אנו מודים לד&quot;ר הארווי הנסלי לקבלת תמיכה טכנית מומחה שלו. עבודה זו נהנו מן השימוש הבא Fox Chase Cancer Center (FCCC) מתקנים: מתקן המעבדה של בעלי חיים קטנים מתקן הדמיה חיה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי נבג סרטן השחלות ב FCCC / UPenn (P50 CA083638), הליבה FCCC מענק (P30 CA006927), לבין סרטן השחלות קרן מחקר.

I. הכנה של תאים סרטניים השחלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול סרטן השחלות שורות תאים להביע בלוציפראז בתרבות. מקורות בלוציפראז ניתן Firefly, Renilla, או מינים אחרים. תאים להביע את חלבוני ניאון יכול לשמש גם. להדגמה זו אנו משתמשים בסרטן השחלות התא קו, OVCAR5, להביע גחלילית בלוציפראז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים באמצעות טכניקה שגרתית תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את ההשעיה תא (10,000 תאים / μL) ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) על הקרח עד זמן ההזרקה. </li></ol> השנייה. Intrabursal Injection הליך זה מחייב סיוע מאדם נוסף. כל הנהלים כירורגית מתבצעת בתנאים aseptic. זה כולל לבוש בלבוש כירורגית באמצעות מכשירי ניתוח סטרילי, מזרק, ומחטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההרדמה על ידי ערבוב 3 מ&quot;ל של קטמין הידרוכלוריד (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל), 1.6 מ&quot;ל של hydrochloride xylazine (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל), 1.5 מ&quot;ל של acepromazine (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל), ו 20 מ&quot;ל של נתרן כלוריד 0.9%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מספר הזיהוי של בעלי חיים בריאות הנצפה. להרדים את החיה עם ההרדמה קטאמין-xylazine-acepromazine מוכן באמצעות הזרקה (IP) intraperitoneal עם נפח מנה של 8 ~ 9 מ&quot;ל / ק&quot;ג משקל גוף (BW). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא החיה תחת רגיל מקובלת של הרדמה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן עם מלקחיים או אצבעות רגליו האחוריות של החיה. אם יש דוושת רפלקס, לחכות מישור עמוק יותר של הרדמה עד החיה אינו מגיב על הליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צד הגב חיה על כרית גזה סטרילי עם הראש שלה מול משם בזנב מול כלפיך. נקודת החתך ממוקם שמאלה או ימינה של קו האמצע ומעל השחלות. גילוח או להרטיב את הפרווה עם אלכוהול 70% בנקודת החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העור הרטובות בעזרת מלקחיים לעשות חתך קטן עם מספריים במיקום dorsomedial ישירות מעל למקלדת השחלות שומן. כרית שומן השחלות צריך להיות גלוי מתחת לפני השטח של קיר הבטן. כרית השומן לזיהוי בקלות על ידי צבע לבן שלה לעומת רקמת ורוד כהה המקיפים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם בעדינות את בטנה קיר הבטן ולעשות חתך קטן כמתואר לעיל (5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו כרית ספוג גזה סטרילי מלוחים על קו האמצע הסמוך החתך. אתר את כרית השחלות שומן בעדינות למשוך אותו החוצה והשאר זה על גבי גזה. לייצב את השחלה על ידי כיווץ כרית שומן עם קליפ בולדוג. על פי עמדה לנתח מיקרוסקופ, השחלה כדי לאפשר החדרת המחט (30 מד, ז) לתוך לכופף את אבובית oviduct המובילים בבורסה. כאשר המחט מוחדרת לתוך המיקום הנכון, זה צריך להיות גלוי תחת בורסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות את הבוכנה של המזרק להזריק 5 μL ההשעיה תא בין בורסה לבין השחלה בעוד מזרק ממוקם באתר ההזרקה. צעד זה דורש שני אנשים. אדם אחד דוחף את הבוכנה, בעוד אדם אחר טוען המיקום של המחט. הסר את המחט במהירות לאטום את האתר לנקב בעדינות אבל מספיק כדי לא לקרוע את אמתח ו אבובית. בורסה צריכה להיראות קצת נפוחה עם זריקה נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את כרית השומן קליפ בולדוג בעדינות להחליף את מערכת הרבייה ובחזרה כרית השומן לתוך חלל הצפק. בעדינות לסגור את הקיר על ידי משיכת הגוף רירית הבטן העליונה מעל בטנה התחתונה. סגור את העור עם סיכות כירורגי או קליפים הפצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה מחלים לכלוב שלה לספק מקור חום בטוח כדי למנוע היפותרמיה להאיץ התאוששות. נטר את קצב הנשימה וקלות, החזרת טונוס שרירים, ואת היכולת לנוע מרצונם החופשי. כל אלה הם סימנים של התקדמות טובה לקראת התאוששות. סטייפלס