بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01EY018144.

1. الإنتاج، وطوي ثانية، وتنقية HPLC من هولو-RBP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل BL-21cells مع ناقلات pET3a لإيواء [كدنا] RBP الإنسان مع البطاقات صاحب 6X على محطة-N. تحول زراعة BL-21 في الخلايا شاكر في C ° 37 في 40 مل مع وسائل الإعلام LB كربنيسيلين حتى OD في 600 نانومتر تصل إلى 0.5. حمل RBP التعبير البروتين بإضافة IPTG ل1MM. تنمو هذه البكتيريا في 37 ° C آخر 5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RBP القولونية المنتجة في الوقت الحاضر هو في الغالب غير قابلة للذوبان في الهيئات إدراج. لإثراء الهيئات إدراج، الخلايا بيليه في 10،000 XG لمدة 20 دقيقة. يصوتن ثم الخلايا على الجليد في 5 مل PBS مع مثبطات الأنزيم البروتيني، تليها 2 دورات التجميد والذوبان. بيليه أسفل الهيئات إدراج في 20000 XG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف والحفاظ على بيليه على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان إدراج بيليه الجسم عن طريق صوتنة في 10 مل 7،5 هيدروكلوريد الجوانيدين M. إضافة وحدة تخزين النصف (5 مل) من 25 مم تريس العازلة، 9.0 درجة الحموضة وDTT إلى ج النهائيoncentration من 10 مم. مزيج بقوة على حل خلاط دوامة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة للحد تماما وتفسد البروتينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الحل البروتين لإزالة المواد غير القابلة للذوبان في 18000 x ج لمدة 20 دقيقة في C. ° 4 بعد زيادة ونقصان، ونقل إلى أنبوب طاف جديدة ووضع أنبوب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أربعة مجلدات (60 مل) من العازلة طوي ثانية (25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 9.0، 0.3 مم سيستين، 3.0 السيستين ملم، 1 ملم EDTA). ديغا المخزن المؤقت طوي ثانية. إعداد أيضا 600 ميكرولتر الريتينول ملي 10 في الايثانول تحت ضوء أحمر خافت. يبقيه في الظلام على الجليد. كل المخزن المؤقت طوي ثانية والحل الريتينول يجب أن تكون طازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبريد كلا من البروتين والحل المخزن المؤقت طوي ثانية على الجليد لمدة لا تقل 30 دقيقة. ارتفاع درجة الحرارة يقلل من المرجح نوعية refolded RBP. إضافة 1 مل العازلة طوي ثانية نقطه نقطه و 10 ميكرولتر حل الريتينول بدوره في حين يتم خلط البروتين بقوة الحل في كوب على الجليد. كرر هذه الخطوة حتى جميع العازلة طوي ثانية والريتينولتضاف. الحفاظ على اثارة رد فعل على الجليد في الظلام لمدة 5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار رد فعل طوي ثانية في 24000 XG لمدة 30 دقيقة في C. ° 4 لا بد من إزالة الركام الحق بعد رد فعل طوي ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز الحل طاف باستخدام Amicon الترا المكثف 15 (MWCO 10 K) إلى حوالي 10 مل. لا تركز على حل refolded أكثر من هذا المستوى. وسوف تركز أكثر من اللازم يؤدي إلى تجميع البروتين ويقلل من المحصول النهائي ونوعية RBP مطوية بشكل صحيح. تمييع عينة مركزة من البرد PBS إلى 100 مل. والغرض من هذه الخطوة هو إزالة المكونات في رد فعل طوي ثانية التي تتداخل مع تنقية النيكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور حل واحد لمزيد من الوقت في 24000 x ج لمدة 20 دقيقة في C. ° 4 من المهم لإزالة أي راسب. نقل طاف لكل منهما 50 مل أنابيب، كل منها يحتوي على 1 مل ني NTA الطين التي تم غسلها مع برنامج تلفزيوني. تدوير أنابيب في C ° 4 لمدة ساعة. تفرخ المخفف و حلأو يمكن أن يتسبب في 1 ساعة هطول الأمطار تتجمع البروتينات التي تحتاج إلى إزالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور أسفل أنابيب في 500 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف بعناية. يجب إزالة أي شيء عائم. إضافة الباردة PBS إلى 30 مل لكل أنبوب. تدور مرة أخرى وإزالة طاف. كرر هذه العملية حتى ترى سوى الخرز في الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الراتنج ني NTA لعمود فارغ. غسل الراتنج مع وحدات التخزين العمود 20 من إيميدازول 10 مم، 500 ملي كلوريد الصوديوم في برنامج تلفزيوني. أزل صاحب-RBP في حجم العمود 5 من الاميدازول 100 ملم في برنامج تلفزيوني. لا تقم بتخزين هذا الحل لفترة طويلة من