Con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01EY018144.

1. Producción, replegamiento y purificación por HPLC de holo-RBP <ol><li> Transformar BL-21cells con el vector pET3a que alberga el cDNA humano para RBP con 6x His en el extremo N-terminal. Cultivar las transformadas BL-21 células en un agitador a 37 ° C en 40 ml de medio LB con carbenicilina hasta que la DO a 600 nm alcanza 0,5. Inducir la expresión de proteínas RBP mediante la adición de IPTG a 1 mM. Crecer las bacterias a 37 ° C otra 5 hr. </li><li> RBP producida en E. coli es en su mayoría presentes en cuerpos de inclusión insolubles. Para enriquecer los cuerpos de inclusión, las células de pellets a 10.000 xg durante 20 min. Entonces sonicar las células en hielo en 5 ml de PBS con inhibidores de la proteasa, seguido por 2 ciclos de congelación y descongelación. Pellet abajo los cuerpos de inclusión a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Remover el sobrenadante y el sedimento mantener en hielo. </li><li> Solubilizar el cuerpo de inclusión mediante sonicación pellet en 10 ml de clorhidrato de guanidina 7,5 M. Añadir un volumen medio (5 ml) de tampón Tris 25 mM, pH 9,0 y DTT a un final concentration de 10 mM. Mezclar vigorosamente la solución en un vórtex durante la noche a temperatura ambiente para reducir completamente y desnaturalizar las proteínas. </li><li> Centrifugar la solución de proteína para eliminar el material insoluble a 18.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y se coloca el tubo en hielo. </li><li> Preparar cuatro volúmenes (60 ml) de tampón de replegamiento (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM de cistina, cisteína 3,0 mM, 1 mM EDTA). Desgasificar el tampón de replegamiento. También hay que preparar 600 l 10 mM en etanol retinol bajo luz roja tenue. Mantenerlo en la oscuridad sobre hielo. Tanto el tampón de replegamiento y solución de retinol que estar recién preparada. </li><li> Enfriar tanto la solución de proteína y el tampón de replegamiento en hielo durante al menos 30 min. Una temperatura más alta probablemente reduce la calidad de las prácticas comerciales restrictivas replegado. Añadir 1 ml de replegamiento gota a gota solución tampón y 10 l retinol a su vez, mientras que la solución de proteína se mezcla vigorosamente en un vaso de precipitados sobre hielo. Repita este paso hasta que el tampón de replegamiento y retinolse añaden. Mantener la agitación de la reacción en hielo en la oscuridad durante 5 hr. </li><li> Decantar la reacción de replegamiento a 24.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Es esencial para eliminar los agregados después de la reacción de replegamiento. </li><li> Se concentra la solución sobrenadante utilizando concentrador Amicon Ultra 15 (MWCO 10 K) a aproximadamente 10 ml. No concentrar la solución replegó más de este nivel. Concentrarse demasiado dará lugar a la agregación de proteínas y baja el rendimiento final y calidad de RBP correctamente plegada. Diluir la muestra concentrada con PBS frío a 100 ml. El propósito de este paso consiste en eliminar los componentes de la reacción de replegamiento que interfieren con la purificación de níquel. </li><li> Haga girar la solución una vez más a 24.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Es importante para eliminar cualquier precipitado. Transferir el sobrenadante a dos tubos de 50 ml, conteniendo cada uno 1 ml de Ni-NTA de lodos que se ha lavado con PBS. Girar los tubos a 4 º C durante una hora. Incubando f solución diluidao 1 hr puede causar la precipitación de proteínas mal plegadas que necesitan ser removidos. </li><li> Decantar los tubos a 500 xg durante 3 min. Retire con cuidado el sobrenadante. Flotante nada debe ser eliminado. Añadir PBS frío a 30 ml para cada tubo. Girar de nuevo y eliminar el sobrenadante. Repita este proceso hasta que vea nada más que cuentas en el tubo. </li><li> Transferir la resina Ni-NTA a una columna vacía. Lavar la resina con 20 volúmenes de columna de imidazol 10 mM, NaCl 500 mM en PBS. Eluir Su-RBP en 5 volúmenes de columna de 100 mM de imidazol en PBS. No almacenar esta solución durante un período prolongado de tiempo, y la congelación reduce el rendimiento final y calidad. Para un mejor resultado, purificar RBP por HPLC