עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המדע הלאומי האמריקנית (EAR-0920299 וEAR-0745808); קרן המדע הלאומי של ארה&quot;ב למזרח אסיה ומכונה קיץ פסיפיק; החברה הגיאולוגית של אמריקה תכנית מענק מחקר והמענקים בוגר למחקר ומלגות למוסמכים מאוניברסיטת אוהיו. ברצוננו להודות לעורך ושני בודקי אנונימיים להערות תובנה שלהם.

1. MTB אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מחליטים על אתר מים מתוק לאסוף חיידקי magnetotactic (MTB), הוא לעתים קרובות טוב ביותר להתחיל עם אגם או נחל איטי שיש שכבת משקע בוצית רכה. בהפגנה זו אספנו מדגם בקצה נהר Olentangy בקמפוס של אוניברסיטת אוהיו (OSU) בקולומבוס, אוהיו (ארה&quot;ב). אמנם זה היה במיקום נוח להפגנה שלנו, הפרוטוקול המתואר כאן הוא ישים לכל מיקום מימי. החומרים המשמשים בפרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלת 1. מצא את מיקום שבו עומק המים הוא בין 10 ל 100 סנטימטר. במיקום כזה, אתה צריך לאסוף את השכבה העליונה ביותר של שימוש במכל ברור, מתברג משקעים. סקופ משקעים ומים לתוך המכל עד שהוא מלא בסחף שליש למחצית ונפח שנותר במים. שמור את המכל השקוע עד שהוא מלא במים ולאחר מכן בחוזקה מכסה את מכל with המכסה מתברג. זה לא הכרחי כדי לערבב את המשקע. נגב את החלק החיצוני של המכל במגבת היבש ולאחר מכן לקחת את הדגימה למעבדה שלך. זה לא הכרחי למהר מדגם בחזרה למעבדה שלך. השארנו לי דגימות MTB במכלי פלסטיק בתחום במשך כמה ימים לפני שהחזרת אותם למעבדה שלנו. MTB צריך להיות בת קיימא במשך כמה שבועות עד חודשים, כל עוד אתה שומר את הדגימות במקום קריר ומוצל בתחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמדגם הוא במעבדה שלך, שחרר את המכסה ולהשאיר אותה מכסה את המכל כדי להפחית את כמות האידוי. אחסן את המכל בטמפרטורת חדר בחדר חשוך, מגירה, או לכסות את המכל בנייר אלומיניום לחלוטין. אפשר המשקעים וחלקיקים להתיישב לחלוטין לתחתית המכל על ידי השארת המדגם באין מפריע במשך כמה שעות לכמה ימים. אין צורך לערבב את המשקעים, MTB מעדיף סביבה באין מפריע. הקירות הברורים של מכל הפלסטיקיאפשר לך לאשר כי החלקיקים התיישבו לתחתית. בהתאם לדוגמא שלך, MTB יכול להישאר בחיים במדגם במשך חודשים רבים. </li></ol> 2. בידוד MTB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה מוכן לבודד את MTB, מגנטי המקום בצדדים של מכל הפלסטיק כ 1 סנטימטר מעל לממשק משקעי מים (איור 1 א). היזהר שלא להפריע למשקעים בתחתית המכל. הנח את הקוטב הדרומי של מגנט לבר בצד אחד של המכל והצד הצפוני של מגנט עוד בר בצד השני (איור 1 א). כמעט כל מגנט יכול לשמש, כגון בר סערה מגנטית או מגנט למקרר גדול. כל דבר יכול לשמש כדי לתמוך במגנטים בגובה הנכון מעל לממשק משקעי מים. אנחנו מצאנו שנחנו את המגנטים על גבי קרטון או קופסא פלסטיק הוא טוב ביותר, עם זאת, את המגנטים יכולים גם להיות מודבקים מחוץ לקופסא הפלסטיק. חכה 30 דקות לכמהשעות עבור החיידקים לשחות אל המגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה סטרילית, כדי לאסוף את המים בזהירות מתוך המכל (איור 1 א) בסמוך לעמדתו של בר מגנט דרום מוט (לדוגמאות שנאספו בחצי הכדור הצפוני). מים זה צריכים להכיל MTB שנמשך למגנט לבר דרום מוט. בשלב בא, מסלול מירוצי נימים יש להשתמש כדי להעשיר MTB נוסף. </li></ol> 3. מסלול מרוצה MTB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להעשיר את המדגם שלך עם חיידקי magnetotactic, מסלול מירוצי נימים הוא הכרחי (1B 1C ואיורים). אלה צריכים להיעשות לפני מבודדים את התאים מיכל הפלסטיק שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5.75 אינץ&#39; (146 מ&quot;מ) הזכוכית פיפטה פסטר להפוך את מסלול מרוצה. השתמש בעט יהלומים או קובץ לחתוך את החלק העליון של פיפטה, אורכו של פיפטה הוא לא קריטי, אבל זה צריך להיות מסוגל להכיל כ 1-2 מ&quot;ל של מים. בשלב הבא, להשתמש במבער בונזן כדי להמס את הקצה כך שהוא הופך להיות אטום (האיור 1C). פיפטה התוצאה צריכה להיות סוף פתוח וסוף סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך כמה ממסלולים המרוצים אלה ולאחר מכן חיטוי. בנוסף, תצטרך חיטוי הכותנה וכמה מחטי מתכת ארוכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מים מסוננים מדגם, נאספו ליד ממשק מי משקעים שמוצגים באיור 1 א &#39;, למסלול מירוצי autoclaved באמצעות מחט מתכת ארוכה המחובר למזרק מסונן. הגודל הנקבובי של המסנן צריך להיות 0.22 מ&quot;מ לחסל פסולת ומזהמים מהמים. חשוב להיות בטוח לחלוטין שאין בועות אוויר בזכוכית נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את החלק התחתון של מסלול המירוצים עם כותנת סטרילי (האיור 1B). השתמש במחט המתכת לדחוף צמר גפן לקראת הסוף החתום של מסלול המירוצים אז זה 0.5-1 סנטימטר מרחק מהקצה האטום (האיור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה סטרילית, להוסיף את המים המכילים MTB (מסעיף 2.2) למדגם reservoir (סוף פתוח) של מסלול מירוצי MTB מוכן (1B איור). </li></ol> 4. העשרת MTB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמסלול המירוצים מלא בנוזל דגימה, ולהניח אותה בצד שלה על משטח אופקי (למשל, benchtop) ולמקם את הקוטב הדרומי של מגנט לבר (בחצי הכדור הצפוני) בסמוך לקצה האטום של מסלול המירוצים (האיורים 1B ו1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחכות 5 עד 30 דקות לMTB להעביר דרך הבד. אז אתה צריך לאסוף את הנוזל שבקצה המסלול. מחכה זמן רב מדי יכול להציג את חומרים מזהמים, כמו חיידקים ניעתי אחרים, לקצה הנימים. לחלופין, אתה יכול להשתמש במיקרוסקופ אור כדי להציג את קצה מסלול המירוצים ולצפות MTB לאסוף בקצו של המסלול המרוצה. זה יאפשר לך לקבוע כמה הזמן לוקח לMTB נודד דרך תקע הכותנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להשתמש בסכין היהלום לעשות שריטה קטנה ליד תקע כותנה ולהטיח סוף המסלול המרוצה. </li> &lt;li&gt; השתמש במזרק 1 מ&quot;ל עם מחט צר (25 או 27 מד) כדי להסיר את הנוזל מקצה המסלול המרוצה. דגימת נוזל זה צריכה עכשיו מכילה המועשר MTB. </li></ol> 5. תצפית MTB ידי מיקרוסקופי אור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טיפה (10-20 μl) של מדגם MTB המועשר על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר להעיף את coverslip על כך הטיפה כעת פונה כלפי מטה ותלוי מcoverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את coverslip על גבי טבעת O-המונחת על משטח זכוכית. O-הטבעת צריכה להיות בקוטר קטן מעט יותר ואז coverslip (כ 1 סנטימטר; איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טיפה תלויה זה על במת מיקרוסקופ אור ולהתמקד בקצה אחד של הירידה. אובייקטיבי יבש 60x עובד טוב מאוד, כי רוב יש צמצם מספרי גבוה (NA; למשל, 0.93), אך אינו דורשים שמן, שקשה להשתמש בשיטת הטיפה התלויה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקצה הדרומי של מגנט קרוב לבר ד התלייהROP וMTB יתחילו לנדוד לכיוון הקצה של הירידה הקרובה ביותר למגנט (איור 3). תוך כמה דקות MTB רב צריך להיות בקצה הירידה (איור 3). להוכיח לעצמך שאת החיידקים הם על ידי היפוך מגנטיים של מגנט המוט ולאחר מכן לבחון את החיידקים לשחות בכיוון ההפוך. </li></ol> 6. תצפית MTB על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים (TEM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טיפה (~ 20 μl) של המועשר MTB על רשת נחושת ולאפשר לחיידקים להתיישב למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתילה את עודפי מים עם פיסת נייר סינון נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אפשר לצבוע את הרשת באופן שלילי עם 2% יצטטו uranyl, pH החומצה phosphotungstic 2% 7.2, או 2.5% נתרן 7 molybdate, 8, 9. הדבר נעשה על ידי הצבת רשת הנחושת על ירידה של כתם מייד לאחר דגירת הרשת עם המועשר MTB. דגירת הרשת עם הכתם שלילי, הזמנים משתנים בהתאם לרחעין בשימוש, ולאחר מכן את פתיל הנוזל בפיסת נייר סינון נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב MTB באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM, איור 4). לעבודה מתוארת כאן MTB היה adsorbed לFormvar התייצב ו200 רשתות פחם מצופות רשת נחושת (טד פלה # 01800). הרשתות הונחו בצד הפחם על ירידה של השעית תא לתקופה של עד 10 דקות, ולאחר מכן שטף מייד פעם אחת על ידי הצבת הרשת על טיפת המים למשך 30 שניות. לצביעה, הרשתות הונחו על ירידה של 2% יצטט uranyl (טד פלה # 19481) למשך 30 שניות עד 5 דקות ולאחר מכן ייבשו באמצעות פיסת נייר סינון לחלוטין. הרשתות נותחו על ידי TEM או באמצעות רוח Tecnai פיי ב80kV או פיי Tecnai F20 באמצעות STEM הגבוה זווית הכהה טבעתי בתחום 200kV. </li></ol>