الزمن، وتجميد يقلل العائد النهائي والجودة. للحصول على أفضل نتيجة، تنقية RBP بواسطة HPLC على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze صاحب-RBP تنقيته من الراتنج ني NTA ضد تريس 25 ملم، ودرجة الحموضة 8.4، و 120 ملي مول كلوريد الصوديوم. ويمكن أيضا أن تستخدم مكثف لتبادل العازلة. واضحة لعينات HPLC بواسطة الطرد المركزي في 16000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية الحق قبل كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية هولو-RBP على HPLC باستخدام أيونتبادل العمود AX-300 من التدرج خطوة كلوريد الصوديوم (220 ملي 12 دقيقة، 360 مم 15 دقيقة، وملي 1000 15 دقيقة) باستخدام 25 مم تريس، ودرجة الحموضة 8.4 والطور المتحرك في 1 مل / دقيقة. مع ارتفاع تركيز كلوريد الصوديوم، يتم تحريرها هولو-RBP بينما صاحب-APO-RBP وتتجمع RBP البقاء منضما إلى عمود (الشكل 1). إذا لم يتم RBP طوي ثانية على النحو الأمثل، تتجمع RBP (مثل تتجمع RBP-I في الشكل 1) يمكن أن تسود إعداد كله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد مطوية بشكل صحيح هولو-RBP من كسور في ذروة 360 مم كلوريد الصوديوم. ترصد بعناية الشخصي شطف من مطوية بشكل صحيح وتتجمع صاحب-RBP. كلوريد الصوديوم في ملي 1،000، تتجمع معظم ينبغي الإفراج عن صاحب-RBP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تجميع الكسور التي تحتوي على هولو-RBP، تتركز، ومدال ضد PBS بين عشية وضحاها في C. ° 4 تحقق العائد النهائي والجودة (330 nm/280 نانومتر) من الطيف. يجب أن يكون المنتج بشكل صحيح مطوية A 330 نانومتر nm/280 نسبة من أعلى قليلا من 1 (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالمنتجه APO-RBP، إضافة حجم مساو من هيبتان إلى تنقية هولو-RBP وتخلط بلطف عن طريق تناوب بين عشية وضحاها في C. ° 4 الطرد المركزي في 16000 ز لمدة 10 دقيقة في C ° 4 و نقل بعناية مرحلة القاع المائية إلى أنبوب جديد (تجنب الراسب في واجهة). تكرار هذه العملية ثلاث مرات مع الحضانة 3 لكل ساعة. تحقق امتصاص الطيف على Nanodrop للتأكد من ذروة 330 نانومتر قد انخفض إلى مستوى الخلفية. </li></ol> 2. في الوقت الحقيقي رصد STRA6 المحفزة الإصدار الريتينول الريتينول وتحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع سوداء جيدا 96-Microfluor-2 لوحة (الحرارية العلمية) مع 200 ميكرولتر من الكازين مانع (بيرس) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لمنع الالتصاق غير محدد من هولو-RBP إلى البلاستيك. مانع الكازين يعطي تأثير أفضل من عرقلة الحلول حجب تم اختبار جميع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الأغشية الطازجة من الخلايا أو الخلايا معربا عن STRA6 سيطرة على استخدام PBS ومرت حقنة هاميلتون (GastiGHT # 1710) 6 مرات لإنتاج موحدة في التعليق PBS. ونحن عادة استخدام الأغشية المستمدة من 100/1 إلى 1/20 من الخلايا نمت على طبق مم 100 في رد الفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الآبار المغلفة من لوحة Microfluor-2 مرة مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. تبرد لوحة على الجليد قبل إضافة التعليق غشاء (50 ميكرولتر لكل بئر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قياس الحقيقي في الوقت الحقيقي رصد مضان الريتينول باستخدام البصريات مضان من أوميغا POLARstar (BMG LABTECH) مع 320ex الإثارة تصفية وتصفية الانبعاثات 460-10. يتم تعيين البرنامج إلى نقطة النهاية وضع القراءة. ويمكن أيضا وضع لوحة استخدامها لقياس دورة الوقت إذا لم تختلف الفواصل الزمنية. الإشارة من كل نقطة في الساعة بمعدل 10 قياسات (في المتوسط ​​المدارية التي يبلغ قطرها 2 ملم) ويتم تعيين مكسب في 1،800. تهتز لوحة لمدة 10 ثانية في 500 دورة في الدقيقة باستخدام نقرا مزدوجا المدارية الهز قبل كل قياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء الفحص الإفراج الريتينول، وقراءة الآبار مرة واحدة باستخدام نقطة النهاية قراءة ميضاف قصيدة قبل هولو-RBP (تركيز عادة ميكرومتر 1 انتهاء) في 0 دقيقة. حالما يتم إضافة هولو-RBP، ويتم رصد رد فعل مستمر كل 5-10 دقيقة للساعة 1-3. لبدء الفحص التحميل الريتينول، جميع العابر الريتينول (عادة 1 ميكرومتر تركيز النهائي) يضاف إلى الآبار تحت ضوء أحمر خافت. للقراءة مرة واحدة لوحة قبل