This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cient&#236;ficas (CSIC).

הערה: נהלי ניסוי אושרו על ידי הוועדה לחקר אתיקה של Universidad de האוטונומית מדריד ונערכו בפיקוחו של Universidad de האוטונומי מדריד ראש רווחת בעלי החיים והבריאות בהתאם להנחיות ספרדיות ואירופאיות. עכברים גדלו בדיור ספציפי הפתוגן חופשי (SPF) והם מורדמים על ידי צוות מיומן ומוסמך באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) שיטת שאיפה. 1. עכבר מח עצם נגזר DCs בידול וזיהום הערה: איור 1 מסכם הצעד הראשון הזה. צריכה להתבצע כל הנהלים בברדס מנקודה זו ואילך, רק באמצעות תקשורת, מכשירים, טיפים פיפטה סטרילית ומנות תרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידול DCs נגזר מח עצם עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח tibias ועצמות ירך מאחד C57 / BL6 עכבר 22 ולהעביר לתוך צלחת פלסטיק עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך כל epiphysis את, עם מספריים סטרילי ולחשוף מח עצם, שבו יש צבע אדום בהיר אופייני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות את החלק הפנימי של העצם עם 10 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS) המכיל 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) וחומצת 5 מ&quot;מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (חיץ / BSA / EDTA PBS) באמצעות מזרק סטרילי על פטרי סטרילי צַלַחַת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא צנטריפוגות בצינור ב 600 XG בצנטריפוגה בקירור (4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 1 מיליליטר של אמוניום-כלוריד-אשלגן חיץ (ACK) lysing (0.15 מ &#39;4 Cl NH, 10 מ&quot;מ KHCO 3 ו 0.1 mM EDTA) דגירה במשך 30 שניות בRT כדי לחסל תאי דם אדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) ולסנן דרך מסננת תא (70 מיקרומטר) כדי להסיר שברי עצמות וגושי תא לפני צנטריפוגה באותה המהירות (600 XG) כי גושים בוטלו על ידי סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאיםד להתאים ל5 x 10 5 תאים / מיליליטר עם RPMI 10% FBS (B-mercaptoethanol 50 מיקרומטר המכיל, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ) ולהוסיף 20 ng / ml גורם רקומביננטי עכברי granulocyte-מקרופאג שולט בקולוניה- גירוי (RM-GM-CSF) כריכוז סופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעיה זו לאיכות סטרילי, מיקרוביולוגים, 15 סנטימטר צלחת פטרי, ותרבות בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל שלושה ימים, ספין למטה שני תאים שאינם חסיד ותאים מנותקים עם 5 מ&quot;מ EDTA ב PBS וגלול בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר של צפיפות תאים, עם מדיום טרי המכיל 20 ng / ml RM-GM-CSF. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התבגרות של טעינת DCs וAntigen <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 9, resuspend התאים בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר של צפיפות במדיום המכיל 20 ng / ml RM-GM-CSF. ואז להוסיף 20 ng / ml של lipopolysaccharide (LPS) כדי לאפשר ביטוי גבוה MHC-II בתאי דגירה בצלחת שטופלה תרבות הלא-רקמת סטרילי 15 סנטימטר פטרי במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אחדיום של LPS-גירוי, להכתים כמה תאי DC עם נוגדנים נגד CD11c עכבר, MHCII וGr-1 כדי לבדוק בידול DCs על ידי cytometry זרימה. דוגמא לניתוח cytometry הזרימה של DCs מוצגת באיור 3 א ו3B. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה DCS (5 x 10 5 תאים / מדגם) עם נוגדנים חד שבטיים נגד העכבר-CD16 / CD32 על 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר של ריכוז סופי ב -50 μl PBS / BSA EDTA חיץ / לדגימה. לאחר מכן, להוסיף 50 μl של הנוגדנים נגד MHCII (IA / IE), CD11c וGr-1 מצומדות עם fluorochromes שונה ב1: 100, 1: 200 ו- 1: 500 ב- PBS / BSA / חיץ EDTA בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לשטוף DCs עם PBS / BSA / חיץ EDTA ולנתח ידי cytometry זרימה על פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: אם התאים מובחנים היטב, תאים מוכנים לטעינת אנטיגן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף DCs עם RPMI 10% FBS (ללא אנטיביוטיקה) דגירה אותם עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) בצינור פלסטיק 1 מיליליטר של RMPI 10% בינוניים FBS לכל 5 x 10 6 DCs עבור שעה 1 המינימום ב 37 מעלות צלזיוס. כביקורת שלילית, לעזוב DCs ללא דוגרים עם OVAp. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום של DCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק DCs על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 חיידקים (10 חיידקים לDC) לשעה 1 בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי DC פי 3 ב- PBS ו1x בFBS 10% RMPI צנטריפוגות ב 450 XG כדי לשטוף את רוב החיידקים תאיים. לבסוף, תאים גלולים ב 10% בינוניים RMPI FBS (ללא אנטיביוטיקה) בשעת 20 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li></ol></li></ol> 2. בידוד של CD4 + T לימפוציטים מעכברים הטרנסגניים OTII הערה: איור 1 מסכם שלב שני זה. יש להשתמש בבלוטות הלימפה במקום טחול לבודד תאי CD4 + T, כי חלקם של לימפוציטים מסוג CD4 + בבלוטה לימפהs (~ 50%) הוא גדול יותר מאשר בטחול (~ 25%) ולכן הטיהור תהיה יעילה יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך השעיה תא בודד של בלוטות לימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מפשעתי, בבית השחי, זרוע, צוואר רחם וימפה mesenteric צמתים 23 מעכברים מהונדסים OTII ולהעביר לתוך צלחת פלסטיק עם 10 מיליליטר של 10% בינוניים FBS RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטות לימפה לטחון מתחת למכסת מנוע סטרילי באמצעות שתי שקופיות מיקרוסקופ חלבית. הנח בלוטות לימפה בצד חלבית של שקופית מיקרוסקופ אחד, ולשפשף עם צד חלבית של השקופית השנייה ועד איברים היו קרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף השעיה תא בודדת במאגר PBS / BSA / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את התאים למרות מסננת תא (70 מיקרומטר) כדי להסיר רקמות חיבור ולשטוף עם PBS / BSA / חיץ EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 