טיפול בתאי CAR T השיג הצלחה חסרת תקדים בטיפול בסוגי סרטן פתולוגיים מסוימים. במחקר זה, הצגנו גישה לא ויראלית ומשולבת לאורך זמן ליצירת תאי CAR T חולפים ומספקים נהלים ממוקדים להערכת תפקוד תאי CAR T. המחקר שלנו שואף לייצר תאי CAR T בטוחים ויעילים בגישה חסכונית יותר.
תאי CAR T נוצרים בדרך כלל על ידי התמרה ויראלית. רטרו-וירוסים ואנטי-וירוסים הם הווקטורים הנגיפיים הנפוצים ביותר להעברת גנים מסוג CAR. ייצור וקטורים נגיפיים הוא מורכב ויקר, וההתמרה הנגיפית גורמת לשילוב DNA אקראי וקבוע בקידוד CAR בגנום תא T, מה שעלול לגרום לחששות בטיחות.
הפרוטוקול שלנו מציע גישה לא ויראלית ליצירת תאי CAR T המבטאים CAR באופן טרנזיטיבי בלבד. שיטה זו משתמשת ב-mRNA לביטוי CAR ומשתמשת באלקטרופורציה כדי להעביר את ה-mRNA לתאי T. אין לכך אינטגרציה גנטית לגנום תאי T, והליכי הייצור פשוטים וחסכוניים יותר.
כדי להתחיל, ליניאריזציה של DNA פלסמיד CAR עם אנזים הגבלה BGL2 ולבצע הליך מיצוי DNA אלכוהול כלורופורם איזואמיל. לאחר טיהור ה- DNA הלינארי, ודא את גודל ושלמות התבנית באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. עבור שעתוק במבחנה, מערבבים את מרכיבי התגובה ודגרים על תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לפחות.
לאחר התעתוק, הוסף שני מיקרוליטרים של ריבונוקלאז III, DNase I לתגובה. מערבבים בעדינות ודגרים במשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס כדי לפרק את הדנ"א של התבנית. טהרו את ה-CAR MRNA המתעתק באמצעות ערכת ניקוי RNA ודללו אותו במים נטולי נוקלאז.
מדדו את ריכוז ה-mRNA באמצעות ספקטרופוטומטר לפני אחסונו, בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הפשירו את דגימת ה-mRNA של המכונית המשועתקת ומטוהרת במבחנה על קרח. השהה פעם אחת 10 בחזקתם של שישה תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים במיליליטר אחד של תווך CAR T.
כדי להפעיל את תאי T, הוסף מספר שווה של חרוזי CD3/CD28 אנושיים שטופים מראש. תרבית ומרחיבה את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני למשך מספר ימים. הוסף מיליליטר אחד של מדיום CAR T לכל באר לשתי בארות של צלחת 12 בארות ודגר ב 37 מעלות צלזיוס לשיווי משקל.
עכשיו, להעביר חמש פעמים 10 בחזקת שישה תאי T לצינור סטרילי. כדי להסיר את חרוזי CD3 / CD28, הניחו את הצינור על מעמד מגנטי והכניסו בזהירות את מתלה התא לצינור חדש. צנטריפוגה את הצינור ב 300 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של PBS סטרילי. צנטריפוגר את הצינור שוב ולהשהות מחדש את גלולת התא ב -200 מיקרוליטר של חיץ ניאון T.Mix חמישה מיקרוגרם של CAR MNA מדולל בחיץ הניאון T ו -100 מיקרוליטר תאים בנפח כולל של 125 מיקרוליטר. הוסף 25 מיקרוליטר של חיץ ניאון T ל -100 מיקרוליטר הנותרים של תאים, המשמש כבקרה שלילית.
הגדר את מערכת אלקטרופורציה ניאון ל 1, 800 וולט, 10 אלפיות השנייה, ופעימה אחת. השתמש פיפטה ניאון כדי לשאוף את תאי T CAR mRNA תערובת לתוך ניאון 100 מיקרוליטר קצה אלקטרופורציה התאים. מעבירים מיד את התאים המתחשמלים למדיום התרבית המאוזנת בצלחת 12 הקידוחים ומחזירים את הצלחת לאינקובטור כדי להרחיב את התאים עד שיהיו מוכנים לשימוש.
