אנו מודים לג&#39; וג&#39; Cappellani צ&#39;יו לתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמכון הלאומי לסרטן (U01 CA141451), סטאר סרטן Consortium, סוזן ג&#39;קומן לריפוי, לונג איילנד יצא יום 2 למאבק בסרטן השד, קואליציית נשי Manhasset נגד סרטן השד לי, ו מלגת קדם דוקטורט מהתכנית לחקר סרטן שד בימוי congressionally, ארה&quot;ב ESNESN היא גם מקבלת מלגות לסלי ג ויליאם רנדולף הרסט קרן המהירה ומבית הספר ווטסון של מדעי ביולוגיה. Haa נתמך על ידי כספים ממועצת המחקר של נורבגיה (160698/V40 ו151882), ורשויות בריאות אזורית דרום מזרח (2007060).

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development.">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+predicts+breast+cancer+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer--+a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review.</a> Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).</li><li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-mediated+induction+of+a+chemoresistant+niche.">DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche.</a> Cell. 143, 355-366 (2010).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).</li><li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor.">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li><li>Breart, B., Lema&#238;tre, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8++T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice.">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li><li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li><li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows.">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL/6J.">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).</li><li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta.">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells.">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).</li></ol>

המחברים אין ניגודי עניינים לחשוף. כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו IACUC.