inmediatamente. </li><li> Dializar Su-RBP purificada a partir de la resina Ni-NTA contra 25 mM Tris, pH 8,4, y NaCl 120 mM. Un concentrador también puede ser utilizado para el intercambio de tampón. Muestras claras para HPLC por centrifugación a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C justo antes de cada ejecución. </li><li> Purificar holo-RBP en HPLC utilizando un ioncolumna de intercambio AX-300 por un gradiente escalonado de NaCl (220 mM 12 min, 360 min 15 mM, y mM 1.000 15 min) usando 25 mM Tris, pH 8,4 como fase móvil a 1 ml / min. A medida que aumenta la concentración de NaCl, holo-His-RBP se libera mientras que apo-RBP y mal plegadas RBP permanecer atado a la columna (Figura 1). Si replegamiento RBP no se realiza de manera óptima, misfolded RBP (por ejemplo, mal plegadas RBP-I en la Figura 1) puede predominar la preparación entera. </li><li> Recuperar el plegado correctamente holo-RBP de las fracciones del pico a 360 mM NaCl. Es importante vigilar cuidadosamente el perfil de elución de plegado correctamente y mal plegado Su-RBP. A partir de 1.000 mM NaCl, la mayor parte de su mal plegadas-RBP deben ser liberados. </li><li> Las fracciones que contienen holo-RBP se reunieron, se concentraron, y se dializó frente a PBS durante la noche a 4 ° C. Comprobar el rendimiento final y calidad (330 nm/280 nm) con un espectrofotómetro. Producto correctamente plegado debe tener una relación de 330 nm/280 nm de ligeramente superior a 1 (Figura 1). </li><li> Para la produccióne apo-RBP, añadir un volumen igual de heptano purificado para la holo-RBP y mezclar suavemente por rotación durante la noche a 4 ° C. Centrifugar a 16.000 g durante 10 min a 4 ° C y transferir cuidadosamente la fase acuosa inferior a un nuevo tubo (evitando el precipitado en la interfase). Repetir el proceso tres veces con una incubación de 3 horas para cada una. Ver absorción en un espectrofotómetro Nanodrop para asegurarse de que el pico de 330 nm se ha reducido al nivel de fondo. </li></ol> 2. Monitoreo en tiempo real de STRA6 catalizada Release Retinol Retinol y Carga <ol><li> Bloquear un negro de 96 pocillos Microfluor-2 placa (Thermo Scientific) con 200 l de bloqueador de caseína (Pierce) durante la noche a 4 ° C para evitar la adherencia no específica de holo-RBP al plástico. Bloqueador de caseína da el mejor efecto de bloqueo de las todas las soluciones de bloqueo que probamos. </li><li> Las membranas recién preparadas a partir de células que expresan STRA6 o células de control se lavan con PBS y se pasa a través de una jeringa Hamilton (GastiGHT # 1710) 6 veces para producir una suspensión uniforme en PBS. Nos suelen utilizar membranas derivadas de 1/100 a 1/20 de las células cultivadas en una placa de 100 mm por reacción. </li><li> Lavar los pocillos recubiertos de la placa Microfluor-2 una vez con 200 l de PBS. Se enfría la placa en hielo antes de la adición de suspensión de membrana (50 l por pocillo). </li><li> Seguimiento en tiempo real de retinol fluorescencia se mide utilizando la óptica de fluorescencia de la Omega Polarstar (BMG Labtech) con el filtro de excitación 320ex y el filtro de emisión 460-10. El programa se establece en el modo de lectura Punto final. El modo de placa también se puede utilizar para medir la evolución temporal de si los intervalos de tiempo no son variadas. La señal de cada punto de tiempo es la media de 10 mediciones (promedio orbital con un diámetro de 2 mm) y la ganancia se fija en 1.800. La placa se agita durante 10 segundos a 500 rpm usando doble agitación orbital antes de cada medición. </li><li> Para iniciar el ensayo de liberación de retinol, los pocillos se leen una vez con el extremo de la lectura moda antes de holo-RBP (típicamente 1 mM concentración final) se añade a 0 min. Tan pronto como holo-RBP se añade, la reacción se controla continuamente cada 5-10 minutos durante 1-3 hr. Para iniciar el ensayo de carga de retinol, retinol todo trans (típicamente de 1 mM de concentración final) se añadieron a los pocillos bajo luz roja tenue. La placa se lee una vez antes de apo-RBP se añade a 0 min. Tan pronto como apo-RBP se añade, la reacción se controla continuamente cada 5-10 minutos durante 1-3 hr. </li><li> Después de que todas las mediciones se realizan, descarga los