קסנוגרפטים של דגי זברה נמצאים בשימוש נרחב לחקר הסרטן. אתה יכול לקחת תאים סרטניים אנושיים ולהזריק אותו זברה קטנה, או אפילו למבוגרים. כאן, מה שאנו מציגים הוא פרוטוקול צעד אחר צעד של מודל הזחל, שבו אנו יכולים לחקור כמה סימני ההיכר של סרטן האדם בבעל חיים.
אתה יכול ללמוד התפשטות, אתה יכול ללמוד אנגיוגנזה, אתה יכול ללמוד גרורות, וגם אינטראקציות בתוך microenvironment הגידול. ויתרון גדול הוא שאתה יכול ללמוד את זה בתוך מסגרת זמן קצרה מאוד. רק ארבעה ימים, למשל.
יתרון גדול נוסף הוא שאתה יכול ללמוד את זה לחיות עם רזולוציה של תא יחיד, באמצעות confocal או מיקרוסקופ גיליון אור. אתה יכול ללמוד איך תאים נודדים, איך תאים אינטראקציה אחד עם השני, או אפילו איך הם מדברים אחד עם השני. אז זה מודל מאוד חזק ללמוד ביולוגיה של סרטן.
ניתן להשתמש בקסנוגרפטים של דגי זברה כדי ללמוד תגובה לטיפולים אנטי סרטניים, כגון כימותרפיה, הקרנות או אפילו טיפולים ממוקדים עם נוגדנים. ולבסוף, גם, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם לשימוש בתאים שמקורם בחולה מדגם כירורגי, או אפילו מביופסיות, ולאחר מכן ליצור את אווטרים זברה. מתכוננים להזרקה.
שבועיים לפני ההזרקה, להרחיב את התאים בתרבות. התחל עם תאים עודפים ודגים עודפים עד להיות בקיא עם הטכניקה, שכן תאים ודגים רבים יאבדו במהלך האימון. טבלה אחת של PDF הנלווה יש מדריך מפורט של האחוזים האופטימליים של מפגש במבחנה להזרקה של מספר קווי תאים.
שלושה ימים לפני ההזרקה, לחצות את הזברה של הרקע הרצוי. 24 שעות לפני ההזרקה. נקו את צלחות העובר של דג הזברה.
השלך את כל העוברים המתים והלא מפותחים ורענן את המדיום E3. בחדר תרבות התאים, השלך את מדיום תרבות התאים. יש לשטוף פעם אחת עם PBS 1X כדי להסיר את התאים המתים ולהוסיף מדיום טרי.
הכן את הכלים להליך ההזרקה, כגון מחטי microinjection, צלחות agarose, סיכות ראש כדי ליישר את העוברים להזרקה. להכנת הצלחת, יוצקים שכבה אחת של מומס 2% agarose במכסה של צלחת פטרי נקייה. תן לו polymerize ובעזרת סרגל, לעשות שלושה עד ארבעה קווים agarose ישר עבור היישור של העוברים.
יום ההזרקה. הפרד את העוברים שבקעו מביצים ללא מים. הוספת Pronase למדיום העובר בשלב זה יכול להגביר את הבקיעה.
מניחים את העוברים באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס עד ההזרקה. תיוג תאים להזרקה. כדי לסייע בהקמת טכניקת תיוג תאים הניתנת לשחזור, בדוק טבלאות אחת ושתיים של הפרוטוקול הכתוב עבור קומפילציה של רשימה של שורות תאים ומספר פתרונות תיוג.
הסר את מדיום תרבות התא ולשטוף את הבקבוק פעמיים עם PBS 1X. תווית התאים עם צבע ליפופילי, הימנעות מחשיפה לאור, ולדגור את הבקבוק ב 37 מעלות. אתה יכול גם לבחור תווית התאים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל על ניתוק.
הסר את פתרון תיוג התא ולשטוף את התאים עם PBS 1X כדי להוציא את הצבע העודף. הוסף את סוכן הניתוק המתאים, והדגיר את התאים ב- 37 מעלות צלזיוס. להקל על תהליך הניתוק על ידי צחצוח הבקבוק עם מגרד תא סטרילי ולאסוף את התאים עם פיפטה סרולוגית.
מעבירים את התאים לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל וצנטריפוגה. להשליך supernatant ולהשעות מחדש את גלולה עם מדיום תרבות התא. כימת את הכדאיות של התא באמצעות תא Neubauer עם הדרה כחולה trypan או שיטה אחרת של בחירה.