את התגובות של גידולים לטיפולים מערכתיים in vivo יכולות להיות שונות באופן דרמטי לאלה של תאים סרטניים במבחנה, כmicroenvironment משפיע גם התגובה והישנות 5 החריפות. אחד המכשולים הגדולים ביותר להבהרה במסלולי chemoresistance vivo הוא המורכבות של יחסי הגומלין בין תאים סרטניים וMicroenvironment. בפרט, משום שגידולים מוצקים פתחו איזון בין הסרטן ותאי סטרומה ביומו של מרכיב אחד, כגון מוות של תאים המתרחש במהלך טיפול נגד הסרטן, עלול לגרום להשפעות דרמטיות על ארגון רקמות. טכניקת הדמית intravital ספקה כאן מאפשרת להדמיה הישירה של אינטראקציות סרטן התאים stroma בתוך הגידולים של עכברים חיים, מורדמים במהלך טיפול עם תרופות נוגדות סרטן. אנו משתמשים במיקרוסקופ ספינינג confocal דיסק, שבו יש עומק חדירה מוגבלת יחסית (ראה 17 </sup&gt;), אבל הטכניקות הניתוחיות ותיוג שלנו ניתן להשתמש בסוגים אחרים של מיקרוסקופיה. סרטים שנרכשו מניסויים אלה ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר תהליכים הכוללים שינויים בעוצמת קרינה (למשל עקב חדירה של אוכלוסייה או אינדוקצית כותרת של מוות של תאים), תנועתיות תא, חלוקת ההזרקה (למשל כדי לעקוב אחר דליפה של כלי דם), ושיתוף לוקליזציה של אותות ניאון 5,12,17,20. באופן שוטף אנחנו עכברי תמונה עבור מעל 6 שעות והדמיה גם בצעה במשך 18 שעות. זה מחייב שמירה על העכברים ברציפות תחת הרדמה לפרקי הזמן הארוכים הללו. בהרדמה ראויה, מעל 90% מבעלי החיים שלנו לשרוד 6 שעות, וכ 80% לשרוד במשך 18 שעות. פרטים על אופן ביצוע הרדמה לטווח ארוך כבר פורסם בעבר 19. מניסיוננו, חמישה גורמים הם קריטיים: הימנעות היפותרמיה, הימנעות התייבשות, שמירה על רמות רוויון חמצן בדם פיסיולוגי, uלשיר גז מוביל humidified לisoflurane, ושמירה על בעלי החיים ברמה הנמוכה ביותר של הרדמה שבה הם לא מראים סימנים של כאב. כדי לשמור על טמפרטורת גוף, אנחנו שומרים עכברים מתחת לשמיכה מחוממת (ב38 ° C). כדי למנוע התייבשות, אנחנו מזריקים כמויות קטנות של ה-IP המלוחה לאורך ההליך כל ההדמיה. כדי לשמור על רמות רוויון חמצן בדם פיסיולוגי, אנחנו מתחילים עם חמצן 21% בגז המוביל (ולא 100% בשימוש נפוץ). זה מאפשר לנו להגדיל את רמות חמצן בשאיפה אם עכבר - שעות לניסוי - מראה ירידה בריווי חמצן בדם. מהניסיון שלנו, להגדיל את רמות החמצן בשאיפה בשלב כזה (למשל כדי 30-40%) כמעט תמיד יתייצב החיה המאפשרת שעות של הדמיה נוספת. הרמה האופטימלית של הרדמה היא עבור רוב העכברים שהושגו עם 1-1.5% isoflurane ותוצאות בשיעורי נשימה של דופק של 400-450/min 60-65/min ו. בניסויי ההדמיה שלנו, אנו משתמשים בעיקר במודל עכבר מהונדסs (MMTV-PyMT וC3 [1]-Tag) שבגידולים הן המולטי, המאפשר הדמיה של נגעים מרובים בשלבים שונים של התקדמות גידול במקביל בx המרובה, עמדות y במהלך הדמיה בודדה. זה מקטין חששות לגבי וריאצית עכבר לעכבר ביחס לניסויים שמטרתם איתור תגובות טיפוליות במה תלויה, ומפחית את מספר בעלי החיים הדרושים להדמיה. מודל MMTV-PyMT (ודגמים אחרים של סרטן ספונטני) לעבור שלבי histopathological מתקדמים שניתן להכיר במהלך הדמית intravital, למרות ההיערכות פתולוגית של נגעים סרטניים שניתן לעשות במהלך הדמית intravital שונה מ, ופחות מפורטת, יותר מזה של סעיפים היסטולוגית 5,17. בניגוד לכך, מודלי השתלה נוטים לשקף גידולים בשלב המאוחר ביותר, כמו התאים הסרטניים בדרך כלל מבודדים מגידולים מתקדמים. מודלים כאלה הם כך נוחים יותר