1 מיליליטר של חיץ תמוגה ACK דגירה דקות 1 ב RT כדי לחסל תאי דם אדומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאי CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שוב כמו בשלב 2.1.3 וספירהתאי resuspend אותם ב 100 x 10 6 תאים / מיליליטר PBS / BSA / חיץ EDTA. להוסיף נוגדני biotinylated נגד CD8, IgM, B220, CD19, MHC class II (I-Ab), CD11b, CD11c וDX5 ב 1: 250 במשך 30 דקות על קרח לבחירה מאוחר יותר שלילית של תאי CD4 + T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בPBS / BSA / חיץ EDTA דגירה התאים (100 x 10 6 תאים / מיליליטר) עם microbeads streptavidin בריכוז מומלץ בפרוטוקול של היצרן במשך 15 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בPBS / BSA / חיץ EDTA ולסנן אותם למרות שמסננת תא (30 מיקרומטר) לפני הבידוד של תאי CD4 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי CD4 + T על ידי סלקציה שלילית באמצעות מכונה הפרדת תא מגנטית על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ולהתאים עד 4 x 10 6 תאים / מיליליטר עם 10% בינוניים RPMI FBS (ללא אנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן ולשמור על תאי קרח מבודד CD4 + T (3 x 10 5 תאים) כדי לבדוק את טוהר על ידי זרימהcytometer כמתואר 24. דוגמא לטיהור תאי CD4 + T מוצגת באיור 3 ג. </li></ol></li></ol> 3. תא T Transinfection מדידה על ידי assay הגנת גנטמיצין הערה: איור 2 מסכם שלב שלישי זה של הפרוטוקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transinfection תא T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי CD4 + T מבודדים עם תאים נגועים DC (1: 1) (חיידקים חופשיים DCs נדבקו לשעת 1 ורחץ לחסל) למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות הסינפסה חיסונית בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של תאים מבודדים CD4 + T (2 x 10 6 תאים) ושל 0.1 מיליליטר של DCs הנגוע (2 x 10 6 תאים) על צלחת תרבות 24 גם. כביקורת שלילית, להדביק ישירות 0.5 מיליליטר של תאי CD4 + T במשרד פנים של 10 חיידקים למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל בקרות נוספות הפרדת DCs נגוע מתאי T באמצעותמחסום transwell פוליקרבונט (עם 3 מיקרומטר של גודל נקבובית), מונע מגע פיזי DC-T. להוסיף 0.1 מיליליטר של DCs בתוך transwell ו 0.5 מיליליטר של תאי CD4 + T לתא התחתון של הקידוח (24 גם צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להשלים עם מדיום RMPI עד שיש 0.6 מיליליטר בכל טוב לעשות כמויות שווה בכל הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות של היווצרות הסינפסה חיסונית, להוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר של גנטמיצין ודגירה עבור שעה 1 לפני איסוף תאים בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-הבידוד של תאי CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים שאינם חסיד וresuspend אותם במאגר PBS / BSA / EDTA. רוב DCs נשאר צמוד לצלחת תרבות הפלסטיק. צינורות מערבולת בעדינות כדי להבטיח disaggregation תא. שמור 500 μl של supernatant תא בקרה כדי להראות שגנטמיצין עבד היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד-מחדש תאי CD4 + T מדגימות המכילות DCs ותאי T יחד כמו בשלב 2.2, אם כי רוב DCs צריך מצורף על הצלחת. שמור את דגימות שליטה על קרח. קח בחשבון רק ניסויים עם זיהום פחות מ -2%. דוגמא לסוג CD4 + T טיהור תאים לאחר transinfection מוצגת באיור 3D. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי T Lyse וזרעם על חיידקים צלחות בינוניים-אגר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי CD4 + T פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי resuspend אותם ב 2 x 10 6 תאים / מיליליטר ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 0.1% Triton X-100 ב -500 μl של תאי T לlyse ב1 x 10 6 תאים / מיליליטר, משחרר את החיידקים מחוץ לתאי T תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 3 דילולים עשרוניים סידוריים של תאי lysed וזרע 50 μl של כל דילול על צלחות אגר בינוניות חיידקים. לחלק צלחות ל -4 חלקים וזרע דילולים השונים של תאי lysed בכל חלק. תוצאות נציגים מוצגות באיור 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת, גם צלחתsupernatant מאוחסן תא של conjugates על אגר, כדי להבטיח גנטמיצין שעבד היטב. גם צלחת DCs הנגוע כבקרה נוספת. במקרה זיהום DCs נמוך מתרחש (&lt;2%), להפחית את יחידות המושבה להרכיב (CFUs) המתאימות לזיהום DC נמוך. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. כימות Transinfection תא T על ידי cytometry הזרימה הערה: איור 2 מסכם את הצעד הזה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transinfection תא T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק BMDCs כמו בשלב 1.3, אבל להשתמש בחיידקי GFP להביע במקרה זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי CD4 + T הכתם (מבודדים מבלוטות לימפה בשלב 2.2) עם aminocoumarin chloromethyl גשש תא (CMAC) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי CD4 + T שכותרתו פעמיים עם FBS RMPI 10% (ללא אנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה DCs הנגוע (לאחר דגירה 1 שעות עם חיידקים) עם CD4 + כותרתתאי T למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות הסינפסה חיסונית על 37 מעלות צלזיוס כולל את כל הבקרות והסבירו בשלב 3.1.1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת תאי CD4 + T נגועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות של היווצרות הסינפסה חיסונית DC-T, לאסוף תאים ולשטוף אותם בPBS / BSA / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שתי שטיפות עם PBS חיץ / BSA / EDTA, תאים מצטברים נפרדים בעדינות על ידי vortexing הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הדגימות ב0.2 מיליליטר / שפופרת של PBS המכיל 3% PFA במשך 15 דקות ב RT. לאחר מכן לשטוף אותם בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן אנטי עכבר CD16 / CD32 חד שבטי (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ב -50 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 15 דקות על קרח כדי לחסום קולטני Fc של תאים דנדריטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ארנב נגד חיידקי נוגדן (10 מיקרוגרם / מיליליטר כריכוז סופי) ב -50 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 30 דקות על קרח להכתים חיידקים תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS / BSA / EDTA ודגירה עם נוגדן נגד CD11c עכבר מצומדות עם Phycoerythrin (PE) וseנוגדן condary נגד ארנב מצומדות עם fluorochrome אחר כמו Alexa-פלואוריד 647 ב 1: 200 ב100 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 30 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים ולנתח דגימות על ידי cytometry זרימה. אל תשכח לכלול מדגם של תאי T transinfected באמצעות חיידקים הלא ניאון שליטה שלילית וכדגימות שכותרתו עם רק אחד מכל fluorochrome השתמש בניסוי כדי לפצות את הדגימות ולהתאים את הזרימה cytometry הגדרות 25. ניתוח נציג מוצג באיור 5. הערה: אם חיידקים אינם מבטאים GFP, להבחין תאית וחיידקים תאיים, חיידקים תאיים תווית, לתקן, וpermeabilize דגימות עם טריטון X-100 ברמה של 0.5% ב- PBS במשך 5 דקות. לאחר מכן כתם חיידקים כולל (תאית + תאי) עם fluorochrome שונה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response.">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).</li><li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (1989).</li><li>Pancer, Z., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+adaptive+immunity.">The evolution of adaptive immunity.</a> Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).</li><li>Rhoades, R. A., Bell, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Medical Phisiology. , (2012).</li><li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Invasion:+The+Paradigms+of+Enteroinvasive+Pathogens.">Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens.</a> Science. 304 (5668), 242-248 (2004).</li><li>Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+and+recognition+in+bacterial+infections.">Antigen presentation and recognition in bacterial infections.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Adhesion+and+Entry+into+Host+Cells.">Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells.</a> Cell. 124 (4), 715-727 (2006).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).</li><li>Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+clathrin+drives+actin+accumulation+at+the+immunological+synapse.">Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse.</a> Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).</li><li>Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+bone+marrow-derived+dendritic+cells+and+macrophages+to+productive+infection+with+Listeria+monocytogenes.">Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes.</a> Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).</li><li>Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC-SIGN,+a+dendritic+cell-specific+HIV-1-binding+protein+that+enhances+trans-infection+of+T+cells.">DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells.</a> Cell. 100 (5), 587-597 (2000).</li><li>Izquierdo-Useros, N., Naranjo-G&#242;mez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+mature+dendritic+cells:+Trojan+exosomes+riding+the+Trojan+horse.">HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse.</a> PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).</li><li>Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+communication:+diverse+structures+for+exchange+of+genetic+information.">Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information.</a> Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).</li><li>McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+serve+as+a+reservoir+for+Listeria+monocytogenes+growth+during+infection+of+mice.">Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice.</a> Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).</li><li>Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+impairs+T+lymphocyte+dynamics+in+vivo.">Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).</li><li>Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+kill+bacteria+captured+by+transinfection+from+dendritic+cells+and+confer+protection+in+mice.">T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice.</a> Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).</li><li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements.">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).</li><li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging.">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).</li><li>Inaba, K., Inaba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Th&#246;ne, F., Schwanh&#228;usser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-isolation+of+Salmonella-infected+cells+with+defined+bacterial+load+from+mouse+spleen.">FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).</li><li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes.">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current protocols in immunology. , Unit 14.1 (2008).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+na&#239;ve+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of na&#239;ve CD4 T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li><li>Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+operation+of+a+flow+cytometric+immunophenotyping+laboratory.">Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory.</a> Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).</li><li>Itano, A. A., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+to+naive+CD4+T+cells+in+the+lymph+node.">Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node.</a> Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

