זרימת העבודה שלנו להקרנת תרופות קסנוגרפט מאפשרת הדמיה וכימות אוטומטיים של תאים סרטניים אנושיים ותגובתם לטיפול תרופתי. זה יכול לשמש כדי לבדוק במהירות את התגובה של תאים סרטניים של סבלנות לתרופות ידועות או לזהות תרכובות נגד סרטן חדש. שימוש במודלים קסנוגרף zebrafish הקרנת סמים מאפשר מספרים משוכפלים Inviva שהיו בעבר רק להשגה עם מערכות במבחנה.
זה גם הרבה יותר חסכוני מאשר מודלים העכבר בהקרנה באמצעות ספריות גדולות של תרכובות. זרימת עבודה זו יש כמה צעדים מן interjection של תאים סרטניים זברה כדי הדמיה של תגובה תרופתית כי הם למדו הטוב ביותר על ידי הדגמה חזותית. כדי להתחיל, צנטריפוגה מינימום של פעמיים 10 לתאים השישי בחמישה מילימטרים של PBS ב 200 פעמים g במשך חמש דקות, ושואפים את העל טבעי.
תן שימוש חוזר בלוח התאים בחמישה מילימטרים של תותכת dii. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור במשך 20 דקות. ואז מערבולת בעדינות להידגר את התאים על הקרח במשך 15 דקות מוגן מפני אור.
ואז צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים g במשך חמש דקות ושואפים את supernatant. לשטוף את התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטר של PBS, צנטריפוגה ב 200 פעמים גרם במשך חמש דקות, ושאיפת העל טבעי. חזור על לשטוף פעם נוספת.
תן שימוש חוזר בתאים במיקרוליטר אחד של PBS לכל 250 אלף תאים חיים והעבר אותם לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מילימטר. שמור את התאים המתווסכים על קרח בחושך. לפני הכתמת תאים והזרקה, להכין צלחות אגרוז להזרקה על ידי שפיכת 25 מיליליטר של שלושה אחוזים agarose ב 1X TBE לתוך צלחת פטרי ולאפשר לו להתגבש.
לאחסן את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים. כמו כן, לפני הכתמת תאים והזרקה, dechlorinate יומיים לאחר הפריה דג זברה באמצעות מדפים תחת מיקרוסקופ ניתוח. משוך מהקצוות הנגדיים של chorion מגן של דג הזברה עם מטלפים עד דמעות chorion ואת דג הזברה הופך מפותח.
כדי למנוע גושים של תאים במהלך microinjection, מראש צמרמורת לא filamentous מחטי זכוכית borosilicate בארבע מעלות צלזיוס או על קרח. מיד לאחר הכתמת תאים, השתמש בקצה פיפס מיקרו-עומס כדי לטעון חמישה מיקרוליטרים של תאים מוכתמים לתוך המחט המצונן. טען את המחט לזרוע המיקרו-מזרק.
מיישרים את קצה המחט בעזרת סכין גילוח סטרילי. באמצעות מיקרומטר שלב, למדוד את גודל טיפה בשמן מינרלי. שמור על נפח טיפה באופן עקבי על שני nanoliters, אשר סביב 1.5 מילימטרים קוטר.
דקה לאחר ההרדמה, מעבירים את הזחלים ההרדמה לצלחת הזרקת משטח שטוחה מוכנה עם שלושה אחוזים אגרוז, ומזריקים לזחלים משאבה אחת של תאים מוכתמים באתר ההזרקה הרצוי. כל הזריקות צריך להסתיים בתוך 1 עד 3 שעות לאחר הכתמת התאים כדי למנוע גושים של המחט. לשטוף את הזחלים את צלחת ההזרקה לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ המכילה E3 מדיה ללא כחול מתילן דגירה ב 28 מעלות צלזיוס לתקופת החלמה של שעה אחת.
מעבירים את המנה של הזחלים המוזרקים לתוך חממה של 34 מעלות צלזיוס. עם צלחת פטרי ריקה המונחת בין המדף לבין צלחת פטרי של זחלים לפעול כחוצץ. בהזרקה לאחר 48 שעות, זחלי דג זברה מסך עבור חריטה תא גידול פלואורסצנטי ובריאות.