ללימוד גידולי סטרומהאינטראקציות של גידולים בשלב מאוחר מאשר הבדלים באינטראקציות הללו בין שלבים שונים. אנחנו מראים דוגמאות כיצד שינויים מבניים גרעיניים תמונה המתרחשים לאחר מוות של תאים הנגרם על ידי טיפול. בהעדר הטיפול אנטי סרטני, אסטרטגית תיוג זה עשויה במקום לשמש לחלוקת תא תמונה באתר, הבהרה, לדוגמה, כיצד התפשטות תאים ותרדמת מושפעת microenvironment. בעתיד, ניאון תיוג של רכיבי המיטוכונדריה יכול לעשות את זה אפשרי לשינויי תמונת המיטוכונדריה המתרחשים במהלך מוות של תאים אפופטוטיים. בפרוטוקול זה, יש לנו גם הראה דוגמאות כיצד אינטראקציות תמונת סרטן תאי תא חיסון לאחר טיפול, אבל רכיבים microenvironmental אחרים יכולים להיות גם נראים והדמיה. קווי כתב מהונדסים קיימים לרכיבי סטרומה כוללים אלה של fibroblasts (למשל., FSP1-EGFP 17, 21 αSMA-RFP, COL1A1-EG21 FP) או תאים של כלי הדם (למשל Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravital ההדמיה מאפשרת הדמיה בזמן האמת של יחסי הגומלין ותהליכים המתרחשים בממשל כימותרפיה הבא vivo. בעזרת הטכנולוגיה זמינה כרגע, יש לנו התקדמות משמעותית בהבנה כיצד תאי מיאלואידית להשפיע תגובה טיפולית, עם זאת, כי גידול microenvironment הוא כל כך מורכב, התקדמות גדולה עדיין תהיה צורך להתחיל להתעמק מכאני לתוך התהליכים העומדים בבסיס התנגדות לתרופת סביבה בתיווך. אחד הפיתוחים החשובים ביותר עדיין נדרשים הוא זיהוי של סמנים טובים יותר לאוכלוסיות תאים ספציפיות. החשיבות של סמנים טובים יותר מודגמת היטב בשניים ממרכיבי התא סטרומה הבולטים של microenvironment גידולי סרטן השד, fibroblasts ותאי מערכת חיסון. השריר יקטין α-Smooth (αSMA) משמש לעתים קרובות כדי לזהותfibroblasts, אבל החלבון בא לידי ביטוי גם על ידי תאי שריר חלק של כלי דם ותאי myoepithelial 24. כך, למרות שעכברי הכתב αSMA-GFP קיימים, קביעת סוג התא המסוים להיות בא במהלך ניסוי הדמית intravital היא מאתגרת. בדומה לכך, סמן ניאון בודד כגון EGFP הביע תחת אמרגן c-FMS יהיה לעתים קרובות לזהות אוכלוסיות רבות של תאים חיסוניים 12,17. לכן, למרות שאחד באופן אידיאלי הייתי רוצה להשתמש בסמן יחיד לזיהוי סוג תא מסוים את המורכבות של הביולוגיה הבסיסית מהוות אתגר מרכזי בשימוש בגישה זו. פתרון חלקי אחד לבעיה זו הוא שימוש בתוויות בזריקות כדי לבדל אוכלוסיות של תאים המבטאים את אותו כתב ניאון נוסף. לדוגמה, dextrans ניאון הם נלקחו על ידי מקרופאגים וניתן להשתמש בו כדי לתייג את אוכלוסיות macrophage שמתויגים על ידי c-FMS-EGFP והעכברים הטרנסגניים כתב Fsp1-EGFP <sup&gt; 17. נוגדנים מצומדות לבדיקות ניאון יש גם משמשים לזיהוי אוכלוסיות ספציפיות (למשל, את אוכלוסיית Gr1 החיובית של תאי מיאלואידית מתויגים לפי כתב c-FMS-EGFP 17). בניגוד לעקומות תגובת גידול שנוצרו על ידי קליפר מדידה, המספק מידע מכניסטית קצת על איך או למה להגיב לגידולים הטיפוליים מנוהל, או הסדרה היסטולוגית נגזרים מרקמות שנקטפו בנקודתי זמן שונים הדורשות קבוצות גדולות של בעלי חיים, הטכניקה שלנו מספקת מידע ישיר, כימות על הדינמיקה של מוות של תאים ועל יחסי הגומלין של תאי סטרומה עם תאים סרטניים בקבוצות קטנות. לפיכך, היתרון של שימוש בהליך דיווח כאן הוא שהיא מספקת מידע דינמי על תגובות סמים בהקשר של גידול microenvironment השלם בזמן האמת. מידע כזה יכול להוביל לתובנה חשובות בתהליכים הפנימיים המניעים את תגובה טיפולית 5 &lt;/ Sup&gt;.