datos en bruto (ejemplo mostrado en la Figura 2) desde el software de análisis de datos Omega (BMG Labtech) a Microsoft Excel para el análisis de datos. Cada punto de tiempo genera un archivo que contiene las lecturas de todas las condiciones experimentales. Por ejemplo, si hay 20 puntos de tiempo, 20 consolidar archivos en un único archivo de Excel para el análisis de datos. </li><li> Para el análisis de datos, las señales de fluorescencia antes de la adición de retinol o holo-RBP a 0 min se consideran señales de fondo unad resta de las señales de fluorescencia final en todos los puntos temporales. Aunque las señales de fondo son bajas comparadas con retinol fluorescencia en holo-RBP, restando el fondo elimina la influencia específica de dispersión de luz por las membranas y permite concentrarse en la fluorescencia de holo-retinol o retinol RBP a 0 min. </li></ol> 3. Monitoreo en tiempo real de STRA6 catalizada Transporte de Retinol De holo-RBP a CRBP-I <ol><li> Retinol-EGFP es una nueva transferencia de resonancia de fluorescencia (FRET) par que se ha creado recientemente 41. STRA6 catalizada por transporte de retinol holo-RBP para EGFP-CRBP-I se supervisa en tiempo real mediante la medición de retinol-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I proteína de fusión con etiqueta 6XHis (EGFP-CRBP-I) se produce en células de mamífero y se purificó en resina Ni-NTA antes del experimento. EGFP-CRBP-I se pueden almacenar en PBS con inhibidores de la proteasa durante un período corto de tiempo a 4 ° C. Alternativamente, la proteína de fusión is congelado a -80 º C en alícuotas pequeñas. </li><li> Antes de las reacciones, preparar un comandos Microfluor-2 y la placa de membranas como se describe anteriormente. Lavar los pocillos recubiertos de la placa Microfluor-2 una vez con 200 l de PBS antes de la adición de suspensión de membrana (50 l por pocillo). </li><li> En tiempo real retinol-EGFP FRET se mide usando Polarstar Omega con el filtro de excitación 320ex y los filtros de emisión 460-10 y 510-10 utilizando simultáneas duelo de emisión óptica de fluorescencia. El programa se establece en el modo de lectura Punto final. El modo de placa también se puede utilizar para medir la evolución temporal de si los intervalos de tiempo no son variadas. La señal de cada punto de tiempo es la media de 10 mediciones (promedio orbital con un diámetro de 2 mm) y la ganancia se fija en 1.800 por canal. La placa se agita durante 10 segundos a 500 rpm usando doble agitación orbital antes de cada medición. </li><li> Para iniciar las reacciones, EGFP-CRBP-I (típicamente 1 mM concentración final) se añadieron a los pocillos. La placa se lee ence usando el modo de lectura de punto final antes de holo-RBP se añade a 0 min. Tan pronto como holo-RBP se añade, la reacción se monitorizó continuamente mediante medición cada 5-10 minutos durante 1-2 hr. </li><li> Después de que todas las mediciones se realizan, descarga los datos en bruto (ejemplo mostrado en la Figura 3) desde el software de análisis Omega datos a Microsoft Excel para el análisis de datos como se describe anteriormente. </li><li> Retinol-EGFP FRET se calcula por la dinámica de cambio en la relación de los picos de emisión del aceptor / donante 47. La ecuación 41 para calcular esta razón es [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], donde t 510, 510 b, t 460, 460 y b representan las emisiones a 510 nm después de la iniciación de la reacción ( t = tiempo de punto), a 510 nm antes de retinol o holo-RBP se añade (b = fondo), a 460 nm después de la iniciación de la reacción (t = punto de tiempo), y en 460 nm antes de retinol o holo-RBP se añadió (b = fondo), respectivamente. </li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Compartimos aquí un protocolo RBP producción optimizada por prácticas comerciales restrictivas procedimientos de producción y purificación son fundamentales para la generación de prácticas comerciales restrictivas correctamente plegada. Dada la posibilidad de que especies RBP mal plegadas y la presencia de cantidades traza de proteínas bacterianas incluso en HPLC purificada producidas por bacterias RBP, es útil usar RBP nativo a partir de suero para confirmar una conclusión relacionada con RBP. RBP orina, que ...