או קליפים הפצע ניתן להסיר 7 ימים או יותר לאחר ניתוח. </li></ol> ג. מינהל Gavage אוראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 18 ~ 20 מחט G gavage או צינורית האכלה עם קצה מעוגל. מחט gavage צריך להיות לא יותר מאשר המרחק מקצה ראשו של בעל החיים הצלע האחרונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מספר הזיהוי של בעלי החיים ובריאות הנצפה. בעדינות עורף החיה ידי אחיזה בעור על הכתפיים עם האגודל והאצבעות. איפוק אמור להיות תקיף מספיק עבור גפיים קדמי להיות מורחב לכל צד ו מהדרך. חיה לא אמור להיות מסוגל לתפוס את המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את הראש לאחור של החיה עם האצבע המורה, ויוצרים קו ישר דרך הצוואר והוושט. תמיכה לאחור של החיה עם החלק הפנימי של האגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות ובלי כוח, הכנס את המחט gavage משני צדי הפה על הלשון. בתנועה חלקה אחת, המחט צריכה לעבור כנגד גג הפה לאורך הוושט. Gravity צריכים להנחות את המחט בלי התנגדות לפגישה. אם יש כל resistance, להוציא את המחט ולהתחיל מחדש. איסור פרסום של בעלי חיים רפלקס לבלוע עשוי להיות מופעלות במהלך הכניסה. עם זאת, לא אמורה להיות שום התנגדות או מתנשף מן החיה. חשוב לוודא כי בעל החיים הוא נושם כאשר המחט נמצאת במקום על ידי בדיקת תנועת הנחיריים והחזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לדחוף את הבוכנה של המזרק לוותר נפח המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את המחט gavage בזווית מסלול אותו כדרך זה הוכנס במורד הוושט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזירים את החיה לכלוב שלה נשימה לפקח על התנהגות 5 ~ 10 דקות. </li></ol> IV. Imaging in vivo אנו משתמשים Caliper מדעי החיים לפקח על התנהגותם של תאים שהוחדר לתוך חלל intrabursal. ניסויים באמצעות מערכת זו בדרך כלל יש פרק זמן של 4 ~ 16 שבועות ממועד ההשתלה הגידול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של D-luciferin (המצע של גחלילית בלוציפראז) על ידי המסת 5 ~ 20 מ&quot;ג 1 מ&quot;ל PBS וסינון דרך הממברנה 0.22 מיקרומטר עיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת קאמרית אינדוקציה ידי הפעלת חמצן והן גז isoflurane. הפוך על זרימת הגז לתא אינדוקציה בלבד. קצב זרימת isoflurane נשמר ברמה נמוכה עד חיות מוכנים הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מספר הזיהוי של בעלי החיים ובריאות הנצפה. מניחים את החיה בחדר אינדוקציה מואשם גז isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מן החדר כאשר החיה נראית רדומה. ספק 200 μL של פתרון luciferin מוכן באמצעות הזרקה IP באמצעות מחט 30 G. חשוב לרשום את זמן ההזרקה על מנת לשמור על עקביות בין זמן ההזרקה luciferin וביצועים הדמיה לאורך כל תקופת המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את גב luciferin-מוזרק חיה לתוך תא אינדוקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מערכת הדמיה את ההגדרות המתאימות. הקפד לאתחל את המערכת לפני הרכישה את התמונה החיה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכבות את זרימת הגז לתא אינדוקציה ולהדליק את זרימת הגז לתא הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הגב חיה בהרדמה או בצד הגחון למעלה. הקפידו למקם את האף של החיות בצורת חרוט האף כדי לשמור על אינדוקציה הרדמה תקין. ודא החיה בתוך &quot;נקודת עניין של רשת&quot; כפי שצוין על ידי אור ירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הדלת של החדר ולרכוש את התמונה בזמן המתאים. הזמן יכול להיקבע על ידי קינטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מבית הבליעה הדמיה ולמקם אותו חזרה לכלוב שלה. צג התאוששות של החיות כפי שתואר &quot;הזרקת Intrabursal&quot;. </li></ol> V. תוצאות נציג <img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. הדמיה Vivo של תאים סרטניים בשחלות במודל עכבר orthotopic. OVCAR5 תאים להביע בלוציפראז הוזרקו intrabursally לתוך השחלה ימין צילמו לאורך זמן. תמונות צולמו 13 (משמאל), 17 (באמצע), ו 22 (ימין) ימים לאחר ההזרקה באמצעות מערכת הדמיה IVIS ספקטרום. בצד הגב מוצג בלוח העליון בצד הגחוני הוא בפאנל התחתון. שים לב כי התפשטות של תאים סרטניים הצפק 22 ימים לאחר ההזרקה. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים Fox Chase Cancer Center של ועדת שימוש.