إضافة APO-RBP في 0 دقيقة. حالما يتم إضافة APO-RBP، ويتم رصد رد فعل مستمر كل 5-10 دقيقة للساعة 1-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من جميع القياسات، تحميل البيانات الخام (على سبيل المثال هو موضح في الشكل 2) من تحليل البيانات البرمجيات أوميغا (BMG LABTECH) إلى Microsoft Excel لتحليل البيانات. كل نقطة زمنية بإنشاء ملف الذي يحتوي على القراءات لجميع الظروف التجريبية. على سبيل المثال، إذا كان هناك نقاط زمنية 20، 20 ملف إلى تعزيز ملف Excel واحدة لتحليل البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل البيانات، تعتبر الإشارات مضان قبل إضافة الريتينول أو هولو RBP-0 دقيقة في الخلفية والإشاراتطرح د من إشارات مضان النهائي في جميع نقاط الوقت. على الرغم من انخفاض مقارنة الإشارات الخلفية لمضان الريتينول في هولو-RBP، طرح خلفية يلغي تأثير غير محدد من تشتت الضوء بواسطة الأغشية ويجعل من الممكن للتركيز على الريتينول مضان من هولو-RBP أو الريتينول وأضاف في 0 دقيقة. </li></ol> 3. في الوقت الحقيقي رصد STRA6 المحفزة النقل من الريتينول من هولو-RBP لCRBP-I <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الريتينول-EGFP هو جديد بالرنين نقل مضان (الحنق) الزوج أنه قد تم مؤخرا تأسيس 41. STRA6 المحفزة الريتينول النقل من هولو-RBP لEGFP-CRBP-I رصد في الوقت الحقيقي وذلك عن طريق قياس الريتينول-EGFP الحنق. ويتم إنتاج EGFP-CRBP-I البروتين الانصهار مع البطاقات 6XHis (EGFP-CRBP-I) في خلايا الثدييات ويتم تنقيته في ني NTA الراتنج قبل التجربة. ويمكن تخزين EGFP-CRBP-I في برنامج تلفزيوني مع مثبطات الأنزيم البروتيني لفترة قصيرة من الزمن في C. ° 4 وبدلا من الانصهار البروتين طق المجمدة في -80 درجة مئوية في مأخوذة الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل ردود الفعل، وإعداد منعت Microfluor-2 لوحة والأغشية كما هو موضح أعلاه. غسل الآبار المغلفة من لوحة Microfluor-2 مرة مع 200 ميكرولتر PBS قبل إضافة التعليق غشاء (50 ميكرولتر لكل بئر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قياس الوقت الحقيقي الريتينول-EGFP الحنق باستخدام POLARstar أوميغا مع 320ex الإثارة تصفية والمرشحات الانبعاثات 460-10 510-10 والخاص في وقت واحد مبارزة الانبعاثات مضان البصريات. يتم تعيين البرنامج إلى نقطة النهاية وضع القراءة. ويمكن أيضا وضع لوحة استخدامها لقياس دورة الوقت إذا لم تختلف الفواصل الزمنية. الإشارة من كل نقطة في الساعة بمعدل 10 قياسات (في المتوسط ​​المدارية التي يبلغ قطرها 2 ملم) ويتم تعيين مكسب لكل قناة عند 1،800. تهتز لوحة لمدة 10 ثانية في 500 دورة في الدقيقة باستخدام نقرا مزدوجا المدارية الهز قبل كل قياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء التفاعلات، EGFP-CRBP-I (عادة 1 ميكرومتر تركيز النهائي) يضاف إلى الآبار. للقراءة على لوحةيضاف CE باستخدام وضع نقطة النهاية قبل القراءة هولو-RBP في 0 دقيقة. حالما يتم إضافة هولو-RBP، ويتم رصد رد فعل مستمر عن طريق قياس كل 5-10 دقيقة للساعة 1-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من جميع القياسات، تحميل البيانات الخام (على سبيل المثال هو موضح في الشكل 3) من برنامج تحليل أوميغا البيانات إلى Microsoft Excel لتحليل البيانات كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الريتينول-EGFP الحنق يمثل الفرق الناتج عن دينامية التغيير في نسبة الانبعاثات من قمم متقبل / المانحة 47. المعادلة من 41 إلى حساب هذه النسبة [(510 ر -510 ب) / (460 ر -460 ب)]، حيث 510 ر، ب 510، ر 460، وب 460 تمثل الانبعاثات بنحو 510 نانومتر بعد الشروع في رد فعل ( ر = الوقت نقطة)، بنحو 510 نانومتر قبل الريتينول أو هولو RBP-يضاف (ب = الخلفية) حيث بلغت 460 نانومتر بعد الشروع في رد فعل (ر = نقطة زمنية)، وبلغت 460 نانومتر قبل الريتينول أو هولو RBP المضافة و (ب = الخلفية)، على التوالي. </li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نحن هنا لتبادل الإنتاج RBP الأمثل لبروتوكول RBP إنتاج وتنقية الإجراءات الحاسمة لتوليد RBP مطوية بشكل صحيح. نظرا لإمكانية الأنواع RBP تتجمع وجود كميات ضئيلة من البروتينات البكتيرية حتى في HPLC تنقية البكتيريا المنتجة RBP، فمن المفيد استخدام الممارسات التجارية التقييدية الأص...

