המחקר שלנו מתמקד בטיפול בגרורות של סרטן השד באמצעות טיפולים מונחי תמונה על פלטפורמה של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל. המטרה היא לפתח טיפולים יעילים המכוונים ספציפית לרקמות גרורות, שהן הגורמים העיקריים למוות הקשור לסרטן. זה יכול להיות מאתגר לקבוע אם טיפולים מערכתיים הגיעו לרקמה הרצויה מבלי להקריב בעלי חיים.
ניתן לדמות את הננו-חלקיק שלנו באמצעות MRI ושיטות הדמיה אופטיות, מה שמאפשר לנו לעקוב אחר העברת תרופות והצטברות בבעלי חיים חיים. הטיפולים הנוכחיים לסרטן שד גרורתי אינם ספציפיים לגרורות, יש להם יעילות משתנה וגורמים לתופעות לוואי לא רצויות. פלטפורמת הננו-חלקיקים שלנו מכוונת ספציפית לנישה הגרורתית ומאפשרת ניטור לא פולשני של מסירתה ללא עדות לתופעות לוואי.
בעבר, השתמשנו בפלטפורמת הננו-חלקיקים שלנו כדי להתמקד בגורם לגרורות, miR-10b, והצלחנו לעצור גרורות וצמיחה של גרורות. עם עין על תרגום קליני, אנו חוקרים את הפרמקודינמיקה של נוסחה זו כדי לייעל את משטר הטיפול ולמקסם את היעילות. כדי להתחיל, הניחו את המטריג'ל הקפוא על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לאפשר לתמצית המטריצה להתנזל.
לאחר קביעת המספר הכולל של התאים הדרושים למחקר, נסה תאים ושטוף עם PBS. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 200 גרם למשך 5 דקות. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של PBS מקורר כדי ליצור את מלאי התאים.
כעת, יש לדלל את מספר התאים הכולל ל-40 כפול 10 בחזקת 6 תאים למיליליטר. לאחר מכן הוסף נפח שווה של תמצית המטריצה המצוננת כדי להשיג ריכוז סופי של 1 כפול 10 בחזקת 6 תאים לכל 50 מיקרוליטר. שמור את התערובת על קרח כדי למנוע מהתמצית להתמצק לפני ההשתלה.
העבירו את העכבר המורדם לקונוס אף על כרית חימום. לאחר אישור מישור ההרדמה הכירורגי, יש למרוח משחת עיניים כדי להגן על העיניים מפני ייבוש הקרנית. לאחר מכן נקו את העור ליד מקום ההזרקה עם מגבון אלכוהול והניחו לו להתייבש מספר שניות.
לגרום לבלוטת החלב מספר ארבע כדי למזער את חפיפת האותות בין הגידול הראשוני לאתרי גרורות נפוצים. כעת, פיפטה את מלאי התאים למעלה ולמטה כדי לתלות מחדש את התאים. שאב 50 מיקרוליטר מתרחיף התאים הקרים כקרח לתוך מזרק אינסולין עם מחט בגודל 29.
הכנס את שיפוע המחט ישירות מתחת לפטמה של בלוטת החלב הרצויה, במקביל לגוף העכבר, והזריק את התאים בקצב קבוע ואיטי. השאירו את המחט בעור לפחות 5 שניות לאחר השלמת ההזרקה כדי לאפשר למטריג'ל להתמצק ולמנוע דליפה. לאחר מכן, העבירו את העכבר לכלוב נקי על משטח חימום להתאוששות והשגיחו עד שהוא יהיה אמבולטורי לחלוטין ויכול לשמור על שכיבה על עצם החזה.
כדי לעקוב אחר צמיחת הגידול והתפתחות הגרורות, יש להזריק 150 מיליגרם לק"ג משקל גוף של לוציפרין תוך צפקי למודל עכבר סרטן שד גרורתי מורדם. החזירו את העכברים לכלוב שלהם על משטח חימום כדי לאפשר להם להתעורר ולעכל את הלוציפרין. לאחר מכן, דמו את העכברים באמצעות סורק מערכת ההדמיה, החל כ-10 דקות לאחר ההזרקה עם לוציפרין.
צלם עד 5 עכברים יחד במצב שכיבה, וודא שכל גופם כלול בסימוני ההנחיה של שדה הראייה ומכוון ישר ככל האפשר. השתמש בסרט שקוף כדי לאבטח את זרועותיהם כדי לדמיין טוב יותר את בלוטות הלימפה בבית השחי. כעת, בתוכנת מערכת ההדמיה, הגדר את החשיפה לאוטומטי, Binning לבינוני, FStop ל-1, עירור לחסימה, פליטה לפתיחה, FOV ל-D וגובה ל-1.50 להדמיית ביולומינסנציה.