<ol>
	<li>Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li><li>Lynch, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+ovarian+carcinoma:+heterogeneity,+molecular+genetics,+pathology,+and+management.">Hereditary ovarian carcinoma: heterogeneity, molecular genetics, pathology, and management.</a> Mol Oncol. 3, 97-137 (2009).</li><li>Yap, T. A., Carden, C. P., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+chemotherapy:+targeted+therapies+in+ovarian+cancer.">Beyond chemotherapy: targeted therapies in ovarian cancer.</a> Nat Rev Cancer. 9, 167-181 (2009).</li><li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+are+necessary+to+predict+therapy+of+transplantable+tumors+in+mice.">Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).</li><li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation:+advantages+and+disadvantages.">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages.</a> Eur J Cancer. 40, 852-857 (2004).</li><li>Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intraperitoneal,+orthotopic,+and+metastatic+xenograft+models+of+human+ovarian+cancer.">Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer.</a> Mol Ther. 10, 1032-1042 (2004).</li><li>Greenaway, J., Moorehead, R., Shaw, P., Petrik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-stromal+interaction+increases+cell+proliferation,+survival+and+tumorigenicity+in+a+mouse+model+of+human+epithelial+ovarian+cancer.">Epithelial-stromal interaction increases cell proliferation, survival and tumorigenicity in a mouse model of human epithelial ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 108, 385-394 (2008).</li><li>Connolly, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ovarian+cancer.">Animal models of ovarian cancer.</a> Cancer Treat Res. 149, 353-391 (2009).</li><li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging.">Bioluminescence imaging.</a> Proc Am Thorac Soc. 2, 537-540 (2005).</li><li>Lehmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+and+multimodal+in+vivo+imaging+of+tumor+hypoxia+and+its+downstream+molecular+events.">Longitudinal and multimodal in vivo imaging of tumor hypoxia and its downstream molecular events.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 14004-14009 (2009).</li><li>Connolly, D. C., Hensley, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+and+Transgenic+Mouse+Models+of+Epithelial+Ovarian+Cancer+and+Non-Invasive+Imaging+Modalities+to+Monitor+Ovarian+Tumor+Growth+In+Situ:+Applications+in+Evaluating+Novel+Therapeutic+Agents.">Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non-Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In Situ: Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents.</a> Current Protocols in Pharmacoogy. 45, (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

