נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות המענק R01EY018144.

1. ייצור, מקפלים, וטיהור HPLC של הולו-RBP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את BL-21cells עם וקטור pET3a מחסה cDNA לRBP האנושי עם 6x התג שלו על N-הסופי. לגדל את BL-21 התאים הפכו בייקר על 37 מעלות צלזיוס בתקשורת 40 מ&quot;ל LB עם carbenicillin עד OD ב 600 ננומטר מגיע 0.5. לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת RBP IPTG ל1mm. לגדל את החיידקים על 37 מעלות צלזיוס עוד 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RBP מיוצר בE.coli הוא בעיקר נוכח בגופי הכללה מסיסות. כדי להעשיר את גופי הכללה, תאי גלולה ב -10,000 XG במשך 20 דקות. אז sonicate את התאים על קרח ב5 המ&quot;ל PBS עם מעכבי פרוטאז, ואחרי 2 מחזורים של הקפאה והפשרה. גלולים במורד גופי ההכללה ב20000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. הסרת supernatant ולשמור על הקמצוץ על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize הכללת גוף הגלולה ידי sonication ב10 הידרוכלוריד מ&quot;ל 7.5 M guanidine. הוסף נפח 1/2 (5 מ&quot;ל) של 25 מ&quot;מ טריס חיץ, pH 9.0 וDTT לג סופיoncentration של 10 מ&quot;מ. מערבב נמרצות פתרון במיקסר מערבולת לילה בטמפרטורת חדר כדי להפחית באופן מלא ולפגל חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חלבון הפתרון להסיר חומר מסיס ב18000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. אחרי הספין, להעביר את supernatant לצינור חדש ולמקם את הצינור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ארבעה כרכים (60 מ&quot;ל) של חיץ refolding (25 mM טריס, pH 9.0, 0.3 mM ציסטין, ציסטאין mM 3.0, 1 mM EDTA). דגת חיץ refolding. גם להכין רטינול mM 600 μl 10 באתנול באור אדום עמום. שמור את זה בחושך על קרח. שניהם חיץ refolding ופתרון רטינול צריכים להיות טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרר גם פתרון החלבון וחיץ refolding על קרח במשך לפחות 30 דקות. טמפרטורה גבוהה יותר סבירה מפחיתה את האיכות קפלה מחדש RBP. הוסף פתרון 10 μl רטינול בתורו תוך פתרון חלבון מעורב נמרץ בכוס בקרח dropwise 1 מיליליטר חיץ וקפל שוב. חזור על פעולה זו עד שכל חיץ refolding ורטינולהם הוסיפו. ממשיך לערבב תגובה על קרח בחושך במשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תגובת refolding ב24000 XG למשך 30 דקות ב 4 ° C. זה חיוני כדי להסיר אגרגטים מייד אחרי תגובת refolding. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז פתרון supernatant באמצעות 15 concentrator Ultra Amicon (MWCO 10 יא) לכ 10 מ&quot;ל. אל תתרכז פתרון קפל מחדש יותר מרמה זו. להתרכז יותר מדי יביא לצבירת חלבון ומוריד את התפוקה ואיכות הסופית של RBP המקופל בצורה נכונה. לדלל את הדגימה המרוכזת עם הקור PBS עד 100 מ&quot;ל. מטרת שלב זה היא כדי להסיר את הרכיבים בתגובת refolding שמפריע לטיהור ניקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הפתרון עוד פעם אחת ב24000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. חשוב להסיר כל משקע. העברת supernatant לשני צינורות 50 מ&quot;ל, כל 1 מ&quot;ל מכיל slurry Ni-נ.