הסר כל דג זברה מת או פגום, ובחר דג זברה עם חריטה דומה. הסר דגי זברה לא משופים. עבור דגים מוזרקים חלמון, להסיר דגים שבו גבולות של עול לא ניתן לראות סביב מסת התא חריט.
עבור דג מוזרק קרום הלב, להסיר דגים שבו המסה התא מוזרק פולש לתוך שק החלמון. כדי להעביר את הדג הנבחר לצלחת 96 באר, ראשית לחתוך את הקצה את קצה פיפטה 200 microliter, רק גדול מספיק עבור ארבעה ימים לאחר הפריה דג זברה כדי להתאים דרך. שאפו 150 מיקרוליטרים של מדיה E3 עם דג זברה אחד מהצלחת באמצעות פיפטה P200 ומוסיפים אותו ל באר ריקה של צלחת שטוחה 96 בארות.
הוסף 150 microliters של פתרון תרופה מדולל 2X לכל זחלי דג זברה המכילים כדי להגיע לנפח סופי של 300 microliters עם פתרון תרופה 1X לבא. דגירה הצלחת ב 34 מעלות צלזיוס. תבדקו אם יש דגי זברה מתים מדי יום.
לאחר יומיים, אם תרצה, לרענן את התרופה על ידי החלפת 200 microliters של נוזל מכל באר עם פתרון תרופה 1X או DMSO במדיה E3. בתוכנת זן כחול, להסיר את כל ערוצי פלואורסצנטי לא רצויים בתוכנת ההדמיה ולהוסיף את ערוץ Dii. בדוק את הערוץ הפלואורסצנטי הרצוי.
באותו חלון, בחר כיצד התמונות יצולמו, ערימות Z, אוטומציה, לולאות וסדרות וכו '. תמונה DMSO לשלוט דגים לפני הדגים שטופלו התרופה. ולהגדיר את זמן החשיפה המתאים בתוכנת ההדמיה.
כדי לכמת את הפלואורסצנטיות, פתח את תוכנת imagej. עבור אל הקובץ, פתח ובחר את קובץ CZI הרצוי. התוכנה מעלה חלון אפשרויות ייבוא.
להצגת מחסנית, בחרו היפרסטאקים, בדקו קבצים פתוחים בנפרד, בדקו את קנה המידה האוטומטי ובדקו ערוצים מפוצלים. עבור אפשרות הצבע, בחר בצבע. לאחר מכן לחץ על תוספים, פקודות מאקרו, הקלט.
לחץ על תמונה, התאם, סף. בחרו 'כתב תמונה' כאדום בתפריט הנפתח בצד ימין של חלון הסף. התאם את הסף המינימלי עד שהתוכנה רק תדגיש אזורים עם פלואורסצנטיות ולאחר מכן לחץ על החל.
התוכנה ממירה את התמונה לשחור ולבן עם האזור שנבחר בשחור. לחץ על נתח ולמדוד. התוכנה מושכת את חלון תוצאות המכיל את אזור הפלואורסצנטי עבור תמונה זו.
לחץ על צור בחלון מקליט המאקרו. פעולה זו פותחת חלון חדש עם הקוד עבור המאקרו. סמן את כל התמונות הרצויות לניתוח ופתיחה בהתאם לאפשרות תצוגה או צבע בערימה.
בחר הפעל בחלון באמצעות המאקרו. חלון התוצאות מכיל כעת את האזור עבור כל תמונה. בפרוטוקול זה, בהזרקה של 48 שעות לאחר הזרקת קסנוגרפט, דגי קסנוגרפט הוקרן עבור תאים סרטניים בעלי תווית פלואורסצנטית וטופלו בכימותרפיה או ב- DMSO.
בסך הכל, דגים שנאת זרים שטופלו ב-Vincristine הראו את הירידה הגדולה והעקבית ביותר במסת תאים שנאת זרים בהשוואה לדגים שטופלו ב- DMSO. דגי דקסמתזון שטופלו הראו כמחצית מהירידה באזור הגידול בהשוואה לווינכריסטין. אבל עדיין הראה ירידה באזור הגידול בהשוואה ל- DMSO.
הליך זה יכול לשמש כדי לסנן כל קו תאים סרטניים או מדגם המטופל לתגובה לתרופות שונות או טיפולים ממוקדים ספציפיים נותן תובנה הגידול של כל חולה.
