אנו מודים לכל החברים במעבדה שלנו לדיונים מועילים. אנו מודים ג&#39;ואנה Lisztwan וכריסטינה Gewinner לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק BBSRC BB/I021248/1 וקרן Wellcome מענק 090090/Z/09/ZAH היא עמית קרן Wellcome מחקר פיתוח קריירה בUCL מכון הסרטן.

1. שיבוט של pcDNA6_TetR_IRES_blast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שמודגם באיור 3, לבצע עיכול חלקי של pcDNA6/TR פלסמיד (V1025-20, Invitrogen) עם הגבלת אנזימי Xba אני והמש&quot;ק להסיר את גן TetR והאמרגן של התנגדות blasticidin (BlastR) הגן. לבודד את בר 4.6 קילו הווקטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את רצף polyadenylation מגן TetR, להציג באמצעות PCR אני אתר Xho מייד לאחר קודון העצירה של TetR cDNA תוך שימור Xba האתר ב5&#39;end של cDNA. Subclone בר שנוצר לpMigR1 17 באמצעות אנזימי ההגבלה Xba ואני Xho לייצר pMigR1_TetR פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את וקטור pMigR1_TetR עם הגבלת אנזימי Xba ואני מש&quot;ק לשחרר בר TetR_IRES. לבודד את בר 1.25 הק&quot;ג להוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור 4.6 הק&quot;ג pcDNA6/TR ו1.25 ברי kb TetR_IRES. Transform מוצר הקשירה לE.coli המוסמך ולזהות את מבנה pcDNA6_TetR_IRES_blast הרצוי באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולריות סטנדרטיות. </li></ol> 2. הדור של שורות תאי יציבות הבעת TetR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 ביום, זרעי 1x10 6 תאים לכל צלחת תרבית רקמה 10-סנטימטר באמצעות מדיום הגידול הרגיל שלך (למשל DMEM בתוספת 10% FCS). זרעי שתי צלחות, אחת לtransfection עם pcDNA6_TetR_IRES_blast ואחרות כמו שליטה שלילית לבחירת blasticidin. ודא להשתמש מעבר הנמוך ביותר האפשרי ומדיום גידול המומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, transfect צלחת אחת עם 2 מיקרוגרם של pcDNA6_TetR_IRES_blast באמצעות 6 Fugene (E2691, Promega) בעקבות הוראות היצרן. אל transfect הצלחת השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להוסיף מדיום גידול המכיל סטנדרטי blasticidin 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​לשתי הצלחות. שים לב שריכוז הבחירה האופטימלית עשוי להשתנות בהתאם לקו תא נתון ואולי need שייקבע מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, לפצל את התאים ב 1/5, 1/25, 1/50 ו1 / 100 באמצעות צלחות 10-סנטימטר ובינוני צמיחה סטנדרטית המכילים 5 מ&quot;ג / המ&quot;ל blasticidin. הקפד לתייג צלחות המכילות תאי untransfected או transfected כראוי. הכן שתי צלחות לצעד דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו תאים יומיים, ולהבטיח כי כל התאים שעל צלחות untransfected מתו בתוך השבוע הראשון. שינוי תקשורת בחירה כל 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1-2 שבועות, מושבות blasticidin עמידות צריכות להתחיל להופיע. בחר צלחות המכילות 5-50 מושבות כדי להבטיח שמושבות בודדות יכולות להיות הרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהגיעו למושבות בקוטר של כ 5 מ&quot;מ (או גדול), לבודד לפחות 12 שיבוטים עצמאיים באמצעות צילינדרי שיבוט להרים מושבות בודדות. העבר כל שיבוט לתוך באר נפרד מצלחת תרבית רקמה 24 כן. כשמתלכד, לפצל את התאים מכל אחד ואחד גם לתוך היטב של צלחת תרבית רקמה 6-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך CL של התרבותאלה בתקשורת בחירה. כאשר, תאי confluent מפוצל מכל טובה לשתי בארות בודדות של צלחת תרבית רקמה 6-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שיבוט להיבדק, להקפיא באר אחת של תאים ותאי confluent קטיף ובשני לבדיקה הבאה על ידי immunoblotting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי TetR ידי מערב סופג באמצעות נוגדן חד השבטי העכבר אנטי TET02 (MoBiTec GmbH). זכור לכלול lysate של שורת תאים ההוריות כביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 3 שיבוטים עם ביטוי TetR הגבוה ביותר ולהרחיב כל תרבות משובטת. הקפא מניות