גידולים מוצקים מורכבים משני תאים עיקריים: תאים סרטניים ועל מרכיבי סטרומה (תאי ובלתי תאי) המסייעים בשמירה על הסביבה מתאימה לצמיחת גידול 1. מרכיבי סטרומה אלה לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות, ההתקדמות, וגרורות של סוגים רבים של סרטן, כוללים אלה של 2-5 שד. סביבת סטרומה משפיעה גם תגובות טיפוליות 2,4,5. לפיכך, קביעה כמה תאים סרטניים מגיבים לטיפולים קונבנציונליים ורומן בהקשר של microenvironment השלם חשוב לקידום ההבנה של ביולוגיה של הסרטן שלנו ושיפור אסטרטגיות טיפול נוכחיות. יתר על כן, ההגדרה כיצד אינטראקציות סרטן התאים stroma לשנות בעקבות מתן הטיפול היא קריטית להבנת הביולוגיה להשנות גידול. מערכות Organotypic שיתוף culturing היו שימושיות לחקר אינטראקציות גידול stroma <sעד&gt; 6, אבל ניכר שהשיטות הקיימות כיום אינם יכולות לסכם microenvironment השלם הגידול במבחנה, בעיקר ביחס לתפקוד כלי דם וגיוס של תאי מערכת חיסון בהצלחה. ואכן, תגובות תא סרטנית לטיפולים שהם נצפו במבחנה הן לעתים קרובות שונות באופן מהותיים מאלה שנצפו בחי, שבי microenvironment הוא ללא פגע 5. לפיכך, במודלי vivo לחקר אינטראקציות גידולי סטרומה והשפיע על תגובה לטיפול עשוי לשקף טוב יותר את המנגנונים רלוונטיים קליני 7. האמצעי העיקרי של בחן את התשובות לטיפול נגד סרטן in vivo עבר מדידות של גודל גידול והערכה היסטולוגית של רקמות מקורם בבעלי חיים או חולים שטופלו. עם זאת, התקדמות במיקרוסקופ וכתבי ניאון בשני העשורים האחרונים אפשרה להדמיה של תהליכים תאיים והבינוברזולוציה גבוהה בבעלי חיים, מורדמים (intravital הדמיה) 8. טכנולוגיות מיקרוסקופיה intravital אלה הוכיחו להיות יקרים במיוחד למרחב ובזמן לנתח בדינמיקה של אינטראקציות vivo גידולי סטרומה ברזולוציה סלולרית והמשנה הסלולר 8,9. תהליכים שכבר נפרמו על ידי הדמית intravital כוללים cytotoxicity נגד גידול התא T 10,11, אינטראקציות בין תאי T ותאי מיאלואידית 12, את הדינמיקה של שינויים בהרכב קולגן וארגון בעקבות טיפול רפואי 13, intravasation תא הסרטני macrophage התלוי וגרורות 14, וחדירות כלי דם 15. יש שלוש דרישות עיקריות עבור הדמית intravital. אלה כוללים היערכות מתאימה וחשיפה של רקמות להדמיה, ניאון תיוג של הרקמה של עניין, ומיקרוסקופיה מצלמה לזווג שלystem מסוגל לרכוש תמונות 16. האסטרטגיות הנפוצות ביותר המשמשות לטיפול בדרישות אלו כוללות: 1) הכנות heterotopic (למשל, חיסון של אוזן או עין ההקפה), קבעה ההדמיה חלונות, או תכשירי exteriorized (למשל, דש עור גב), 2) כתבי ניאון ומהונדס.. הזרקת ניאון לתייג מרכיבי רקמות; ו3) מערכות מיקרוסקופיה multiphoton או confocal זיווג עם צינורות מכפילים או תשלום מצמידי התקנים (CCD) מצלמות, בהתאמה 9. אנו משתמשים במודל דש עור ניתוח מוכן לחשוף את בלוטת החלב מפשעתי עבור הדמיה בחיות מורדמות המבטאות transgenes קידוד כתבי ניאון. תמונות מתקבלות על פני תקופה של 12 עד 40 שעות באמצעות התעצם CCD (ICCD) מצלמה יחד עם מערכת של ארבעה ליזר דיסק ספינינג confocal מיקרוסקופ 17. ההדמיה באופן זה אפשרה לנו ללמוד תהליכים כאלה כמו בהפצת סמי vivo, פרק שלב תלויתגובות emotherapeutic, סוג של מות כימותרפיה תא, והתנהגות תא מיאלואידית 5. אנו מספקים פרוטוקול להדמית intravital של תגובות תא סרטני לטיפול נגד הסרטן ואינטראקציות גידולי סטרומה במודלי עכבר של סרטן השד. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לעקוב אחר ההתנהגויות והמוות של שני תאים סרטניים ורכיבי סטרומה עם מגוון רחב של תוויות ניאון מהונדסות וזריקות במודלים מהונדסים והן השתלה לתקופות של עד 40 שעות בישיבת הדמיה בודדה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> מגיב </td></tr><tr><td> עכברי MMTV-PyMT </td><td> ג&#39;קסון מעבדה </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> (1) עכברי C3-Tag </td><td> ג&#39;קסון מעבדה </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> עכברי ACTB-ECFP </td><td> ג&#39;קסון מעבדה </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> עכברי ACTB-H2B-EGFP </td><td> ג&#39;קסון מעבדה </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> תוצרת הבית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD dextran, fluorescein מצומדות </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> לשקם בDH 2 O (4 מ&quot;ג / מ&quot;ל, חנות ב -20 ° C); לדלל 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל בx PBS 1 </td></tr><tr><td> 10 KD dextran, Alexa פלואוריד 647 מצומדות </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> לשקם בDH 2 O (4 מ&quot;ג / מ&quot;ל, חנות ב -20 ° C); לדלל 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל בx PBS 1 </td></tr><tr><td> דוקסורוביצין הידרוכלוריד </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 44583 </td><td> לשקם בDH 2 O וחנות ב 4 ° C; לדלל בx PBS 1 </td></tr><tr><td> Isothesia (isoflurane) </td><td> אספקת לבריאות בעלי החיים באטלר </td><td> 029450 </td><td> 250 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> יודיד Propidium </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל; מהול 1:15 בx PBS 1 </td></tr><tr><td> חנקן </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חמצן </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> 18G x ½ 1 &quot;מחט פוע רגיל </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> וייל מעבדה, קליפורניה בסן פרנסיסקו </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> תוכנות קוד פתוח </td></tr><tr><td> ספוגית אלכוהול </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> מטליות אלכוהול איזופרופיל 70% </td></tr><tr><td> מערכת הרדמה </td><td> מוצרי הדמיה מולקולרי, ושות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית </td><td> קורנינג </td><td> 2940-245 </td><td> מס &#39;1 וחצי, 24x50 מ&quot;מ; לחטא עם מגבוני isopropanol 70% </td></tr><tr><td> ספוגי גזה סטרילית curity () </td><td> קנדל </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> שקופיות מיקרוסקופ זכוכית </td><td> קורנינג </td><td> 2948-75x25 </td><td> מראש ניקה, אם לא מראש ניקה-, לחטא עם מגבוני isopropanol 70% </td></tr><tr><td> מספריים מצוינים מוקשים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 14090-11 </td><td> 2 זוגות; נירוסטה, טיפים חדים חדים, קצה ישר, חוד חנית מ&quot;מ 26, אורך 11 סנטימטרים </td></tr><tr><td> שמיכה מחוממת </td><td> תעשיות Gaymar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חם חרוז מעקר </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 18000-45 </td><td> הפעל כ 30 דקות לפני השימוש; לעקר כלים ב&gt; 200 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy דבק </td><td> המוצרים של אלמר </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> מעבדת קלטת (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מעבדת קלטת (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מכסה לצידנית קלקר משלוח </td><td></td><td></td><td> זה ישמש כפלטפורמה כירורגית </td></tr><tr><td> מלקחיים מבתרים Micro </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> שיניים עקומה, 1x2 קל, רוחב 0.8 מ&quot;מ, טיפ 4 &quot;אורך </td></tr><tr><td> מלקחיים מבתרים Micro </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> משונן, עקומה קלה, רוחב 0.8 מ&quot;מ קצה; 4 &quot;אורך </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td></td><td></td><td> ספינינג confocal דיסק, שלב Piezo XYZ, capablility epifluourescence 17,25 </td></tr><tr><td> הוספת שלב מיקרוסקופ </td><td> מכשור מדעי Applied </td><td></td><td> מנהג מפוברק, עם שתי יציאות הדמיה מעגליות </td></tr><tr><td> MouseOx oximeter, תוכנה וחיישנים </td><td> סטאר מדעי חיים </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> soakers מעבדת Versi-יבש Nalgene סופר </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> חותך לרבעים להזדנבות פלטפורמה כירורגית </td></tr><tr><td> Nebulizer </td><td> מעבדות סולטר </td><td> 8901 </td><td> נהג ללחלח גזים; מונע גירוי של רקמות ריאה </td></tr><tr><td> מזרק טוברקולין פנוי מתלבש טיפ (מ&quot;ל 1) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> סט עירוי מכונף Surflo </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> x 23 ז ¾ &quot;מחט דקה במיוחד, 12&quot; צינורות </td></tr><tr><td> פולידין ריסוס </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