La vitamina A es una molécula orgánica que es esencial para la supervivencia y el buen funcionamiento de casi todos los órganos humanos. Derivados de vitamina A (retinoides) participar en diversos eventos bioquímicos y celulares, incluyendo la detección de luz de 1,2 visión y la regulación de la expresión génica y la traducción de la proteína durante el desarrollo embrionario y en los tejidos adultos 3-6. Aunque retinol tiene la capacidad de difusión en forma sistémica, evolución subió con plasma proteína de unión a retinol, una proteína portadora específica para la vitamina A de transporte en la sangre para lograr una alta eficiencia y especificidad, y para evitar la toxicidad asociada con la difusión 7-10 aleatorio. Un receptor de alta afinidad que se une a la RBP y toma de vitamina A se planteó la hipótesis en la década de 1970 11-13. A pesar de la evidencia acumulada en tres décadas en la existencia del receptor RBP 14-31, la hipótesis del receptor fue objeto de debate durante muchos años debido a la existence de una definición incorrecta de holo-RBP. La definición correcta de holo-RBP es que es el complejo 1:1 de alta afinidad entre el retinol y RBP. Extracción repetida de holo-RBP por disolvente orgánico es necesario para producir apo-RBP. Esta definición es utilizada por casi todos los laboratorios que estudian las prácticas comerciales restrictivas 7,9,32-35 o el receptor de RBP 14-31,36-42. La definición incorrecta de holo-RBP que se usó para refutar la existencia del receptor RBP es la mezcla aguda de retinol libre con apo-RBP. Dado que la función del receptor de la vitamina A RBP en la captación de holo-RBP es liberar retinol de holo-RBP, el receptor de RBP jugaría ningún papel en la absorción de retinol si retinol es libre de empezar (como propone la definición incorrecta de holo -RBP). La reciente identificación de receptor RBP como una proteína de dominio multitransmembrane llamado STRA636 y su función en la absorción de vitamina A a partir de holo-RBP 36-43 fuertemente argumenta en contra de la hipótesis de que no RBPnecesita un receptor para entregar vitamina A. análisis detallado reveló que STRA6 tiene 9 dominios de transmembrana con el extremo N-terminal situadas extracelularmente y C-terminal localizado intracelularmente 40. Situado entre transmembrana 6 y 7 es un dominio esencial RBP unión 39. STRA6 está acoplado tanto LRAT y CRBP-I en la absorción de vitamina A a partir de holo-RBP, pero tampoco LRAT ni CRBP-I es absolutamente necesario para la actividad mejorada STRA6 41. STRA6 capacidad para catalizar la liberación de retinol a partir de holo-RBP es la clave para su actividad de vitamina A captación 41. Al basarse en STRA6 para liberar su retinol, la vitamina A entrega el RBP puede transportar la vitamina A para dirigir las células en los tejidos periféricos con alta especificidad y eficiencia. La importancia crítica del holo-RBP definición y preparación se ilustra no sólo por el debate histórico sobre la existencia del receptor RBP, pero también por tres documentos relacionados recientes basados ​​en holo-RBP definiciones DIFrente de la definición original y correcto 44-46. El papel utilizado por primera vez la definición holo-RBP que fue utilizado para desaprobar la existencia del receptor RBP para estudiar el receptor RBP 44. Los periódicos segundo y tercero, se le ocurrió una tercera definición de holo-RBP que lo hizo aún menos probable de retinol a estudiar para formar un complejo adecuado con las prácticas comerciales restrictivas 45,46. Estos estudios preparan mezclando 3 H-retinol/RBP holo-RBP (ni siquiera apo-RBP) con 3 H-retinol. Puesto que este ensayo no tenía 3 H-retinol/RBP formado y no eliminó excesivo libre 3 H-retinol 45,46, no es un ensayo para 3 H-retinol captación de 3 H-retinol/RBP, pero es una libre 3 H-retinol difusión ensayo. Se ha demostrado previamente que STRA6 no mejora la captación celular de retinol libre por LRAT 38 o CRBP-I 41. Prácticamente todos retinol está obligado a RBP en la sangre y no hay detectable free retinol. Una función principal del receptor RBP es catalizar la liberación de retinol a partir de holo-RBP durante la absorción de retinol holo-RBP 41. Si el retinol es artificialmente liberado o está en la forma libre de comenzar con 45,46, el receptor RBP no es necesario. Los resultados drásticamente diferentes obtenidos a partir del ensayo de difusión libre de retinol en comparación con los ensayos basados ​​en correctamente preparado holo-RBP ilustrar que la preparación correcta de RBP es crucial para sus ensayos funcionales. RBP puede purificar a partir de suero humano 41, pero el procedimiento es complejo y el rendimiento es bajo. Un enfoque alternativo es producir RBP en E. Debido a que E. coli. coli no tiene la capacidad para plegar correctamente proteínas secretadas de mamíferos con más de un par de enlaces disulfuro como RBP, es