צנטריפוגה להשעות מחדש את התאים במדיום ההזרקה. את הריכוזים המומלצים של תאים במדיום ניתן למצוא בטבלה אחת מכתבי היד. מנקודה זו ואילך, התאים חייבים להישמר על קרח.
הליכי הזרקה. יש למרדים את העוברים בטרישקאין 1X למשך 5 דקות. לאחר מכן, להעביר כמות קטנה של עוברים מורדמים לצלחת agarose וליישר אותם בעזרת לולאת סיכת ראש.
הקפד לשמור על מרחק בין העוברים. במיוחד בין החלמון של אחד וראשו של הבא. כדי למנוע תמותה, ודא כי העוברים המיושרים אינם מתייבשים בצלחת agarose על ידי הוספת בזהירות אחת עד שלוש טיפות של פתרון 1X tricaine לצלחת.
הקש קלות על צינור המיקרוצנטריפוגה כדי להשעות מחדש את התאים. טען את מחט ההזרקה עם השעיית תא באמצעות קצה Microloader, הימנעות בועות אוויר, כפי שהם יכולים לסכן את שלמות העוברים. פתח את שסתום לחץ האוויר, להגדיר את microinjector, בזהירות למקם את מחט microinjection לתוך המחזיק.
חותכים את מחט microinjection קרוב לקצה. בזהירות לנקב את החלמון של העובר, להוריד את הזווית של המחט בזהירות דוחף עד קצה המחט מגיע לחלל perivitelline. ברגע הקצה הוא בחלל perivitelline, להזריק את התאים.
נסו להזריק נפח של תאים דומים לגודל העין של העובר, וככל האפשר מהלב כדי למנוע בצקת לב. כוונן את לחץ המיקרו-אינג'קטור, במידת הצורך. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי נקייה עם פתרון 1X של טריקאין ומשאירים אותם לנוח במשך חמש עד 10 דקות.
זה ייתן לפצע זמן לסגור. הסר את פתרון 1X tricaine ולהוסיף בינוני E3 טרי. לאחר מכן, דגירה העוברים ב 34 מעלות צלזיוס.
טמפרטורה זו תאפשר את הישרדותם של עוברי הזברה ותאי הגידול האנושיים. מבחנים גרורתיים. אם אתה רוצה ללמוד את הפוטנציאל גרורתי של קווי התא שלך, בסביבות שעה אחת לאחר ההזרקה, לסנן את העוברים מוזרקים על סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולמיין אותם לשתי קבוצות על פי היעדר או נוכחות של תאים סרטניים במחזור.
יום אחד לאחר ההזרקה. על סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי, לנתח בזהירות כל עובר ולבחור אלה עם גידולים מוזרקים כראוי. מיין את xenografts שנבחרו בהתאם לגודל הגידול.
השתמש בגודל העין להשוואה. השלך את כל העוברים עם מורפולוגיה חריגה, בצקת לב או חלמון, קסנוגרפטים עם מעט מאוד תאים סרטניים, או אלה עם תאים סרטניים רק בתוך החלמון. להפיץ את xenografts על פי הפריסה הניסיונית הרצויה ולהתחיל את בדיקת התרופה.
החלף את התרופות ואת E3 בינוני מדי יום. דגירה xenografts, שמירה על הטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס עד סוף ההסתעפות. ארבעה ימים לאחר ההזרקה.
ביום האחרון של ההסתעפות, יש למרדים את קסנוגרפטים עם פתרון 1X של טריקאין, וליישר אותם בזהירות על צלחת האגר. השלך כל קסנוגרפטים מתים או נפוחים. קסנוגרפטים אלה אינם נחשבים לכימות חריטה.
על סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי, לנתח בזהירות כל xenograft ולהעריך את היעדר או נוכחות של גידולים בחלל perivitelline. על פי ההתקנה הניסיונית, בחר את קסנוגרפטים של עניין המתת חסד אותם עם tricaine 25X. לתקן אותם 4% פורמלדהיד לפחות 4 שעות בטמפרטורת החדר כדי להמשיך עם immunostaining.
אחרת, לאחסן לילה בארבע מעלות צלזיוס ולמחרת, להחליף פורמלדהיד עם 100% מתנול. Xenografts קבוע ב 100% מתנול ניתן לאחסן ב 20 מעלות ללא הגבלת זמן. המערכת החיסונית של ההר כולו עבור הדמיה confocal.
כל טכניקת האימונופלואורסצנטיות של ההר אורכת שלושה ימים, מחולקת כדלקמן. היום הראשון הוא לחדירה של קסנוגרפטים ודגרת נוגדנים ראשונית. היום השני, לשטיפה ודגרת נוגדנים משנית.
והיום השלישי, לשטיפה, קיבעון של קסנוגרפטים ואחסון במדיום ההרכבה. פרטים נוספים על הליך זה ניתן למצוא במסמך PDF הנלווה. הרכבה של קסנוגרפטים.
לאטום את הקצוות של להחליק כיסוי עם ג'לי נפט או גריז סיליקון, כך המדיום הרכבה לא לדלוף. באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את xenografts לתעודת הכיסוי. בזהירות ליישר אותם עם סיכת ראש.
מוסיפים את מדיום ההרכבה לתעודת כיסוי נוספת. הצטרף בזהירות שתי תגיות כיסוי ומניחים אותם על גבי שקופית מיקרוסקופ כדי לאפשר מניפולציה קלה יותר. הדמיה קונפוקלית.
עדשה אובייקטיבית טבילה אפוכרומטית 25X עם תיקון מים היא אופטימלית להדמיית גידולים ברזולוציה של תא יחיד. רכוש את הדגימות באמצעות הפונקציה Z-Stack עם מרווח של חמישה מיקרון בין כל פרוסה. פתח את הנתונים הגולמיים בתוכנת פיג'י.
בחר שלוש פרוסות מייצגות של הגידול מהחלק העליון, האמצעי והתחתון, לכל מחסנית z, לכל קסנוגרפט. פתח את תוסף מונה התאים מתוכנת פיג'י. בכלי מונה תאים, לחץ על אתחול, בחר סוג מונה ולחץ על התמונה כדי להפעיל את מצב הספירה באופן ידני.
עבור כל לחיצה, המונה שואל כמה תאים נספרים. כדי להשיג את המספר הכולל של תאים בגידול, השתמש בנוסחה הבאה. כדי להעריך את המספרים הכוללים או אחוז הסמנים, כגון תאים חיסוניים, דמויות מיטוטיות, מופעל caspase, בין היתר, לכמת באופן ידני את התאים חיוביים תיוג ספציפי, סמן או transgene של עניין לאורך כל הפרוסות של מחסנית z עם תוסף מונה התא.
שים לב שתאים מסוימים ימוקמו בין שתי פרוסות. עבור הלוך ושוב בערימת z כדי לוודא שאף תא לא נספר פעמיים. תוצאות מייצגות.
HCT 116 סרטן המעי הגס קו xenografts נוצרו כמתואר בפרוטוקול. קסנוגרפטים הופצו באופן אקראי בפקדים שאינם מטופלים ובכימותרפיה FOLFIRI. אימונופלואורסצנטיות בוצעה כדי לזהות תאים אפופטוטיים, באמצעות נוגדן caspase-3 אנטי בקע ו DAPI עבור נגד גרעין.
כימות המדד המיטוטי, האפופטוזיס וגודל הגידול, גילה כי FOLFIRI גורם לירידה משמעותית של מיטוזה וגיוס משמעותי של אפופטוזיס, מלווה בהפחתה של 54% בגודל הגידול. תכונות אלה שימושיות במסכי תרופות פנוטיפיות בתפוקה גבוהה, כמו גם כדי לבדוק את ההשפעות המהותיות והפיזיולוגיות של מספר טיפולים בסרטן בתוך זמן קצר. יתרון גדול נוסף של מודל קסנוגרפט זברה הוא שניתן ללמוד את האינטראקציות של תאים סרטניים שונים ולנתח כיצד כל סוג של תא יכול להשפיע על ההתנהגות של השני.
תאים סרטניים אנושיים שונים, שיבוטים שונים מאותו גידול, או מגידולים שונים, ניתן להזריק במשותף. בדוגמה זו, שני קווי תאים סרטניים המעי הגס נגזר מאותו חולה תויגו עם צבעים ליפופיליים שונים מעורבב ביחס של אחד לאחד להזרקה. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יכול לעזור לחוקרים להפוך למומחים אמיתיים ביצירת קסנוגרפטים של דגי זברה.
זה לא קל. אתה צריך להתאמן, להתאמן. אל תוותר.
אני בטוח שתגיע לשם. בהצלחה.