ת. ע שנשטף עם PBS. סובב את הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. דוגרי f תמיסה המדוללתאו 1 שעה יכולה לגרום למשקעים של חלבוני misfolded שצריך להסירו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה את הצינורות ב 500 XG ל3 דקות. הסרת supernatant בזהירות. צף דבר יש להסיר. הוסף הקר PBS עד 30 מ&quot;ל לכל צינור. ספין שוב להסיר את supernatant. חזור על תהליך זה עד שאתה לא רואה שום דבר, אלא חרוזים בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שרף Ni-נ.ת. ע לעמודה ריקה. שטוף את השרף עם 20 כרכי עמודה של 10 מ&quot;מימ imidazole, 500 המ&quot;מ NaCl ב PBS. Elute-RBP ב 5 כרכי טור של 100 המ&quot;מימ imidazole ב PBS. אל תאחסנו את הפתרון הזה לתקופה ממושכת של זמן, והקפאה מפחיתה את התפוקה ואיכות הסופית. לתוצאה הטובה ביותר, לטהר RBP על ידי HPLC באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיאליזה-RBP מטוהר משרף Ni-נ.ת. ע נגד 25 המ&quot;מ טריס, 8.4 pH, וmM NaCl 120. Concentrator יכול לשמש גם להחלפת בולם. דוגמאות ברורות לHPLC ידי צנטריפוגה XG ב 16000 עבור 10 דקות ב 4 ° C ממש לפני כל ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר הולוגרמות RBP על HPLC באמצעות יוניםחילופי העמודה AX-300 על ידי שיפוע צעד NaCl (220 מ&quot;מ 12 דקות, 15 דקות 360 מ&quot;מ, ו1000 mM 15 דקות) באמצעות 25 מ&quot;מ טריס, pH 8.4 כשלב נייד ב1 מ&quot;ל / דקה. ככל שעולה בריכוז NaCl, הולוגרמות-RBP הוא שוחרר תוך apo-RBP וmisfolded RBP להישאר מחויב לעמודה (איור 1). אם refolding RBP לא נעשה בצורה אופטימלית, misfolded RBP (למשל misfolded RBP-אני באיור 1) יכול לשלוט כל ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזר המקופל כראוי הולוגרמות RBP מהשברים בשיא 360 המ&quot;מ NaCl. זהירות לפקח על פרופיל elution של שלב בצורה נכונה וmisfolded-RBP. ב1000 mM NaCl, רובו misfolded-RBP יש לשחררו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברים המכילים הולוגרמות RBP הם נקווים, מרוכזים, ודיאליזה נגד PBS הלילה ב 4 ° C. בדקו את התשואה סופית ואיכות (330 nm/280 ננומטר) על ידי ספקטרופוטומטר. מוצר מקופל בצורה נכונה צריך להיות יחס של 330 ננומטר nm/280 מעט גבוה יותר מאשר 1 (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לproducדואר apo-RBP, מוסיף נפח שווה של heptane למטוהרי הולוגרמות RBP ומערבב בעדינות על ידי החלפה בין הלילה ב 4 ° C. צנטריפוגה ב16,000 גרמו עבור 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את השלב המימי התחתון בזהירות לצינור חדש (הימנעות המשקע בממשק). חזור על התהליך שלוש פעמים בדגירת 3 שעות לכל אחד. בדקו קליטה בספקטרופוטומטר Nanodrop לוודא שיא ננומטר 330 ירד לרמת הרקע. </li></ol> 2. ניטור בזמן אמת של STRA6-קטליזאטור רטינול השחרור וטוען רטינול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום Microfluor-2 לוח שחור 96-היטב (Thermo Scientific) עם 200 μl של החוסם קזאין (פירס) לילה ב 4 ° C כדי למנוע הידבקות ספציפית של הולוגרמות RBP לפלסטיק. החוסם קזאין נותן אפקט החסימה הטובה ביותר של כל פתרוני החסימה שבדקנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרומים טריים מתאים לבטא STRA6 או תאי בקרה נשטפים באמצעות PBS ועברו המילטון מזרק (Gastight # 1710) 6 פעמים כדי לייצר השעיה אחידה בPBS. אנחנו בדרך כלל להשתמש בקרומים הנגזרים מ1 / 100 עד 1/20 מתאים שגודלו בצלחת 100 מ&quot;מ לתגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות המצופות של צלחת Microfluor-2 פעם עם 200 μl של PBS. לקרר את הצלחת על קרח לפני תוספת של השעית קרום (50 μl לטוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניטור בזמן אמת של רטינול פלואורסצנטי נמדד באמצעות אופטיקה קרינה של POLARstar האומגה (BMG Labtech) עם 320ex מסנן העירור ופליטת מסנן 460-10. התכנית מוגדרת למצב קריאת Endpoint. מצב פלייט יכול גם לשמש למדידת זמן כמובן אם את מרווחי הזמן לא מגוונים. אות מכל נקודת זמן היא הממוצע של 10 מדידות (מיצוע מסלולית בקוטר של 2 מ&quot;מ) והרווח מוגדר ב1800. הצלחת מתערערת ל10 שניות ב 500 סל&quot;ד באמצעות טלטול כפול הקפה לפני כל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את assay השחרור רטינול, הבארות לקרוא פעם אחת באמצעות נקודתי קצה קריאה מ &#39;שיר הלל לפני הולוגרמות RBP (בדרך כלל ריכוז 1 מיקרומטר סופי) הוא הוסיף ב0 דקות. ברגע שהולוגרמות RBP הוא הוסיף, התגובה מנוטרת באופן רציף בכל 5-10 דקות ל1-3 שעות. כדי להפעיל את בדיקת העמסת רטינול, רטינול כל טרנס (בדרך כלל 1 מיקרומטר ריכוז סופי) הוא הוסיף לבארות תחת אור אדום עמום. הצלחת היא לקרוא פעם אחת לפני apo-RBP מתווספת ב0 דקות. ברגע שapo-RBP הוא הוסיף, התגובה מנוטרת באופן רציף בכל 5-10 דקות ל1-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל המדידות נעשו, להוריד את הנתונים הגולמיים (לדוגמה שמוצגת באיור 2) מתוכנת ניתוח נתוני האומגה (BMG Labtech) ל-Microsoft Excel לניתוח נתונים. כל נקודת זמן יוצרת קובץ המכיל את הקריאה של כל תנאי הניסוי. לדוגמה, אם יש 20 נקודות זמן, לאחד 20 קבצים לתוך קובץ אחד Excel לצורך ניתוח נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניתוח נתונים, את אותות קרינה לפני התוספת של רטינול או הולוגרמות RBP ב0 דקות נחשבים אותות רקעד נוכה מאותות הקרינה הסופיים בכל נקודתי הזמן. למרות אותות הרקע נמוך בהשוואה לרטינול פלואורסצנטי בולוגרמות RBP, החסרת הרקע מבטל את ההשפעה הספציפית של פיזור אור על ידי הקרומים ומאפשר להתמקד בפלואורסצנטי רטינול של הולוגרמות RBP או רטינול הוסיף ב0 דקות. </li></ol> 3. ניטור בזמן אמת של תעבורת STRA6-קטליזאטור של רטינול מהולו-RBP לCRBP- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטינול-EGFP היא העברה חדשה פלואורסצנטי תהודה (סריג) זוג שלא מכבר הוקמה 41. תחבורת STRA6-קטליזאטור רטינול מהולוגרמות RBP לEGFP-CRBP-מנוטר בזמן אמת על ידי מדידת רטינול-EGFP סריג. חלבון היתוך EGFP-CRBP-עם 6XHis תג (EGFP-CRBP-I) מיוצר בתאי יונקים ומטוהר על שרף Ni-נ.ת. ע לפני הניסוי. EGFP-CRBP-אני יכול להיות מאוחסן בPBS עם מעכבי פרוטאז, לתקופה קצרה של זמן ב 4 ° C. לחלופין חלבון היתוכיs קפואה ב-80 מעלות צלזיוס בaliquots הקטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני התגובות, להכין Microfluor-2 צלחת וקרומים כמתוארים לעיל חסומה. לשטוף את הבארות המצופות של צלחת Microfluor-2 פעם עם 200 PBS μl לפני תוספת של השעית קרום (50 μl לטוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן האמת רטינול-EGFP סריג נמדד באמצעות POLARstar אומגה עם העירור 320ex הסינון ומסנני הפליטה ו460-10 510-10 באמצעות אופטיקה קרינת פליטה דו הקרב בו זמנית. התכנית מוגדרת למצב קריאת Endpoint. מצב פלייט יכול גם לשמש למדידת זמן כמובן אם את מרווחי