فيتامين A هو جزيء العضوية التي لا غنى عنها لبقاء الإنسان وحسن سير جميع أجهزة الإنسان تقريبا. فيتامين A المشتقات (الرتينوئيدات) المشاركة في مختلف الأحداث البيوكيميائية والخلوية بما في ذلك الاستشعار من الضوء لرؤية 1،2 وتنظيم التعبير الجيني والترجمة البروتين أثناء التطور الجنيني والكبار في الأنسجة 3-6. على الرغم من الريتينول لديه القدرة على نشر نظام ككل، وجاء مع تطور البلازما بروتين ملزمة الريتينول، وهو بروتين الناقل محددة لفيتامين (أ) النقل في الدم لتحقيق الكفاءة العالية والدقة وتجنب السمية المرتبطة نشر عشوائي 7-10. A مستقبلات عالية تقارب الممارسات التجارية التقييدية التي تربط لويستغرق فيتامين A كان الافتراض في 1970s و11-13. على الرغم من الأدلة المتراكمة منذ ثلاثة عقود على وجود مستقبلات RBP 14-31، وناقشت فرضية مستقبلات لسنوات عديدة نظرا لexistenc(ه) من تعريف غير صحيح من هولو-RBP. التعريف الصحيح للهولو-RBP هو أنه هو مجمع عالية تقارب بين الريتينول 01:01 والممارسات التجارية التقييدية. استخراج المتكررة من قبل هولو-RBP المذيبات العضوية ضروري لإنتاج APO-RBP. ويستخدم هذا التعريف من قبل مختبرات كلها تقريبا دراسة RBP 7،9،32-35 أو مستقبلات RBP 14-31،36-42. تعريف غير صحيح من هولو-RBP الذي تم استخدامه لدحض وجود مستقبلات RBP هو خليط من الريتينول الحاد الحرة مع APO-RBP. منذ وظيفة مستقبلات فيتامين A في RBP امتصاص من هولو-RBP هو الافراج عن الريتينول من هولو-RBP، فإن مستقبلات RBP تلعب أي دور في امتصاص فيتامين الريتينول إذا مجاني لتبدأ (على النحو الذي اقترحه تعريف غير صحيح من هولو -RBP). دعا مؤخرا تحديد مستقبلات RBP باعتبارها multitransmembrane البروتين مجال STRA636 وظيفتها في امتصاص فيتامين A-من هولو RBP 36-43 يجادل بقوة ضد فرضية أن لا RBPتحتاج إلى مستقبلات فيتامين لتقديم تحليلات مفصلة A. كشفت أن لديها STRA6 المجالات عبر الغشاء 9 مع محطة تقع خارج الخلية-N وC-تقع محطة داخل خلوي 40. عبر الغشاء الواقع بين 6 و 7 هو مجال الممارسات التجارية التقييدية الأساسية ملزمة 39. ويقترن STRA6 على حد سواء والانتقال بعيد المدى المحددة CRBP-I في امتصاص فيتامين A-RBP من هولو، ولكن لا الانتقال بعيد المدى المحددة ولا CRBP-I. مطلوب للغاية لتعزيز النشاط STRA6 41 القدرة على تحفيز STRA6 الريتينول بيان من هولو-RBP هو المفتاح لفيتامين A في نشاط امتصاص 41. من خلال الاعتماد على STRA6 لاطلاق سراح الريتينول، ويمكن التسليم عن طريق فيتامين (أ) فيتامين (أ) نقل RBP لاستهداف الخلايا في الأنسجة الطرفية مع خصوصية عالية وكفاءة. ويتضح على الأهمية الحاسمة لتعريف هولو-RBP وليس فقط عن طريق إعداد النقاش التاريخية على وجود مستقبلات RBP، ولكن أيضا من خلال الورقات الثلاث الأخيرة ذات الصلة على أساس تعريفات DIF-هولو RBPferent من التعريف الأصلي والصحيح 44-46. استخدام الورقة الأولى التعريف هولو-RBP التي تم استخدامها في رفض وجود مستقبلات RBP لدراسة مستقبلات RBP 44. جاء الأوراق الثاني والثالث إلى تعريف الثالث من هولو-RBP التي جعلت من أقل احتمالا لالريتينول إلى دراسة لتشكيل مجمع السليم مع RBP 45،46. أعدت هذه الدراسات عن طريق خلط 3 H-retinol/RBP هولو-RBP (ولا حتى APO-RBP) مع 3 H-الريتينول. وبما أن هذا الفحص لم ديك 3 H-retinol/RBP شكلت ولم إزالة المفرط مجانا 3 H-الريتينول 45،46، فإنه ليس مقايسة لامتصاص فيتامين H-3 من 3 H-retinol/RBP، ولكن هو حر 3 نشر الفحص H-الريتينول. فقد تبين في وقت سابق ان STRA6 لا يعزز امتصاص الخلوية من الريتينول مجانا من الانتقال بعيد المدى المحددة 38 أو CRBP-I 41. تقريبا لا بد لجميع الممارسات التجارية التقييدية الريتينول في الدم وعدم وجود كشف الصحائفه الريتينول. A المهمة الرئيسية للمستقبلات RBP هو تحفيز إطلاق الريتينول من هولو-RBP خلال امتصاص فيتامين إي من هولو-RBP 41. إذا تم الافراج بشكل مصطنع أو الريتينول في شكل حر لتبدأ 45،46، ليست هناك حاجة لمستقبلات RBP. النتائج مختلفة بشكل كبير تم الحصول عليها من فحص مجاني نشر الريتينول بالمقارنة مع المقايسات يعتمد على استعداد بشكل صحيح هولو-RBP توضيح أن إعداد الصحيح للRBP أمر حاسم لفحوصات جانه الفنية. يمكن تنقيته من مصل الإنسان RBP 41، لكن الإجراء معقد والعائد منخفض. نهج بديل هو إنتاج RBP في E. القولونية. لأن E. القولونية ليس لديها القدرة على أضعاف بشكل صحيح الثدييات البروتينات يفرز مع أكثر من زوج واحد من السندات ثاني كبريتيد مثل RBP، لا بد من الممارسات التجارية التقييدية refold وتنقية البروتين مطوية بشكل صحيح. البروتينات تتجمع لا تتصرف بشكل مختلف عن RBP فقط مطوية تصحيحه في المقايسات المختلفة،ولكن يمكن أيضا أن يسبب تراكم البروتين أثناء التخزين. لنفس السبب، ويتم إنتاج سوى APO-RBP عالية الجودة من هولو-RBP. نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل لانتاج عالية الجودة 100٪ RBP محملة الريتينول من خلال التعبير البكتيرية، طوي ثانية، وتنقية HPLC. HPLC تنقية ليس فقط يزيل RBP مطوية بشكل غير صحيح ولكن أيضا التلوث الجرثومي كبيرة القطع الأثرية التي يمكن أن تسبب خطورة إذا تم استخدام الممارسات التجارية التقييدية في المقايسات نقل الإشارة. وصفنا أيضا اثنين من تقنيات الرصد الحساسة في الوقت الحقيقي لدراسة الريتينول النقل STRA6. كل تقنيات تعتمد على الممارسات التجارية التقييدية ذات جودة عالية. نظرا لضيق المكان، والتقنيات الكلاسيكية المشعة فيتامين ريتينويد القاعدة والقائمة على HPLC لا وصف المقايسات امتصاص هنا.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الجوانيدين هيدروكلوريد </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> سيستين </td><td> سيجما </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> السيستين </td><td> سيجما </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> الصياد </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> تريس </td><td> الصياد </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> الريتينول </td><td> سيجما </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> كربنيسيلين </td><td> الصياد </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> الصياد </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> ني NTA </td><td> QIAGEN </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> إيميدازول </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> هيبتان </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> مانع الكازين </td><td> خرق </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon الترا المكثف 15 (MWCO10 K) </td><td> ميليبور </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 لوحة </td><td> الصياد </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> هاميلتون حقنة Gastight # 1710 </td><td> الصياد </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