אחזר את תאי T הנגועים ב- CAR mRNA לצורך ניתוח ציטומטרי זרימה כבר שש שעות לאחר ההתחשמלות. מערבבים את תאי CAR T מספר פעמים עם פיפטה ומעבירים לפחות פעם אחת 10 בחזקת חמישה תאים לצינור מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות של חמישה מיליליטר, או FACS. הוסיפו שלושה מיליליטר של חיץ לשטיפה קרה לצינור וצנטריפוגו את הצינור ב-500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את גלולת התא ב 100 מיקרוליטר של חיץ שטיפה. הוסף שני מיקרוליטרים של נוגדן זיהוי עם תווית פלואורסצנטית ושבעה צבעי כדאיות AAD לתאים המרחפים . מערבבים את הדגימה ודגרים עליה על קרח במשך 30 דקות, תוך הימנעות מחשיפה לאור, ואז שוטפים את התאים עם שלושה מיליליטר של חיץ לשטיפה קרה וצנטריפוגות את הצינור שוב ב 500 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר השלכת supernatant, resuspend את התאים ב 100 מיקרוליטר של חיץ לשטוף מיד לנתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה. הסר את התווך מתאי הגידול המבטא את אנטיגן CAR על פני התא. לאחר שטיפת התאים עם PBS, לדגור אותם עם מיליליטר אחד של 0.05% תמיסת טריפסין EDTA במשך דקה אחת ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להכין תרחיף תא בודד במדיום התרבית המתאים בצפיפות של אחד עד חמש פעמים 10 בחזקת חמישה תאים למיליליטר.
לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי גידול שחומם מראש ללוח E והנח אותו בניתוח תאים בזמן אמת, או מכשיר RTCA, כדי למדוד עכבת רקע, ולאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי הגידול לכל באר ואזן את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. החזירו את לוחית ה-E למכשיר RTCA ועקבו אחר אינדקס התא במשך 24 שעות, כאשר המדידות נלקחות כל חמש עד 15 דקות. למחרת, הכינו את מתלה תאי CAR T.
השהה את הקלטת אינדקס התא והסר את לוח ה- E ממכשיר RTCA. הטו מעט את הצלחת והסירו בזהירות 50 מיקרוליטר של מדיום תרבית מכל באר מבלי להפריע לתאי הגידול, ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של תאי CAR T או תאי T בקרה לכל באר. החזר את לוחית ה- E למכשיר RTCA וחדש את ניטור אינדקס התאים למשך 24 שעות לפחות, עם טאטוא שנלקח כל חמש עד 15 דקות.
עצור את ניטור אינדקס התא ונתח את תוצאת ציטוטוקסיות. לניתוח הפרשת ציטוקינים, מעבירים את הסופרנאטנט מכל באר לתחתית עגולה או לצלחת בצורת V בעלת 96 בארות. צנטריפוגו את צלחת 96 הקידוחים ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ומעבירים בזהירות את הסופרנאטנטים לצלחת חדשה בת 96 בארות.
לבסוף, מדדו את רמות הציטוקינים בסופרנאטנטים באמצעות ערכות ELISA מסחריות. רצף ה-mRNA CAR אומת כגודל של כשני קילו-בסיסים על ידי אלקטרופורזה בג'ל. יותר מ-50% מתאי T הפעילים ביטאו את ה-CAR ביום הראשון שלאחר ההתחשמלות, ועלו ליותר מ-70% ביום השני לפני שירדו לכ-10% ביום החמישי.
תאי CAR T הראו ציטוטוקסיות משמעותית כנגד תאי גידול SK-OV-3 חיוביים ל-HER2, דבר שצוין על ידי ירידה חדה בעכבת הגידול, בעוד שתאי T בקבוצת הביקורת הדגימו השפעה מינימלית. רמות גבוהות של הפרשת אינטרפרון גמא התגלו בתווך תרבית תאי CAR T, אך לא בקבוצת הביקורת.