סרטן השחלות הוא הגורם המוביל למוות בין כל מחלות ממאירות גניקולוגיים 1. שיעור התמותה גבוה של מחלה זו נובעת בעיקר אבחון מאוחר שלה והיעדר שיטות אבחון אמין 2. יתר על כן, לעתים קרובות כימותרפיה קונבנציונלית מפגשים chemoresistance ו הישנות של סרטן 3. לכן, רומן הרפוי נדרש למקד באפקטיביות את המחלה הזאת. בפיתוח טיפול חדש לסרטן השחלות מיקוד האדם, חשוב לפתח מודל החיה נציג. מודל החיה orthotopic יש יתרונות על פני מודלים xenograft קונבנציונאלי (למשל תת עורית או זריקות intraperitoneal של תאים סרטניים) כי ב 1) היא משחזרת את האתר הראשי של היווצרות הגידול, 2) היא מייצגת אתר משותף של גרורות, ו 3) הוא מספק תאים סרטניים אל אינטראקציה עם microenvironment המתאים 4, 5, 6, 7, 8. מכרסמים יש קרום bursal ייחודי המקיף את השחלה, והוא רצוף עם oviduct. זה האנטומיה הייחודית של מכרסמים מאפשר הזרקה של תאים סרטניים בשחלות orthotopically. מזריקים תאים סרטניים בשחלות Intrabursally להתנהג בדומה מחלות אנושיות, ובכך גדל בתוך קרום intrabursal והפצת לתוך חלל הצפק עם התקדמות הגידול. הזרקה של תאים luciferases ביציבות להביע או חלבוני ניאון מאפשרת גם מעקב אחר התנהגותם של תאים סרטניים בזמן אמת. Bioluminescent ו / או טכנולוגיית הדמיה ניאון מאפשרת שוב ושוב תאים סרטניים התמונה על פני תקופה ממושכת של זמן הגידול המחקר צמיחה, הפצה, רגרסיה בצורה לא פולשנית 9, 10, 11. בהקמת מודל orthotopic, חשוב להסיר במהירות את המחט מתוך בורסה על הזריקה. הסרה פתאומית של חותמות מחט לנקב את האתר ומונע זליגה של התאים מוזרקים. עם זאת, באותו הזמן, התנועה צריכה להיות עדין לא לקרוע את בורסה. אם הדליפה מתרחשת במהלך ההזרקה, זה יכול לגרום לתאים זרע בבטן ואפשרות לבלבל את המחקר, כלומר, הפצת מוקדמת מחוץ השחלה. במקרה זה, חיה הספציפי צריך להיות מוקלט בעקבות לפיתוח אתרי גידולים מרובים הצפק לפני הטיפול, או לחילופין לבטל מן הניתוחים שלאחר מכן. לפני ביצוע gavage אוראלי, חשוב לבדוק את אורך הצינור gavage ידי מדידת מקצה ראשו של בעל החיים הצלע האחרונה. זה מועיל כדי לסמן את התחתית אפו של בעלי חיים לא להעביר את הצינור בעבר סימן זה. החדרת הצינור בעבר סימן זה יכול לגרום נקב בבטן. קביעת אורכו של הצינור הוא חשוב במיוחד עם בעלי חיים או חיות צעירות מתחת לגיל 20 גרם במשקל לאחר החדרת המחט gavage למטה הוושט, לא אמורה להיות שום התנגדות או מאבק של החיה. חשוב לא לנהל את הפתרון או השעיה מהר מדי כמו זה יכול להוביל רפלוקס ולאחר מכן לספק נפח במינון מדויק, כמו גם הוספת מתח לחיה. לקבלת תוצאות הדמיה דומה מעת לעת, רצוי לשמור על עקביות בין זמן ההזרקה של המצע הדמיה בלוציפראז ו. לשגות הזמן ניתן לקבוע על ידי לקיחת סדרה של תמונות לאחר ההזרקה המצע ולבחון את קינטיקה של אותות. פיתוח מודל העכבר orthotopic של סרטן השחלות, משלוח של תרופות דרך הפה, ו in vivo הדמיה טכניקות הכרחי להבנה טובה יותר של התפתחות והתפשטות של סרטן השחלות להערכת משטרי טיפולית חדשנית שעשויים בסופו של דבר לשפר את התוצאה של חולה עם מחלה זו קטלני.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lloyd, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acepromazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>122796</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer

סרטן האדם התגובה לטיפול מיוצג יותר במודלים של בעלי חיים orthotopic. מאמר זה מתאר את התפתחות מודל העכבר orthotopic של סרטן השחלות, טיפול בסרטן באמצעות מתן תרופות דרך הפה, וניטור של התנהגות תאים סרטניים בתגובה טיפול תרופתי בזמן אמת באמצעות מערכת הדמיה vivo. במודל זה orthotopic, תאים סרטניים בשחלות להביע בלוציפראז הן למריחה על העור, על ידי הזרקת אותם ישירות לתוך בורסה עכבר שבו כל השחלה היא סגורה. עם הזרקה של D-luciferin, מצע של גחלילית בלוציפראז, בלוציפראז-לבטא בתאי ליצור אותות פליטת אור. אות זה הוא זוהה על ידי מערכת הדמיה vivo ומאפשר פולשני אמצעי ניטור הגידול, הפצה, רגרסיה בעלי חיים בודדים. והתרופות gavage דרך הפה מאפשר נפח המינון המקסימלי של 10 מ&quot;ל / ק&quot;ג משקל גוף להיות ישירות הקיבה דומה אספקת תרופות וטיפולים רפואיים. לכן, הטכניקות המתוארות כאן, פיתוח מודל העכבר orthotopic של סרטן השחלות, משלוח של תרופות דרך הפה, ו in vivo הדמיה, שימושיות עבור הבנה טובה יותר של סרטן השחלות טיפול האדם וישפר מיקוד המחלה הזאת.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer at JoVE.com

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

במודלים של בעלי חיים orthotopic של סרטן השחלות לשכפל טוב יותר מחלות אנושיות, ולכן לשפר את ההבנה שלנו של התקדמות סרטן תגובת הגידול לטיפול. מודל העכבר מקבל זריקה intrabursal של בלוציפראז-להביע תאים סרטניים בשחלות. טיפול מנוהל באמצעות gavage הפה. הגידול מנוטרת על ידי<em&gt; In vivo</em&gt; מערכת הדמיה.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

in-vivo-imaging-therapeutic-treatments-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

33.1K Views.  Women's Cancer Program.  中文 

Video: In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

עכבר דגם orthotopic של סרטן המעי הגס

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and future drug-eluting stents.
A variety of antibodies and transgenic and knockout strains are available in rats. Consequently, a model for in-stent restenosis in the rat would be convenient for pathobiological and pathophysiological studies. 
In this video, we present the full procedure and pit-falls of a rat stent model suitable for high throughput stent research. We will show the surgical procedure of stent deployment, and the assessment of in-stent restenosis using the most elegant technique of OCT (Optical Coherence Tomography). This technique provides high accuracy in assessing plaque CSAs (cross section areas) and correlates well with histological sections, which require special and time consuming embedding and sectioning techniques. OCT imaging further allows longitudinal monitoring of the development of in-stent restenosis within the same animal compared to one-time snapshots using histology.

This video demonstrates how to use a preclinical inexpensive and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of in-stent restenosis development. Longitudinal in vivo monitoring using OCT (Optical Coherence Tomography) and analysis of OCT images are also demonstrated.

In-סטנט restenosis הדמיה: דגם זולה, Preclinical אמין, מהיר

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major clinical challenge because no efficient method exist for their elimination once their dissemination is underway. A better understanding of the mechanisms regulating cancer cell invasion may lead to the development of novel potent therapies. Due to their physiological resemblance to tumors, spheroids embedded in collagen I have been extensively utilized by researchers to study the mechanisms governing cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). However, this assay is limited by (1) a lack of control over the embedding of spheroids into the ECM; (2) high cost of collagen I and glass bottom dishes, (3) unreliable immunofluorescent labeling, due to the inefficient penetration of antibodies and fluorescent dyes and (4) time-consuming image processing and quantification of the data. To address these challenges, we optimized the three-dimensional (3D) spheroid protocol to image fluorescently labeled cancer cells embedded in collagen I, either using time-lapse videos or longitudinal imaging, and analyze cancer cell invasion. First, we describe the fabrication of a spheroid imaging device (SID) to embed spheroids reliably and in a minimal collagen I volume, reducing the assay cost. Next, we delineate the steps for robust fluorescence labeling of live and fixed spheroids. Finally, we offer an easy-to-use Fiji macro for image processing and data quantification. Altogether, this simple methodology provides a reliable and affordable platform to monitor cancer cell invasion in collagen I. Furthermore, this protocol can be easily modified to fit the users&#8217; needs.

Presented here is a protocol for the fabrication of a spheroid imaging device. This device enables dynamic or longitudinal fluorescence imaging of cancer cell spheroids. The protocol also offers a simple image processing procedure for the analysis of cancer cell invasion.

הדמיית פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן וניתוח של פלישת תאים סרטן במודל ספרואיד 3D

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...