<ol>
	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190, 377-379 (1975).</li><li>Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).</li><li>Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Biomineralization+of+Magnetite+(Fe3O4)+and+Greigite+(Fe3S4)+in+a+Magnetotactic+Bacterium.">Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).</li><li>Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cultured+Greigite-Producing+Magnetotactic+Bacterium+in+a+Novel+Group+of+Sulfate-Reducing+Bacteria.">A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria.</a> Science. 334, 1720-1723 (2011).</li><li>Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=South-seeking+magnetotactic+bacteria+in+the+Northern+Hemisphere.">South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere.</a> Science. 311, 371-374 (2006).</li><li>Wolfe, R., Thauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'capillary+racetrack'+method+for+isolation+of+magnetotactic+bacteria.">A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).</li><li>Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+structure+in+a+many-celled+magnetotactic+prokaryote.">Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote.</a> Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).</li><li>Moench, T. T., Konetzka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+isolation+and+study+of+a+magnetotactic+bacterium.">A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium.</a> Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).</li><li>Balkwill, D., Maratea, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+a+magnetotactic+spirillum.">Ultrastructure of a magnetotactic spirillum.</a> Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).</li><li>Lins, U., Freitas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+homemade+apparatus+for+harvesting+uncultured+magnetotactic+microorganisms.">Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).</li><li>Jogler, C., Lin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Cloning+of+the+Magnetotactic+Metagenome:+Identification+of+Magnetosome+Island+Gene+Clusters+in+Uncultivated+Magnetotactic+Bacteria+from+Different+Aquatic+Sediments.">Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).</li><li>Lin, W., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+Isolated+but+Uncultivated+Magnetotactic+Bacterium+of+the+Phylum+Nitrospirae+from+Beijing,+China.">Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).</li><li>Li, J., Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization,+crystallography+and+magnetic+properties+of+bullet-shaped+magnetite+magnetosomes+in+giant+rod+magnetotactic+bacteria.">Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria.</a> Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).</li><li>Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosomes+and+magnetite+crystals+produced+by+magnetotactic+bacteria+as+resolved+by+atomic+force+microscopy+and+transmission+electron+microscopy.">Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy.</a> Micron. 43, 1331-1335 (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