תאי T או התאים T הם סוג של כדוריות דם לבנות שתפקיד מרכזי בחסינות תא בתיווך ושייך לתגובה החיסונית אדפטיבית 26. תאי T הם עקשן ללהידבק במבחנה אבל כמה דיווחים מצביעים על כך שהם יכולים להיות נגועים בvivo 14,15. הקשר האינטימי של תאי APC ו- T בסינפסה החיסונית לשמש...

כאשר הפתוגן מדביק המארח שלה, בדרך כלל יש הפעלה של המערכת החיסונית המולדת ובעלי כושר הסתגלות, הכרחי לקבלת אישור בקטריאלי. חסינות מולדת היא קו הגנה הראשון המונע הזיהומים ביותר. חסינות מולדת להבחין באלמנטים מדויקים דרך שהשתמרו בקרב קבוצות רחבות של מיקרואורגניזמים (הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, PAMPS) 1. המנגנונים של מערכת חיסון מולדת כוללים מחסומים פיזיים כגון עור, מחסומי כימיקלים (פפטידים מיקרוביאלית, יזוזים) וכדוריות דם לבנות המולדים, הכוללים את phagocytes (מקרופאגים, נויטרופילים, ותאים דנדריטים), תאי פיטום, אאוזינופילים, בזופילים, ותאי הרג טבעיים 2. תאים אלה לזהות ולחסל פתוגנים, בין אם על ידי תוקף אותם באמצעות מגע או באמצעות phagocytosis, הכולל מחולל האופפת והרג. מערכת זו אינה מאפשרת הגנה לכל החיים, בניגוד לחסינות אדפטיבית, המעניק זיכרון חיסוני כנגד עמ &#39;athogens. המערכת החיסונית אדפטיבית היא קו הגנה השני, והוא מסוגל לזהות ולהגיב לאנטיגנים ספציפיים של חיידקים מרובים וחומרים שאינם חיידקים 3. המרכיבים העיקריים של המערכת החיסונית אדפטיבית הם לימפוציטים, הכוללים תאי B ו- T. תאי B מעורבים בתגובת הלחות, מפריש נוגדנים נגד פתוגנים או חלבונים אקסוגניים. עם זאת, תאי T מייצגים את חסינות התא בתיווך, ויסות התגובה החיסונית עם הפרשת ציטוקינים או תאים נגועים בפתוגן הרג 4. תאי הצגת אנטיגן (נגמ&quot;שים) כוללים תאים דנדריטים או מקרופאגים, מרכיבים של מערכת החיסון המולדת, יכול לזהות פתוגנים phagocytose ורכיבי חיידקי תהליך לאנטיגנים, המוצגים על פני התא על ידי histocompatibility סרן מורכב (MHC) 5-7. לאחר נגמ&quot;שים שphagocytized פתוגנים, הם בדרך כלל להעביר לבלוטות הלימפה ניקוז, שבו הם מתקשרים עם Tתאים. לימפוציטים מסוג T יכול לזהות מתחמי פפטיד-MHC ספציפיים על ידי קולטני תאי T שלהם. סינפסה החיסונית (IS) מתרחשת בממשק שבין APC-עמוס אנטיגן והלימפוציטים במהלך מצגת אנטיגן 8,9. חיידקים מסוימים יכולים לשרוד phagocytosis ולהפיץ באופן שיטתי בתוך נגמ&quot;שים. בתצוגה זו, נגמ&quot;שים נגועים לשמש כמאגרי חיידקים או &quot;סוסים טרויאניים&quot; המאפשרים התפשטות חיידקי 10. קשר האינטימי בין נגמ&quot;שים וימפוציטים שיתקיימו במהלך ההיווצרות גם לתפקד כפלטפורמה להחלפה של חלק מקרומים, חומר גנטי וexosomes ויכול להיות שנחטף לכמה וירוסים להדביק תאי T; תהליך זה נקרא transinfection 11-13. כמה חיידקים פתוגניים (חיידקי ליסטריה, סלמונלה enterica וflexneri Shigella) יכולים לפלוש לימפוציטים מסוג T in vivo ולשנות את ההתנהגות שלהם 14-16. יש לנותאר לאחרונה כי לימפוציטים מסוג T הוא גם מסוגל לתפוס חיידקים על ידי transinfection מהתאים דנדריטים נגועים בעבר (DCS) במהלך הצגת אנטיגן 16. תא T ללכוד חיידקים על ידי transinfection מאוד יעיל יותר (1,000-4,000x) מאשר זיהומים ישירים. הפתוגן T ללכוד תאים וחיידקים שאינם פתוגן המציין מ transinfection הוא תהליך מונע על ידי תאי T. באופן מפתיע, transinfected T (ציצי) תאים נהרגו במהירות את החיידקים שנתפסו ועשו זאת בצורה יעילה יותר מאשר phagocytes המקצועי 16. תוצאות אלו, שתשבורנה דוגמה לאימונולוגיה, מראות כי התאים של חסינות אדפטיבית יכולים לבצע פעולות שהיו כביכול בלעדיים של החסינות המולדת. בנוסף, הראינו כי תאי ציצי מפרישים כמויות גדולות של ציטוקינים פרו-דלקתיים ולהגן מפני זיהומים חיידקיים בvivo. כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים השונים המשמשים ללימוד תהליך transinfection חיידקים במודל עכבר. מודל זה מבוסס על השימוש בתאים מסוג CD4 + T מעכברים מהונדסים OTII, אשר נושאים ספציפי TCR לפפטיד 323-339 של OVA (OVAp) בהקשר של I-17 Ab כי אינטראקציה ספציפית עם עצם חיידקים נגוע מארו DCs נגזר (BMDCs) 18,19 עמוס OVAp, יוצר סינפסות חיסוני יציבה. transinfection תא T ניתן דמיין ומעקב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בנוסף, cytometry הזרימה יכול לשמש לזיהוי תאים נגועים על ידי ניצול של הקרינה הנפלטת ידי חיידקים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 16,20. יתר על כן, transinfection תא T ניתן לכמת על ידי גישה רגישה יותר, assay הישרדות גנטמיצין המאפשר מדידה של מספר גדול של אירועים. גנטמיצין הוא אנטיביוטיקה שלא יכול לחדור תאים האיקריוטים. לכן, שימוש באנטיביוטיקה זו מאפשרת בידול של חיידקים תאיים ששרד את fr בנוסף לאנטיביוטיקהאלה תאיים אום שנהרגו 21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RPMI</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">SH3025501</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">r-GMCSF</td>