הזמן לא מגוונים. אות מכל נקודת זמן היא הממוצע של 10 מדידות (מיצוע מסלולית בקוטר של 2 מ&quot;מ) והרווח מוגדר ב1800 לכל ערוץ. הצלחת מתערערת ל10 שניות ב 500 סל&quot;ד באמצעות טלטול כפול הקפה לפני כל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את התגובות, EGFP-CRBP-I (בדרך כלל ריכוז 1 מיקרומטר סופי) הוא הוסיף לבארות. הצלחת היא לקרוא עלce שימוש במצב קריאת Endpoint לפני הולוגרמות RBP מתווסף ב0 דקות. ברגע שהולוגרמות RBP הוא הוסיף, התגובה מנוטרת באופן רציף על ידי מדידה כל 5-10 דקות לשעות 1-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל המדידות נעשו, להוריד את הנתונים הגולמיים (דוגמה מוצגת באיור 3) מתוכנת ניתוח נתוני האומגה ל-Microsoft Excel לניתוח נתונים כמתוארים לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטינול-EGFP סריג מחושב על ידי השינוי הדינמי בשיעור של פסגות פליטת acceptor / תורם 47. המשוואה 41 לחישוב יחס זה היא [(510 לא -510 ב) / (460 לא -460 ב)], שבו 510 לא, 510 ב, 460 לא, ו460 ב מייצגים פליטה ב510 ננומטר לאחר תחילת התגובה ( t = נקודת זמן), ב510 ננומטר לפני רטינול או הולוגרמות RBP מתווסף (ב = רקע), ב460 ננומטר לאחר תחילת התגובה (= נקודת הזמן t), וב460 ננומטר לפני רטינול או הולוגרמות RBP נוסף (= רקע ב), בהתאמה. </li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו חולקים כאן פרוטוקול ייצור RBP אופטימלי בגלל תהליכי ייצור וטיהור RBP הם קריטיים ליצירת RBP מקופל בצורה נכונה. בהתחשב באפשרות של מיני RBP misfolded והנוכחות של כמויות זעירות של חלבונים חיידקיים אפילו בHPLC המטוהר חיידקים מיוצרים RBP, כדאי להשתמש RBP יליד מסרום כדי לאשר מסקנה הקשו...

ויטמין A היא מולקולה אורגנית שהיא חיוני להישרדות אנושית ותפקוד התקין של כמעט כל איברי האדם. ויטמין נגזר (רטינואידים) להשתתף באירועים ביוכימיים וסלולריים מגוונים כולל את החישה של אור ל1,2 חזון והרגולציה של ביטוי גנים ותרגום חלבונים במהלך התפתחות עוברית וברקמות בוגרות 3-6. למרות רטינול יש את היכולת לפזר מערכתי, האבולוציה באה עם חלבון פלזמת רטינול מחייב, חלבון נישא ספציפי לויטמין תחבורה בדם כדי להשיג יעילות וסגולית גבוהה ולהימנע מרעילויות קשורות דיפוזיה 7-10 אקראית. קולטן זיקה גבוהה שנקשר לRBP ולוקח ויטמין היה שיערות ב1970 11-13. למרות ראיות שהצטברו בשלושה עשורים על קיומו של הקולטן RBP 14-31, השערת הקולט נדונה במשך שנים רבות בשל existencדואר של הגדרה לא נכונה של הולוגרמות RBP. ההגדרה הנכונה של הולוגרמות RBP היא שזה מורכב 01:01 זיקה הגבוהה בין רטינול וRBP. שאיבה חוזרת של הולוגרמות RBP ידי ממס אורגני היא הכרחית כדי לייצר apo-RBP. הגדרה זו משמשת כמעט על ידי כל המעבדות הלומדות RBP 7,9,32-35 או קולט RBP 14-31,36-42. ההגדרה לא הנכונה של הולוגרמות RBP ששמשה להפריך את קיומו של הקולטן RBP היא התערובת החריפה של רטינול החופשי עם apo-RBP. מאז הפונקציה של הקולטן RBP בויטמין ספיגה מהולוגרמות RBP היא לשחרר רטינול מהולוגרמות RBP, קולט RBP היה לשחק שום תפקיד בספיגת רטינול אם רטינול הוא חופשי להתחיל עם (כפי שהוצע על ידי ההגדרה הנכונה של הולו RBP-). זיהוי האחרון של הקולטן RBP כחלבון תחום multitransmembrane נקרא STRA636 ותפקודו בספיגת הוויטמין מהולוגרמות RBP 36-43 חזקה טוען נגד ההשערה כי RBP לאצריך קולט לספק ניתוחים מדוקדקים ויטמין A. נמצאו