl של R10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים חיים באמצעות שיטת ההדרה הכחולה Trypan על hemacytometer. </li></ol> 5. טוען תא על מערך Nanowell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת העודפת ממערך nanowell ולהוסיף 2 מ&quot;ל של R10 הטרי על המערך. לשאוב שוב תוך הקפדה העליונה של מערך nanowell הוא לא רטוב מדי / יבשה כמו זה ישפיע על חלוקת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקדת 1 x 10 5 תאי מפעיל ב200 μl של R10 גבי משטח המערך nanowell (צפיפות = 5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו תאים להתפשר על 5 דקות ובאמצעות המחאת מיקרוסקופ תרבית רקמה סטנדרטית לenבטוח שחלוקת תאים רצויה. הוסף יותר תאים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 פיקדון x 10 5 תאי המטרה בR10 ​​μl 200 על פני מערך nanowell (צפיפות = 5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו תאים להתפשר על 5 דקות ובאמצעות המחאת מיקרוסקופ תרבית רקמה סטנדרטית כדי להבטיח שחלוקת תאים רצויה. הוסף יותר תאים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף בזהירות עם מערך nanowell 2 מ&quot;ל R10 ותקשורת העודפת לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3 R10 מראש התחמם מ&quot;ל בצינור חרוטי מיליליטר סטרילי 15. הוסף 3 μl של חומצה ירוקה 0.5mm SYTOX גרעין כתם (0.5 מיקרומטר ריכוז סופיים) ו 60 μl של Annexin V-Alexa פלואוריד 647 להכין פתרון עובד. הוסף פתרון עובד לצלחת 4-גם בזהירות תוך הקפדה שתאים אינם נעקרו מהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות% 5 / CO 2 למשך 15 דקות. </li></ol> 6. 1 הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות של מערך nanowell באמצעות micr פלואורסצנטיoscope: בדוגמה זו, אנו משתמשים אובזרוור ZEISS מיקרוסקופ Z-1 מצויד בשלב ממונע ומבדה-DG4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאתחל את התוכנה ומיקרוסקופ ולבדוק את עוצמת האות באור המועבר וערוצי הניאון האחרים. בסך הכל, יהיו חמישה ערוצים מקבילים: לאור מועבר, Annexin V-647 (Cy5 מסנן), שק&quot;ל (DsRed מסנן), SYTOX גרין (FITC מסנן), וVybrant יולטו (DAPI מסנן). ודא שהתקנתו מיקרוסקופ כדי להבטיח אות לרעש מקסימלי תוך הימנעות רוויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר X ו Y מיקום למערך nanowell. להתחיל את התהליך על ידי קביעת עמדת האפס ומאתחל את ההתמקדות במרכז הבלוק 7 x 7 nanowell מערך בפינה שמאלית העליונה של בול מערך nanowell. הגדר את x, y עמדות במקביל למרכזו של כל גוש וערך z כדי לשקף במדויק את הפוקוס על כל בלוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהעמדה וההתמקדות כל הסט, הקפד להגדיר את רכישת תמונה במצב ליניארי ולרכוש תמונות. <sטרונג&gt; הערה: אם תורו צורך בחממה וCO 2 במיקרוסקופ לפחות 30 דקות לפני הניסוי. </li></ol> 7. לאחר ההדמיה להעביר את הצלחת 4-גם מכילה מערך nanowell לתוך חממה (37 ° C% / 5 CO 2) עבור 6 שעות. 8. הדמיה 2 לרכוש את התמונות בזמן נקודה השנייה כפי שמתואר בשלב 6. 9. ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפוסה של תאים בתוך nanowells נקבעת על ידי השימוש בתוכניות פילוח תמונה המתאימות (למשל ImageJ, <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/)</a> למעשה כפי שתואר לעיל 9,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של הקבוצה הראשונית של תמונות מיקרוסקופ (t = 0 שעות; t 0) משמש ליצירת מסד נתונים של nanowells הבודד המכיל בדיוק תא היעד חי אחד (מזוההעל ידי CellTracker האדום; האדום) ולא תאים מתים (שזוהה על ידי צביעת V Annexin, ירוק) [0 T1t nanowells]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של הסט השני של תמונות מיקרוסקופ (t = 6 שעות, 6 t) משמש באופן עצמאי כדי לקבוע מסד נתונים המכיל nanowells שני של תא המטרה 1 (אדום) [6 T1t nanowells]. בדיקת תקינות (שאילתא מסד נתונים), מיושמת כדי להבטיח שכל מטרות החיות בt 0 מותאמות למטרות ב 6 לא לייצר סט אחרון של מטרות מתאימות (מיושם כnanowells כי יש T1t 0 = 6 T1t, מיועד כT1match) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר תאי מפעיל בnanowells נקבע באמצעות שימוש מכתים ויולט Vybrant בt 0 [nanowells E1] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאילתא מסד נתונים מיושמת לזהות nanowells המכיל effectors הבודדה משותף מודגרות-עם יעדים יחידים (מוגדר כnanowells כי יש התאמת E1 וT1, המיועדים כE1T1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפופטוזיס המושרה פעיל הוא הבקיע ידי<html> dentifying מטרות שAnnexin V שליליים בt 0 וAnnexin V החיובי בt 4 (E1T1 עם מכתים יעד V Annexin בשעת 6 t). </li></ol> 10. הדמיה אופציונלית זמן לשגות של הרג שימוש BioStation IM של ניקון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח צלחת פטרי עם תחתית coverslip ולחתוך חתיכה קטנה של שבב מערך nanowell (מוכן בשלב 5) שתתאים בדיוק על coverslip. ודא שהשבב נשאר רטוב בעת חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבי 1 x 10 6 יעדים ו -1 10 6 תאי T x 100 בתקשורת, ופיפטה μl על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר כ 15-30 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפוך את שבב מערך nanowell הקטן ומניח אותו על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להבטיח שהשבבים לא יוכלו להזיז אחד או שניים x 20mm coverslips 20mm במהלך ההדמיה, המקום על גבי השבב. להפעיל לחץ בשקט לדחוף את השבב לתחתית הצלחת. </li></ol>אוהל &quot;&gt; הערה: החלק התחתון של שבב מערך nanowell עבה מדי להדמיה ברזולוציה גבוהה ולכן יש התהפך במהלך זה, רבים מהתאים נשטפים החוצה מכיוון שזו לא יכולה להיות מספרי קלות מבוקר, תאים בשלב 9.2.. וזמן דגירה בשלב 9.3 צריכים להיות מותאם.