גידול microenvironment תפקיד מרכזי בייזום בגידול, התקדמות, גרורות, ותגובה לטיפולים אנטי סרטניים. מערכות תלת ממדיות שיתוף התרבות משמשת לעתים קרובות כדי להסביר אינטראקציות גידול stroma, כולל תפקידם בתגובות לסמים. עם זאת, רב של אינטראקציות המתרחשות בגוף חי בmicroenvironment השלם לא יכול להיות משוכפל לחלוטין באלה בהגדרות חוץ גופייה. לפיכך, להדמיה ישירה של תהליכים אלה בזמן האמת הפכה לכלי חשוב בהבנת תגובות גידול לטיפולים וזיהוי יחסי הגומלין בין תאים סרטניים וstroma שיכול להשפיע על תגובות אלה. כאן אנו מספקים שיטה לבאמצעות מיקרוסקופיה confocal דיסק המסתובבת של עכברים חיים, מורדמים להתבונן ישירות סמי הפצה, תגובות ושינויים באינטראקציות גידול stroma בעקבות ממשל של טיפול מערכתי במודלים של סרטן שד תאי סרטן. אנו מתארים נהלים לlabeliרכיבים שונים ng סרטני, טיפול בבעלי חיים להתבוננות תגובות טיפוליות, וההליך כירורגי לחשיפת רקמות סרטניות להדמיה 40 שעות. התוצאות שהתקבלו מפרוטוקול זה הן סרטי זמן לשגות, שבתהליכים כגון חדירת סמים, מוות של תאי סרטן ונדידת תאי סטרומה ניתן להעריך באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