			<td style="width:131px;">Peprotech</td>
			<td style="width:104px;">315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">LPS</td>
			<td style="width:131px;">SIGMA</td>
			<td style="width:104px;">L2630-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Na Pyruvate</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">SH3023901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">2-ME</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">OVAp OTII (323&#8211;339)</td>
			<td style="width:131px;">GenScript</td>
			<td style="width:104px;">---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Cell Strainer 70uM</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;30uM Syringe Filcons Sterile</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">340598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">AutoMacs Classic</td>
			<td style="width:131px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-088-887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:131px;">Normon</td>
			<td style="width:104px;">624601.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Transwell</td>
			<td style="width:131px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">LB</td>
			<td style="width:131px;">Pronadisa</td>
			<td align="right">1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:131px;">Pronadisa</td>
			<td align="right">1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:341px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:131px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD8 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">IgM Biot</td>
			<td style="width:131px;">ImmunoStep</td>
			<td style="width:104px;">Clone RMM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">B220 Biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD19 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">MHC-II Biot (I-A/I-E)</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11b biot</td>
			<td style="width:131px;">Immunostep</td>
			<td style="width:104px;">11BB-01mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11c biot</td>
			<td style="width:131px;">Immunostep</td>
			<td>11CB3-01mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DX5 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Gr-1 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD16/CD32</td>
			<td style="width:131px;">ImmunoStep</td>
			<td>M16PU-05MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">anti Salmonella</td>
			<td style="width:131px;">ABD Serotec</td>
			<td style="width:104px;">8209-4006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11cPE</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD4-APC</td>
			<td style="width:131px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">20-0041-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gr-1 APC</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MHC-II (I-A/I-E) FITC</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin)</td>
			<td style="width:131px;">Life technologies</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">BSA</td>
			<td style="width:131px;">SIGMA</td>
			<td style="width:104px;">A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Streptavidin MicroBeads</td>
			<td style="width:131px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">---</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t cells capture bacteria by transinfection from dendritic cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