חיידקי Magnetotactic לא נמצאים בהכרח בכל סביבה מימית 8 אבל כאשר הם עושים להתרחש, ניתן למצוא אותם בצו של 100 - 1000 תאים למ&quot;ל 2. כדי לצפות בMTB באמצעות מיקרוסקופיה אופטית, תצטרך כ 50 חיידקים / מ&quot;ל במדגם שלך 8. אם אין או מעטי MTB בדוגמא שלך, אז אתה גם צריך לבחור אתר סב?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם פריט </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שקופיות זכוכית </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S95933 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית pipets פסטר </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 13-678-6A </td><td></td></tr><tr><td> O-Ring </td><td> חנות לחומרי בניין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תלושי כיסוי </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 12-542B </td><td></td></tr><tr><td> מגנט בר </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S95957 </td><td></td></tr><tr><td> מכולה </td><td> כל </td><td></td><td> כל plastic או מכל זכוכית שיכול להכיל לפחות 0.5 ליטר ויכול להיות אטומה </td></tr><tr><td> כותנה </td><td> כל </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ עם עדשה יבשה 60x </td><td> Zeiss </td><td></td><td> עדשת 60x יבשה היא לא הכרחית, אבל זה נותן לי NA גבוה מבלי להשתמש בשמן </td></tr><tr><td> יהלומי עט </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 08-675 </td><td></td></tr><tr><td> מסנן מ&quot;מ 0.22 </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 09-719C </td><td></td></tr><tr><td> מזרק 1 מ&quot;ל </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> NC9788564 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות microcentrifuge </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 02-681-320 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar / פחם200 רשת, רשתות נחושת </td><td> טד פלה בע&quot;מ </td><td> 01800 </td><td></td></tr><tr><td> תצטט Uranyl </td><td> טד פלה בע&quot;מ </td><td> 19481 </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai הרוח TEM </td><td> פיי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> פיי </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment

חיידקי Magnetotactic (MTB) הם מיקרואורגניזמים ימיים שקודם תוארו בעיקר בשנת 1975 1 מ דגימות משקעות שנאספו בביצות מלח של מסצ&#39;וסטס (ארה&quot;ב). מאז MTB התגלה במים ומרובדת משקעי עמודות מכל רחבי העולם 2. תכונה אחת משותפת לכל MTB היא שהם מכילים magnetosomes, שהם nanocrystals תאי, קרום בכריכה מגנטית של מגנטיט (3 Fe O 4) ו / או greigite (3 Fe S 4) או שניהם 3, 4. בחצי הכדור הצפוני, MTB נמשכים בדרך כלל לקצה הדרומי של מגנט לבר, ואילו בחצי הכדור הדרומיים שהם בדרך כלל נמשכים לקצה הצפוני של מגנט 3,5. מאפיין זה יכול להיות מנוצל בעת ניסיון לבודד MTB מדגימות סביבתיות. אחת הדרכים הנפוצות ביותר למעשירים MTB הוא להשתמש במכל פלסטיק שקוף כדי לאסוף משקעים ומים ממקור טבעי,כגון ברכת מים מתוקים. בחצי הכדור הצפוני, בקצה הדרומי של מגנט בר ממוקם על החלק החיצוני של המכל בדיוק מעל המשקעים בממשק משקעי מים. לאחר זמן מה, החיידקים ניתן להסירו מהצד הפנימי של המכל ליד המגנט עם פיפטה והעשירו עוד יותר על ידי שימוש במסלול מירוצי נימים 6 ומגנט. ברגע שהתעשר, החיידקים יכולים להיות ממוקמים בשקופית מיקרוסקופ באמצעות שיטת טיפה תלויה ונצפה במיקרוסקופ אור או שהופקד על רשת נחושת ונצפה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM). באמצעות שיטה זו, מבודד MTB ניתן ללמוד מיקרוסקופי כדי לקבוע מאפיינים כגון שחי התנהגות, סוג ומספר שוטונים, מורפולוגיה תא של התאים, הצורה של הגבישים המגנטיים, מספר magnetosomes, מספר רשתות magnetosome בכל תא, ההרכב של את גבישי nanomineral ונוכחות וקואולות תאית.

מגנט הוא כלי יעיל שניתן להשתמש בו כדי לבודד חיידקי magnetotactic (MTB) הכלולים בדגימות סביבתיות (איור 1 א). מסלול מירוצי נימים (האיור 1B) משתמש בתכונות המגנטיות של MTB כדי למשוך אותם דרך תקע כותנה שבו הם יכולים להיות מופרדים ממיקרואורגניזמים שאינם magnetotactic הכלול?...