<ol>
	<li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma.">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients.">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor-Modified+T+Cells+in+Chronic+Lymphoid+Leukemia.">Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. , (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8++T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis.">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li><li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies.">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8++T+cells+using+microengraving.">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li><li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+a+house+of+cards:+re-evaluating+CD8++T-cell+immune+correlates+against+HIV.">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

נציין כאן את הפרוטוקול לבדיקת cytolytic תפוקה גבוהה מתא בודד אפשרה באמצעות שיתוף דגירה של effectors ויעדים במערכים של nanowells (איור 1). בנוסף לתפוקת יתרון עיקרי של השיטה הוא היכולת לנטר cytotoxicity פעיל בתיווך כנגד תאי המטרה רצויה ללא צורך בהנדסת תא היעד אשר בתורו מאפשר לשימוש בתאי autologous או התאמה / עיקריים סרטניים כתאי מטרה. הבידוד המרחבי מאפשר אחזור ושיבוט עוקב של תאי T תפקודיים בסוף assay 9. הגבלה של assay היא הצורך במיקרוסקופים מיוחדים עם שלבים אוטומטיים ואופטיקה מהר מיתוג-. זה לא אולם מגבלה רצינית בהתחשב בכך שהמכונות האלה הן עכשיו זמינות לציבור רחב, כחלק ממתקני מחקר ליבה. יש מגוון רחב של מבחנים מבוססי הזרימה cytometry שמציע תפוקה גבוהה יותר ואילו preserving רזולוצית תא בודד. אלה כוללים מבחנים שמכתימים את הסמן הפונדקאי לdegranulation (CD107a) או תוכן perforin בeffectors ו/ פעילות granzymes caspase ביעדי 13,14. מבחנים אלה אולם לא באמת לפקח נטייה-יעד מפעיל או את היכולת של המפעיל לעסוק ולהרוג מטרות מרובות. בהשוואה לבדיקת תקן הזהב כגון assay 4h 51Cr שחרור, רוץ בדואר: יחסי T של 1:1, המתודולוגיה שלנו בדרך כלל מדווחת על אותו המספר הכולל של effectors cytolytic, תוך מתן פתרון תא בודד. למרות שהפרוטוקול התווה רק פרטים על cytotoxicity כאן, כפי שתואר קודם לכן assay זה יכול להיות משולב בקלות עם assay microengraving לקבוע ציטוקינים המופרשים על ידי תאי מפעיל בודדים על קשירת היעד 9. יתכן אפוא ליצור פרופילים מורכבים פונקציונליים של מכונית + תאי T המשלבים cytotoxicity והפרשת ציטוקינים ברמת התא בודד.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> RPMI-1640 w / o L-גלוטמין </td><td> Cellgro </td><td> 15-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td> יחב&quot;ל פניצילין מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין 10000 10000 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> פתרון 200 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי (FBS) </td><td> אטלנטה ביולוגית </td><td> S11150 </td><td> הרבה נבדק </td></tr><tr><td> תא Tracker כתם אדום </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 מיקרוגרם </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle יולט כתם </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> חומצת גרעין הירוק SYTOX Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Annexin V-Alexa פלואוריד 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td> PBS של Dulbecco </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td> 500 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> אגר נובל </td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100 גרם </td></tr><tr><td> Trypan הכחול </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T8154 </td><td> 0.4% נוזל, סטרילי מסונן </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> האוסר Scientifics </td><td> 1492 </td><td> קו בהיר </td></tr><tr><td> צלחת 4-היטב </td><td> תרם פישר </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> מנקה Harrick פלזמה </td><td> Harrick פלזמה </td><td> PDC-32G </td><td> שואב פלזמה בסיסי </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><tד&gt; </td><td> מיקרוסקופ ניאון (עובד עם השלושה החלקים בהמשך) </td></tr><tr><td> מבדה 10-3 </td><td> מכשיר סאטר </td><td></td><td> מסנן בקר </td></tr><tr><td> מבדה DG-4 </td><td> מכשיר סאטר </td><td></td><td> Ultra-High-Speed ​​אורך הגל switcher </td></tr><tr><td> Hamamatsu EM-CCD מצלמה </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td> מצלמת CCD-מיקרוסקופ </td></tr><tr><td> צינור 15 מ&quot;ל חרוטים </td><td> BD פלקון </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> צינור 50 מ&quot;ל חרוטים </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> ניקון Biostation </td><td> ניקון מכשירים בע&quot;מ </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> מנת תרבות תחתית הזכוכית </td><td> מאטק תאגיד </td><td> P35G-0 </td><td> 35 צלחת פטרי מ&quot;מ, 10 המ&quot;מ microwell </td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells

טיפול חיסוני סרטן יכול לרתום את הספציפיות של תגובה חיסונית למקד ולחסל גידולים. טיפול בתאים מאמץ (ACT) המבוססים על העברת המאמצת של תאי T המהונדס גנטי כדי לבטא רצפטור אנטיגן chimeric (CAR) הראה הבטחה רבה במחקרים קליניים 1-4. ישנם מספר יתרונות לשימוש ברכב + תאי T לטיפול בסרטן, לרבות היכולת למקד אנטיגנים מוגבלים שאינם MHC וfunctionalize תאי T להישרדות אופטימלית, הביות והתמדה בתוך פונדקאי, ולבסוף לגרום לאפופטוזיס של מכונית + תאי T במקרה של רעילות מארח 5. תיחום הפונקציות האופטימליות של רכב + תאי T הקשורים לתועלת קלינית הם חיוניים לעיצוב הדור הבא של ניסויים קליניים. התקדמות בהדמית חי כמו מיקרוסקופיה multiphoton חולל מהפכה בחקר תפקוד תא חיסוני אניn vivo 6,7. בעוד שמחקרים אלה קדמו את ההבנה של פונקציות תא T in vivo, ACT מבוסס תאי T בניסויים קליניים שלנו דורש את הצורך לקשר תכונות מולקולריות ופונקציונליות של הכנות תא T-עירוי מראש עם פוסט עירוי יעילות קלינית, על ידי ניצול ב מבחני חוץ גופיית ניטור תפקודי תא T כמו, והפרשת ציטוקינים cytotoxicity. מבחנים מבוססי הזרימה cytometry סטנדרטיים שפותחו לקבוע את התפקוד הכללי של אוכלוסיות תאי T ברמת התא בודד, אבל אלה אינם מתאימים לניטור צמודה והיווצרות חיים או את היכולת של אותו התא כדי להרוג מטרות מרובות 8. מערכי microfabricated תוכננו בפולימרים ביולוגיים כמו polydimethylsiloxane (PDMS) הם שיטה אטרקטיבית במיוחד מרחבית להגביל effectors ויעדים בנפחים קטנים 9. בשילוב עם מיקרוסקופיה אוטומטית זמן לשגות פלואורסצנטי, thousands של אינטראקציות-היעד פעיל ניתן לפקח בו זמנית על ידי בארות בודדות הדמיה של מערך nanowell. אנו מציגים כאן שיטת תפוקה גבוהה לניטור cytotoxicity תיווך תאי T ברמת התא בודד שיכול להיות מיושמת באופן נרחב ללימוד הפונקציונלי cytolytic תאי טי.