במסמך שתארנו כיצד לבצע transinfection חיידקי תא T עכברי ממח עצם נגוע נגזר DCs ואיך למדוד transinfection חיידקים באמצעות שתי גישות שונות: cytometry הזרימה וגנטמיצין הישרדות assay איור 1 מסכם את ההליך כדי לקבל את התאים.. DCs מופקים על ידי דגירה של תאי מח עצם עם GM-CSF ל9 י?...

Watch this Scientific Journal Video about T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells at JoVE.com

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

הנה פרוטוקול מוצג למדוד לכידת חיידקים על ידי תאי CD4 + T אשר מתרחש במהלך מצגת אנטיגן באמצעות transinfection מהתאים נגועים מראש דנדריטים (DC). אנו מראים כיצד לבצע את הצעדים הדרושים: בידוד של תאים ראשוניים, של היווצרות זיהום המצומד תא DC, DC / T, ומדידה של transfection תא T חיידקים.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

t-cells-capture-bacteria-by-transinfection-from-dendritic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.7K Views.  Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC).  הנה פרוטוקול מוצג למדוד לכידת חיידקים על ידי תאי CD4 + T אשר מתרחש במהלך מצגת אנטיגן באמצעות transinfection מהתאים נגועים מראש דנדריטים (DC). אנו מראים כיצד לבצע את הצעדים הדרושים: בידוד של תאים ראשוניים, של היווצרות זיהום המצומד תא DC, DC / T, ומדידה...

Video: T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

גזירה של תאי T<em&gt; במבחנה</em&gt; מתאי עכבר גזע העובריים

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...