فيتامين A ضروري لرؤية و. النمو / التفريق بين جميع أجهزة الإنسان تقريبا الريتينول البلازما بروتين ملزمة (RBP) هو مبدأ والناقل محددة من فيتامين A في الدم. نحن هنا وصف تقنية محسنة لإنتاج وتنقية هولو-RBP واثنين من تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي لدراسة النقل من فيتامين A من قبل مستقبلات RBP عالية تقارب STRA6. أول تقنية يجعل من الممكن لإنتاج كمية كبيرة من نوعية عالية هولو-RBP (100٪ محملة الريتينول) لفيتامين (أ) المقايسات النقل. عالية الجودة RBP أمر ضروري لفحوصات الفنية لتتجمع RBP النشرات فيتامين A تلوث بسهولة والبكتيرية في إعداد RBP يمكن أن يسبب التحف. جعلت تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي مثل الكهربية إسهامات حاسمة في دراسات النقل الغشاء. لم يتم النقل RBP الريتينول مستقبلات بوساطة تحليلها في الوقت الحقيقي حتى وقت قريب. والأسلوب الثاني هو موضح هنا الجرميةل في الوقت تحليل الإفراج الريتينول STRA6 المحفزة أو التحميل. أسلوب الثالث هو في الوقت الحقيقي تحليل STRA6 المحفزة النقل من الريتينول هولو-RBP إلى الريتينول الخلوية I بروتين ملزمة (CRBP-I). هذه التقنيات توفر حساسية عالية في الكشف والقرار فيتامين A في RBP مستقبلات آلية الامتصاص.