דוגמה ליישום של assay cytolytic התפוקה הגבוהה באה לידי ביטוי באיור 2. בקצרה, שכותרת CAR CD19 ספציפי + תאי T נלקחו ביחד עם מודגרות-EL4 תאי מטרת עכבר שכותרתו בבארות הבודדות של מערך nanowell (סעיפים 1-5). תמונה ראשונית נרשמה במיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי כדי לזהות את התפוסה (effectors ו / או מטרות) של כל אחת nanowell במערך (סעיף 6). עיבוד תמונה נעשה שימוש כדי לזהות את כל nanowells המכיל בדיוק מטרה אחת ומפעיל אחד ולהוציא nanowells המכיל מטרות מתות (סעיף 9). השבב הועבר לחממה ל6 שעות ולאחר מכן תמונה שנייה של השבב נרשם (סעיפים 7-8). יכולתו של מפעיל לגרום לאפופטוזיס בתאי המטרה נמדדה ע&quot;י השאירה עם Annexin V, בnanowells המכיל יעד פעיל ואחת אחת בדיוק. שני ניסויים מקבילים היו לרוץ עם אותם והשפיע ושני סטי oתאי מטרת f (EL4-CD19 + ו-CD19 EL4-(שליטה שלילית)) כדי לקבוע את התדירות של תמוגה אנטיגן הספציפי (איור 2). רצוי להגיע לתדרים נמוכים לתמס הלא ספציפי (~ 2-4%). המתודולוגיה היא תלויה בזמינות של תאי המטרה המתאימים וניסויים מקבילים מנוהלים לקבוע אפופטוזיס ביעדים עצמאיים של effectors. תדרים גבוהים של אפופטוזיס היעד בהיעדר effectors לאורך תקופת 6 שעות (&gt; 8%) מצביעים על צורך לייעל את תנאי assay culturing ו. מערך nanowell יכול להיות מותאם להדמית זמן לשגות כאשר ניטור רציף יש צורך (סרט 1) וזה מאפשר לתצפית של צמיד-יעד מפעיל ולאחר מכן תא מוות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50058/50058fig1.jpg" /> איור 1. א סכמטי של assay cytolytic מבוסס המערך nanowell. מדביק לו תווית CAR +תאי T (כחול) ותאי היעד (אדום) מודגרת במערך של nanowells. מיקרוסקופי משמש לפיקוח cytolysis יעד תיווך מפעיל. micrographs מרוכבים B. היציג של CAR CD19 הספציפי + תאי T אשר יגרמו לאפופטוזיס בEL4-CD19 + תאי היעד ואלה שלא. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50058/50058fig2.jpg" /> איור 2. אנטיגן ספציפי לפעילות cytolytic של מכונית ספציפית CD19 + תאי T. חלקות היסטוגרמה תא יעד של בארות המכילות מפעיל אחד ומטרה אחת אחרי 6 שעות של שיתוף דגירה. היסטוגרמות מתאימות של תאי היעד ללא effectors מוצגות לדווח התדירות של מות תאי רקע. סרט 1. מיקרוסקופיה זמן לשגות של מכונית + cytolysis תיווך התאים T. CAR + תאי T (ללא תווית) היו במשותף עם מודגרות NALM-6-GFP + תאי היעד (ירוק) בnanowell ותמונות נלקחו כל 2 דקות עבור סכום כולל של 12 שעות כדי לאפשר ניטור דינמי. Annexin V נוסף לאמצעי התקשורת ותרבות תאים אפופטוטיים להיות מסומן אדום.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells at JoVE.com

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

אנו מתארים assay תא בודד תפוקה גבוהה למדוד cytotoxicity של תאי T כאשר דגר עם תאי המטרה סרטניים. שיטה זו מעסיקה, מערך אלסטומרי צפוף של תת nanoliter בארות (~ 100.000 / מערך בארות) מרחבית להגביל את תאי T ותאי מטרה ביחסים מוגדרים ומצמידה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח נטייה-היעד פעיל ואפופטוזיס שלאחר מכן.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

quantitative-high-throughput-single-cell-cytotoxicity-assay-for-t

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K Views.  University of Houston. אנו מתארים assay תא בודד תפוקה גבוהה למדוד cytotoxicity של תאי T כאשר דגר עם תאי המטרה סרטניים. שיטה זו מעסיקה, מערך אלסטומרי צפוף של תת nanoliter בארות (~ 100.000 / מערך בארות) מרחבית להגביל את תאי T ותאי מטרה ביחסים מוגדרים ומצמידה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח נטייה-היעד פעיל ו?...

Video: Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

הפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי מנופים עם תאים חד-טי או חלקיק יחיד לספקטרוסקופיית של כוח בודד אימונולוגיים

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...