אנו מתארים שיטה לתגובת הדמיה לטיפול נגד הסרטן<em&gt; In vivo</em&gt;, ברזולוציה של תא בודדה.

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

live-imaging-drug-responses-tumor-microenvironment-mouse-models

Google

Research

JoVE Journal

Medicine

24.6K Views.  Watson School of Biological Sciences. אנו מתארים שיטה לתגובת הדמיה לטיפול נגד הסרטן In vivo, ברזולוציה של תא בודדה.

Video: Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

בתחום ההדמיה vivo של פליטת אור Dynamics היפוקסיה גידול של גרורות סרטן השד המוח במודל של עכברים

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

מיים מודלים של הדמיה חיה של תאים 4D גידול: אינטראקציות microenvironment המשפיעים ממאירה התקדמות

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

רב מודלי הדמיה של אנגיוגנזה מודל עכברים עירום של גרורות סרטן השד עצם באמצעות דימות תהודה מגנטית, טומוגרפיה ממוחשבת נפחית ו אולטראסאונד

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

חניכה של סרטן השד גרורתי על ידי מיקוד של האפיתל ductal עם Adenovirus-Cre: דגם רומן מהונדס עכבר של סרטן השד

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

מולקולרי פרופיל של microenvironment הגידול פולש במודל 3 ממדים של תאי סרטן המעי הגס ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; פיברובלסטים

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

בתדירות גבוהה אולטראסאונד הדמיה של בלוטות לימפה עכבר צוואר הרחם

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...