בעת הדמיית הגידול הראשוני, שבדרך כלל מייצר אות חזק בשל מיקומו השטחי, הגדר את החשיפה לאוטומטי. אם אתה עוקב אחר גרורות, כסה בזהירות את הגידול הראשוני בסרט חשמלי שחור והגדר ידנית את החשיפה ל-300 שניות כדי ללכוד אותות חלשים. כדי להתחיל, שקלו את עכברי סרטן השד הגרורתיים, שכן מינון הננו-תרופה מבוסס על משקל הגוף.
הכן מזרק אינסולין עם מחט בגודל 29 מלאה ב-10 מיליגרם ברזל ננו-תרופה לכל קילוגרם משקל גוף עכבר. לאחר מכן טבלו את זנב החיה המורדמת במים חמים בטמפרטורה של 30 עד 35 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות כדי להרחיב את ורידי הזנב. לאחר מכן יש לנגב עודפי מים מהזנב ולנקות את מקום ההזרקה במגבון אלכוהול של 70%.
כעת, הכנס את שיפוע המחט לווריד הזנב הצדדי בערך באמצע הזנב. משוך מעט את הבוכנה לאחור כדי לאשר את המיקום עם פלאשבק של דם לתוך המחט. לאחר החדרה מוצלחת, יש להזריק את הננו-תרופה בקצב איטי של כ-5 עד 10 שניות להזרקה של 40 מיקרוליטר.
ודא הזרקה מוצלחת על ידי היעדר תמיסה שהצטברה מתחת לעור הזנב ליד מקום ההזרקה, ועל ידי התכהות הווריד מתמיסת הננו-חלקיקים הכהה. החזק לחץ על מקום ההזרקה בעזרת גזה והסר את המחט. שמרו על לחץ למשך כ-30 שניות עד להפסקת הדימום.
כדי לאסוף דגימות גרורות, התחל בהדמיית העכברים באמצעות הדמיית ביולומינסנציה. לאחר איסוף הגרורות, הניחו את הרקמות שנאספו בצלחת פטרי. בתוכנת מערכת ההדמיה, הגדר את החשיפה לאוטומטי, Binning לבינוני, FStop ל-1, עירור לחסימה, פליטה לפתיחה, FOV ל-D וגובה ל-1.50 להדמיית ביולומינסנציה.
להדמיית פלואורסצנטיות, הגדר את החשיפה לאוטומטי, Binning לבינוני, FStop ל-1, עירור ל-675, פליטה ל-720, מפלס המנורה לגבוה, FOV ל-D, גובה ל-1.50. לאחר מכן דמו את פגר העכבר עם BLI כדי לקבוע אם נותרה רקמה סרטנית שכדאי לאסוף. לאחר מכן, שטפו את רקמות הסרטן שנאספו ב-PBS.
כדי לאסוף רקמות למיקרוסקופיה או תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך כמותית, הטמיעו אותן בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית ואחסנו אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לעיבוד. כדי לאסוף רקמות לספקטרוסקופיה אופטית של פליטה אופטית של פלזמה בצימוד אינדוקטיבי, יש להשתמש בקנה מידה באמצעות שפופרת ריקה של 1.7 מיליליטר. הניחו את הרקמה בצינור ורשמו את משקלה.
לאחר הקפאת הרקמה, יש לאחסן אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהיא מוכנה לעיבוד. חתך את טמפרטורת החיתוך האופטימלית המוטמעת דגימות קפואות טריות על שקופיות מיקרוסקופיה בעובי של 10 מיקרומטר. התאם את טמפרטורות החדר ומחזיק הדגימה בין מינוס 20 מעלות צלזיוס למינוס 15 מעלות צלזיוס, בהתאם לסוג הרקמה.
קבע את חלקי הרקמה על השקופיות על ידי טבילתם בתמיסת 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות. שוטפים בזהירות את השקופיות עם PBS. לאחר מכן כיסוי ההרכבה מחליק על השקופיות באמצעות מדיום המכיל DAPI כדי להמחיש ארכיטקטורת רקמות.
השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחון את קטעי הרקמה עבור פלואורסצנטיות Cy5.5, מה שמעיד על העברת ננו-תרופות. ודא שאות הקרינה אינו רעש רקע על ידי השוואתו לדגימת בקרה שלילית מבעל חיים שלא הוזרק. העכברים שטופלו בננו-תרופות הראו אותות ביולומינסנטים משמעותיים בגרורות ריאה שבוע לאחר מתן התרופה, מה שאישר נוכחות של גרורות ברקמות הריאה.
הדמיה פלואורסצנטית אישרה את הצטברות Cy5.5 מהננו-תרופה רק ברקמות הריאה הגרורות של עכברים שטופלו.