esencial para prácticas comerciales restrictivas replegamiento y purificar la proteína correctamente plegada. Proteínas mal plegadas, no sólo se comportan de manera diferente de las prácticas comerciales restrictivas corregido doblada en varios ensayos,pero también causan la agregación de proteínas durante el almacenamiento. Por la misma razón, apo-RBP se produce solamente a partir de alta calidad holo-RBP. Se describe aquí un protocolo optimizado para producir RBP alta calidad 100% cargado con retinol a través de la expresión bacteriana, replegamiento y purificación por HPLC. La purificación por HPLC no sólo elimina el RBP incorrectamente plegado, sino también una importante contaminación bacteriana que puede causar artefactos serios si RBP se utiliza en ensayos de transducción de señales. También se describen dos sensibles en tiempo real las técnicas de monitoreo para estudiar el transporte de retinol en STRA6. Ambas técnicas dependen de las prácticas comerciales restrictivas de alta calidad. Debido a limitaciones de espacio, las técnicas clásicas de vitamina radiactivos retinoide y basado en HPLC basado-A ensayos de absorción no se describen aquí.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> hidrocloruro de guanidina </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> cistina </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> cisteína </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescador </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Pescador </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicilina </td><td> Pescador </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescador </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptano </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Casein Blocker </td><td> Atravesar </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 concentrador (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 placa </td><td> Pescador </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton jeringa hermética # 1710 </td><td> Pescador </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

La vitamina A es esencial para la visión y el crecimiento / diferenciación de casi todos los órganos humanos. Plasma proteína de unión a retinol (RBP) es el principio y el soporte específico de la vitamina A en la sangre. Aquí se describe una técnica optimizada para producir y purificar holo-RBP y dos en tiempo real de técnicas de supervisión para estudiar el transporte de vitamina A por el receptor de alta afinidad RBP STRA6. La primera técnica hace que sea posible producir una gran cantidad de alta calidad holo-RBP (100%-cargado con retinol) para la vitamina A ensayos de transporte. RBP de alta calidad es esencial para ensayos funcionales porque misfolded RBP versiones vitamina contaminación bacteriana y fácilmente en la preparación RBP pueden causar artefactos. En tiempo real las técnicas de vigilancia como la electrofisiología han hecho contribuciones importantes a los estudios de transporte de membrana. La RBP receptor mediada por el transporte de retinol no se ha analizado en tiempo real hasta hace poco. La segunda técnica descrita aquí es la razónl análisis en tiempo de STRA6 catalizada por la liberación de retinol o de carga. La tercera técnica es analizar en tiempo real de STRA6 catalizada por transporte de retinol holo-RBP para celular proteína de unión a retinol I (CRBP-I). Estas técnicas proporcionan una alta sensibilidad y resolución en la revelación de receptor de la vitamina del RBP un ​​mecanismo de absorción.

Presentamos aquí los resultados representativos de holo-RBP producción y purificación por HPLC (Figura 1), análisis en tiempo real de STRA6 catalizada por la liberación de retinol holo-RBP y la carga de retinol en apo-RBP (Figura 2) y el análisis en tiempo real de STRA6 catalizada retinol transporte de holo-RBP a EGFP-CRBP-I (Figura 3). Sin replegamiento, RBP producida en bacterias es casi completamente plegadas incorrectamente debido ...

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Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Aquí describimos una técnica optimizada para producir alta calidad complejo de vitamina A / RBP y dos técnicas en tiempo real de seguimiento para estudiar la vitamina A por STRA6 transporte, el receptor de las prácticas comerciales restrictivas.

En tiempo real de análisis de transporte de retinol en el receptor de la membrana de plasma Proteína Fijadora del Retinol

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

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13.6K vistas.  University of California, Los Angeles. Aquí describimos una técnica optimizada para producir alta calidad complejo de vitamina A / RBP y dos técnicas en tiempo real de seguimiento para estudiar la vitamina A por STRA6 transporte, el receptor de las prácticas comerciales restrictivas.