Watch this Scientific Journal Video about Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment at JoVE.com

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

אנחנו מדגימים את שיטה לאיסוף חיידקי magnetotactic (MTB) שניתן להחיל על מים הטבעיים. MTB יכול להיות מבודד ומועשר מדגימות משקעות באמצעות התקנה פשוטה יחסית שמנצלת את המגנטיות הטבעית של החיידקים. המבודד MTB אז ניתן לבחון בפירוט שימוש באור ומיקרוסקופ אלקטרונים.

אוסף, בידוד והעשרה של חיידקים המתרחשים באופן טבעי מMagnetotactic הסביבה

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

collection-isolation-enrichment-naturally-occurring-magnetotactic

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Views.  The Ohio State University. אנחנו מדגימים את שיטה לאיסוף חיידקי magnetotactic (MTB) שניתן להחיל על מים הטבעיים. MTB יכול להיות מבודד ומועשר מדגימות משקעות באמצעות התקנה פשוטה יחסית שמנצלת את המגנטיות הטבעית של החיידקים. המבודד MTB אז ניתן לבחון בפירוט שימוש באור ומיקרוסקופ אלקטרונים.

Video: Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

והעשרה של תאים NK מ דם אדם עם קיט RosetteSep מ StemCell טכנולוגיות

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

דם אוסף של סרטן הפרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. Birds are widely used subjects in biological research and are ideal for studies involving repeated sperm samples. However, few resources are currently available for those wishing to learn how to collect and extract DNA from avian sperm. Here we describe cloacal massage, a gentle, non-invasive manual technique for collecting avian sperm. Although this technique is established in the literature, it can be difficult to learn from the available descriptions. We also provide information for extracting DNA from avian semen using a commercial extraction kit with modifications. Cloacal massage can be easily used on any small- to medium-sized male bird in reproductive condition. Following collection, the semen can be used immediately for motility assays, or frozen for DNA extraction following the protocol described herein. This extraction protocol was refined for avian sperm and has been successfully used on samples collected from several passerine species (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus, and Turdus migratorius) and one columbid (Columba livia).

This protocol describes cloacal massage, a non-invasive manual technique for collecting semen from birds, and DNA extraction from avian sperm using a commercial extraction kit with modifications.

אוסף העופות זרע על ידי עיסוי Cloacal ובידוד של ה-DNA של הזרע

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ability to biomineralize magnetosomes, which are magnetic nanometer-sized crystals of magnetite (Fe3O4) or greigite (Fe3S4) surrounded by a lipid bilayer membrane, within their cytoplasm. For most known magnetotactic bacteria, magnetosomes are assembled in chains inside the cytoplasm, thereby conferring a permanent magnetic dipole moment to the cells and causing them to align passively with external magnetic fields. Because of these specific features, magnetotactic bacteria have a great potential for commercial and medical applications. However, most species are microaerophilic and have specific O2 concentration requirements, making them more difficult to grow routinely than many other bacteria such as Escherichia coli. Here we present detailed protocols for growing three of the most widely studied strains of magnetotactic bacteria, all belonging to the genus Magnetospirillum. These methods allow for precise control of the O2 concentration made available to the bacteria, in order to ensure that they grow normally and synthesize magnetosomes. Growing magnetotactic bacteria for further studies using these procedures does not require the experimentalist to be an expert in microbiology. The general methods presented in this article may also be used to isolate and culture other magnetotactic bacteria, although it is likely that growth media chemical composition will need to be modified.

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

We present a procedure for growing several strains of Magnetospirillum in two different types of growth media. Magnetospirillum gryphiswaldense strain MSR-1 is grown in both liquid and O2 concentration gradient semi-solid media while M. magneticum strain AMB-1 and M. magnetotacticum strain MS-1 are grown in liquid medium.

גידול חיידקים Magnetotactic של סוג Magnetospirillum: זנים MSR-1, השגריר-1 ו- MS-1

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

סניקה של הסביבה העירונית - צינור לדגימה וזיהוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

איסוף רקמות ומיצוי RNA ממפרק הברך האוסטאוארטכרטית האנושי

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...