כי STRA6 יש 9 תחומים הטרנסממברני עם N-הסופי ממוקמים extracellularly וC-Terminus ממוקמים intracellularly 40. ממוקם בין הטרנסממברני 6 ו 7 הוא תחום מחייב חיוני RBP 39. STRA6 מצמיד הן LRAT וCRBP-אני בויטמין ספיגה מהולוגרמות RBP, אך גם לא LRAT CRBP-אני דרוש לחלוטין לSTRA6 פעילות מוגברת 41. היכולת של STRA6 לזרז שחרור רטינול מהולוגרמות RBP היא המפתח לויטמינה פעילות ספיגה 41. על ידי הסתמכות על STRA6 לשחרר רטינול, ויטמין מסירה בRBP יכול להסיע ויטמין למקד את התאים ברקמות פריפריה עם סגוליות גבוהות ויעילות. החשיבות הקריטית של הגדרת הולוגרמות RBP והכנה מודגמת לא רק הדיון ההסטורי על קיומו של הקולטן RBP, אלא גם על ידי שלושה עיתונים האחרונים הבוסס על הולוגרמות RBP אונטערשייד הגדרותשונה שמפה מהגדרה המקורית ונכונה 44-46. העיתון הראשון השתמש בהגדרת הולוגרמות RBP ששמשה לפסול את קיומו של הקולטן RBP ללמוד RBP קולט 44. את המסמכים השניים ושלישיים באו עם הגדרה שלישית של הולוגרמות RBP שעשתה את זה אפילו פחות סביר לרטינול להיחקר כדי ליצור מורכבות נכונות עם RBP 45,46. מחקרים אלה הוכנו על ידי ערבוב 3 H-retinol/RBP הולוגרמות RBP (אפילו לא apo-RBP) עם 3 H-רטינול. מאז assay זה לא היה לי 3 H-retinol/RBP נוצר ולא להסיר המוגזם חופשי 3 H-רטינול 45,46, זה לא assay לספיגת H-3 מ 3 H-retinol/RBP רטינול, אבל הוא חופשי 3 assay דיפוזיה H-רטינול. זה כבר הראה בעבר כי STRA6 לא לשפר את ספיגת הסלולר של רטינול בחינם על ידי LRAT 38 או CRBP-41. כמעט כל רטינול חייב RBP בדם ואין להבחין freהדואר רטינול. פונקציה עיקרית של הקולטן RBP היא לזרז שחרור רטינול מהולוגרמות RBP במהלך ספיגת רטינול מהולוגרמות RBP 41. אם רטינול הוא שוחרר באופן מלאכותי, או בצורה החופשית להתחיל עם 45,46, קולט RBP אין צורך. התוצאות השונות באופן דרמטי המתקבלות מבדיקת דיפוזיה רטינול החופשית בהשוואה למבחנים הבוסס על הוכן כראוי הולוגרמות RBP להמחיש כי הכנה הנכונה של RBP הן קריטיות עבור המבחנים הפונקציונליים שלו. RBP יכול להיות מטוהר מסרום האדם 41, אך ההליך מורכב והתשואה היא נמוכה. גישה חלופית היא לייצר RBP בE. coli. בגלל E. coli אין יכולת כראוי לקפל חלבונים מופרשים יונקים עם יותר מזוג אחד של אג&quot;ח דיסולפיד כמו RBP, זה חיוני כדי לקפל RBP ולטהר את החלבון המקופל בצורה נכונה. חלבוני Misfolded לא מתנהגים בצורה שונה מרק RBP המקופל תוקן במבחנים שונים,אבל גם לגרום להצטברות חלבון במהלך האחסון. מאותה הסיבה, apo-RBP מיוצר רק מהאיכות גבוהה הולוגרמות RBP. אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימלי לייצר RBP איכות גבוהה 100% עמוסים רטינול דרך ביטוי חיידקים, מקפל, וטיהור HPLC. טיהור HPLC מסירה RBP מקופל באופן שגוי, אלא גם זיהום חיידקים משמעותי שיכול לגרום לממצאים חמורים אם RBP משמש במבחני העברת אותות לא רק. גם אנו מתארים שתי טכניקות בזמן אמת ניטור רגישים ללמוד תחבורת רטינול ידי STRA6. שני הטכניקות תלויות בRBP באיכות גבוהה. בשל מגבלות מקום, בטכניקות הקלסיות של ויטמין retinoid מבוסס וHPLC מבוסס רדיואקטיבי A מבחני ספיגה אינן מתוארות כאן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> hydrochloride guanidine </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> ציסטין </td><td> סיגמא </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> ציסטאין </td><td> סיגמא </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> דיג </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> טריס </td><td> דיג </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> רטינול </td><td> סיגמא </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicillin </td><td> דיג </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> דיג </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-נ.