אורגנוידים גידול נגזר המטופל לשחזר את הארכיטקטורה והתפקוד של רקמת הגידול במדויק עם רבייה טובה יותר של המחלה. לכן, ניתן להעריך במדויק את תגובת המטופל לתרופות נגד סרטן באמצעות מודל זה. organoids הגידול אינם מתאימים עבור מערכת בדיקת תפוקה גבוהה במבחנה או ניתוח תאים בגלל היווצרות אשכולות גדולים בתרבות.
באמצעות טכניקה זו, HTS פשוט ומדויק יותר להערכה של תרופות ממוקדות מולקולריות פותח. מאז התרבות האורגנויד שונה מאוד מתרבות 2D, אפשר להרגיש מבולבל על התרבות בהתחלה, אבל חשוב להתבונן בזהירות את השינויים המורפולוגיים של organoids. לאחר הסרת הנתעבות הקפואה מאחסון חנקן נוזלי, תסעיר בעדינות את האורגנוידים הגידוליים שמקורם בחולה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
מוציאים את הנתעב מאמבט המים ומנגבים עם 70% אתנול. ואז למקם את הקרבון בארון הבטיחות הביולוגית. העבר את organoids הגידול בצינור 15 מיליליטר המכיל את המדיום עבור organoids.
השתמש בפיפטה העברת שלושה מיליליטר לערבב בעדינות את organoids הגידול ובינוני על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים. תפיל את האורגנוידים של הגידול על ידי צנטריפוגה. השלך את supernatant ו resuspend הכדור organoid הגידול בחמישה מיליליטר של מדיום טרי.
מעבירים את ההשעיה האורגנוידית של הגידול לבקבוק T25 ודגרה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר שבוע של המעבר הראשון, להעביר את ההשעיה organoid הגידול משני צלוחיות T25 לתוך שני צינורות צנטריפוגה ולכדור את organoids הגידול על ידי צנטריפוגה. להעריך את נפח הכדור האורגנויד הגידול ולרסן מחדש את הכדור ב 2.5 מיליליטר של בינוני טרי לכל צינור.
תבריכה את ההשעיה האורגנויד הגידולית בצינור אחד. מעבירים את המתלים המרופדים לבקבוק T75 המכיל 10 מיליליטר של מדיום טרי ודגרה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר 24 שעות של שינוי בינוני, טחון organoids הגידול באמצעות תא פיצול מכשיר פיזור מצויד מחזיק מסנן המכיל מסנן רשת 70 מיקרומטר.
לדלל 15 מיליליטר של השעיית organoid הגידול 10 פעמים. השתמש במתקן השעיית התא כדי לזרוע 40 מיקרוליטרים של השעיית אורנואיד גידול מדולל במיקרו-לוחית מיקרו-ספירואידית בעלת חיבור נמוך במיוחד של 384. לאחר 24 שעות, השתמש במפעיל נוזלי כדי להוסיף 0.04 מיקרוליטרים של פתרונות סוכן בדיקה מ -10 דילולים סדרתיים בטווחי ריכוז סופיים של 20 מיקרומולר עד 1.0 ננומולר בבארות, ולדגירה על הצלחת במשך שישה ימים.
בסוף הדגירה, להוסיף ATP תאי מדידת ריאגנט בבארות הבדיקה. השתמש במיקסר כדי לערבב את התוכן של הצלחת ודגורת הצלחת במשך 10 דקות בערך 25 מעלות צלזיוס. השתמש בקורא לוחות כדי למדוד את תוכן ה- ATP התאי כלומינציה.
לאחר 24 שעות של המעבר השלישי, למקם 384-טוב סופרואיד חיבור מיקרו-plate עם 40 microliters של בינוני לכל טוב, צלחת יעד על מערכת לקטוף התא והדמיה. לבנות את תא הקטיף עם שישה מיליליטר של בינוני תרבות צנטריפוגה ב 1, 500 פעמים G במשך שתי דקות כדי להסיר את בועות האוויר. מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של השעיית אורגנויד הגידול בתא הקטיף, ומניחים את תא הקטיף על המערכת.
אפשר לאשכולות התאים להתיישב בתחתית התא למשך דקה אחת לאחר הפיזור ולאחר מכן ליזום את סריקת התא. הגדר את גודל האיסוף ל- 140 עד 160 מיקרומטר במערכת לבחירה אוטומטית של אשכולות תאים. לאחר מכן, בדוק את האיכות של אשכולות התאים שנבחרו בתמונות הסרוקות והעבר 10 אשכולות תאים לבאר באמצעות עצות איסוף ללוח היעד.
במחקר הנוכחי, ההשפעה של סוכנים אנטי סרטניים על organoid הגידול נגזר המטופל הוערך. הרגישות הגבוהה עבור כל סוכני נגדי הסרט צוין על ידי ערכי ריכוז מעכבי מקסימליים למחצה פחות משני מיקרומולר באזור מתחת לערכי העקומה פחות מ 282. להערכת ציטוטוקסיות תאית תלויה נוגדנים, נמדדה ציטוליזיס אחוז של אורגנוידים סרטניים בנוכחות שני נוגדנים שונים.
אחוז הציטוליזה גדל עם הזמן. ללא הנוגדנים בשש שעות עם המשפיע ליחס תא היעד של אחד לאחד, הציטוליזה הגיעה ל -45%בעוד שביחס של שתיים לאחד, הציטוליזה הגיעה ל -70% התא הקטלני הטבעי מתווך ציטוליזיס באמצעות trastuzumab היה כ 60% במשפיע ליחס תא היעד של אחד לאחד, ו 80% ביחס של שניים לאחד בשש שעות. לעומת זאת, cetuximab היה מינון תלוי השפעה על תא הרוצח הטבעי בתיווך ציטוליזה.
בריכוז הגבוה ביותר של cetuximab, 90%ציטוליזה נצפתה במשפיע ליחס תא היעד של אחד לאחד, ו 100%ציטוליזה נצפתה ביחס של שניים לאחד, המציין השפעה גבוהה של cetuximab. מערכת בדיקת תפוקה גבוהה המשתמשת באורגנוידים של גידול שמקורם במטופל עדיפה על הערכת סוכנים פוטנציאליים נגד סרטן ומציגה הזדמנויות להערכת תרופות והתקדמות ברפואה מותאמת אישית.