نقدم نتائج ممثلة هنا للهولو-RBP إنتاج وتنقية من قبل HPLC (الشكل 1)، في الوقت الحقيقي تحليل STRA6 المحفزة الإفراج الريتينول من هولو-RBP وتحميل الريتينول إلى APO-RBP (الشكل 2) في الوقت الحقيقي وتحليل STRA6 المحفزة الريتينول النقل من هولو-RBP لEGFP-CRBP-I (الشكل 3). <...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

نحن هنا وصف تقنية الأمثل لإنتاج عالية الجودة فيتامين A معقدة RBP / واثنين من تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي لدراسة فيتامين A النقل STRA6، ومستقبلات RBP.

في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

real-time-analyses-retinol-transport-membrane-receptor-plasma-retinol

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  University of California, Los Angeles. نحن هنا وصف تقنية الأمثل لإنتاج عالية الجودة فيتامين A معقدة RBP / واثنين من تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي لدراسة فيتامين A النقل STRA6، ومستقبلات RBP.

Video: Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

إعادة إعماره البيوكيميائية من مستقبلات البروتين الستيرويد • المجمعات Hsp90 وإعادة تنشيط يجند تجليد

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

في الوقت الحقيقي رصد يجند مستقبلات التفاعل مع الإسفار نقل الطاقة الرنين

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

خلايا الثدييات إضاءة الحيوية مستقل للمراقبة المستمرة وريال مدريد في الوقت السمسة

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

التصوير البلازما غشاء التشويهات مع pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

قياسات الوقت الحقيقي من البروتين غشاء: مستقبلات التفاعلات عن طريق مأكل السطح الرنين (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...