ת. ע </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazole </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptane </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> החוסם קזאין </td><td> לנקב </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> 15 concentrator Ultra Amicon (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 צלחת </td><td> דיג </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> המילטון המזרק Gastight # 1710 </td><td> דיג </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

ויטמין A חיונית לראייה וגדילה / התמיינות של כמעט כל איברי האדם. החלבון מחייב רטינול פלזמה (RBP) הוא עקרוני ומוביל ספציפי של ויטמין בדם. כאן אנו מתארים טכניקת אופטימיזציה לייצר ולטהר הולוגרמות RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד את ההובלה של ויטמין על ידי הקולטן גבוהה זיקת RBP STRA6. הטכניקה הראשונה מאפשרת לייצר כמות גדולה באיכות גבוהה הולוגרמות RBP (100% טיעון עם רטינול) לויטמין A מבחני תחבורה. RBP איכות הגבוהה הוא חיוני למבחנים תפקודיים בגלל misfolded RBP משחרר ויטמין זיהום חיידקים בקלות והכנת RBP יכול לגרום לחפצים. טכניקות ניטור בזמן אמת כמו electrophysiology תרמו תרומה מכרעת למחקרים של תחבורת קרום. תחבורת רטינול הקולטן בתיווך RBP לא נתח בזמן אמת עד לאחרונה. הטכניקה השנייה שתוארה כאן היא פליליתניתוח L-עת שחרור STRA6-קטליזאטור רטינול או הטעינה. השיטה השלישית היא ניתוח בזמן אמת של STRA6-קטליזאטור תחבורת רטינול מהולוגרמות RBP לסלולרי רטינול חלבון אני מחייב (CRBP-I). טכניקות אלה מספקות רגישות ורזולוציה גבוהה בחשיפת מנגנון ספיגת הוויטמין של הקולטן RBP.

אנו מציגים כאן תוצאות יציגות לייצור הולוגרמות RBP וטיהור על ידי HPLC (איור 1), ניתוח בזמן האמת של STRA6-קטליזאטור שחרור רטינול מהולוגרמות RBP וטעינת רטינול לapo-RBP (איור 2) והניתוח בזמן אמת של תחבורת STRA6-קטליזאטור רטינול מהולוגרמות RBP לEGFP-CRBP-I (איור 3). ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

כאן אנו מתארים טכניקה אופטימלית לייצור ויטמין איכותי מורכב / RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד ויטמין הובלה בSTRA6, קולט RBP.

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

real-time-analyses-retinol-transport-membrane-receptor-plasma-retinol

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  University of California, Los Angeles. כאן אנו מתארים טכניקה אופטימלית לייצור ויטמין איכותי מורכב / RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד ויטמין הובלה בSTRA6, קולט RBP.

Video: Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

מיפוי דיפוזיה מולקולרית בקרום פלזמה ידי מרובות יעד Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...