של כל שיבוט מבטיח בהקדם האפשרי. לבסוף, לבחון את הפרמטרים הביולוגיים המולקולריים ותא של עניין על ידי השוואה בין שורות תאים ההוריות עם שיבוטי TetR מבטאים-. בחר השיבוט &quot;הכי הטוב&quot; עם ביטוי TetR הגבוה ביותר שלא מציג את כל שינויים בפרמטרים הביולוגיים המולקולריים ותא של עניין. </li></ol> 3. בדיקת פיילוט של pTER וPT-Rex DEST30 וקטורים בטאing shRNA או cDNAs, בהתאמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור pTER פלסמיד עם מוסיף shRNA כמתואר 12. לבנות PT-רקס DEST30 וקטור (12301-016, Invitrogen) המכיל cDNA של ריבית באמצעות טכנולוגית Gateway (Invitrogen). במקרה של ביטוי cDNA, תוספת של תג לcDNA יהיה מאוחר להקל זיהוי של חלבון בטא exogenously. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transiently transfect קו תא המטרה ההורית עם pTER או PT-רקס DEST30 פלסמידים (להביע או shRNAs או cDNAs עניין) באמצעות מגיב transfection של בחירה. לבדיקה של פלסמידים ביטוי shRNA, להבטיח יעילות transfection גבוהה יכולה להיות מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר transfected תאים ותהליך לimmunoblotting באמצעות הנוגדנים המתאימים, מצפה לגילוי דלדול או ביטוי יתר של הגן של עניין שלך. </li></ol> 4. דור של שורות תאי יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) ביטוי של shRNAs או cDNAs שימוש pTER או PT-Rex DEST30 וקטורים </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 ביום, 1x10 6 תאי זרע של TetR-להביע השיבוט &#39;הטוב ביותר&#39; לצלחת 10-סנטימטר באמצעות מדיום הגידול הרגיל שלך להשלים עם סרום מוסמך טטרציקלין חינם (לדוגמה מFBS Invitrogen; 16000-014). צלחת זרע אחד לtransfection עם pTER (או PT-רקס DEST30), וצלחת אחת כשליטה שלילית לבחירה כפולה. הקפד להשתמש במעבר הנמוך ביותר האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, transfect צלחת אחת עם 2 מיקרוגרם של pTER (או PT-רקס DEST30) באמצעות 6 Fugene. אל transfect הצלחת השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להוסיף מדיום גידול סטנדרטי המכיל 5 מיקרוגרם / המ&quot;ל blasticidin ו500 מיקרוגרם / המ&quot;ל zeocin (או 1 מ&quot;ג / המ&quot;ל G418). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, לפצל את התאים ב 1/5, 1/25, 1/50 ו1 / 100 באמצעות צלחות 10-סנטימטר ובינוני צמיחה סטנדרטית המכילות 5 מיקרוגרם / המ&quot;ל blasticidin ו500 מיקרוגרם / המ&quot;ל zeocin (או 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל G418). הכן שתי צלחות לצעד דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את התאים יומיים, ולוודא כי בתוך השבוע הראשון כל התאים שעל צלחות untransfected מתו.לשנות את מדיום גידול המכיל blasticidin הסטנדרטי וzeocin (או G418) כל 3-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2-3 שבועות, blasticidin / zeocin (או blasticidin/G418) מושבות כפולות עמידות צריכות להתחיל להופיע. בחר צלחות המכילות 5-50 מושבות להרים מושבות בודדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהגיעו למושבות בקוטר של כ 5 מ&quot;מ (או גדול), השתמש צילינדרי שיבוט להרים מושבות בודדות. מבודד לפחות 24 שיבוטים בודדים. העבר כל שיבוט לתוך באר נפרד מצלחת תרבית רקמה 24 כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוטי תרבות בריכוזי תחזוקה המכילים בינוניים של blasticidin (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) וzeocin (250 מיקרוגרם / מ&quot;ל) [או G418 (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל)]. כשמתלכד, לפצל את התאים מכל אחד ואחד גם לתוך היטב של צלחת תרבית רקמה 6-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שיבוט להיבדק, מתחלק באחד מתלכד היטב של צלחת 6-טובה לשלוש בארות בודדות של צלחת 6-כן. כשמתלכד, להקפיא תאים מטיפוס אחד המוכר היטב. השתמש בשתי הבארות שנותרו לבדיקת tetracyclinביטוי דואר מושרה. הוסף טטרציקלין בריכוז של מיקרוגרם 1 / מ&quot;ל ​​לטיפוס אחד המוכר היטב, תוך השארת טטרציקלין גם השנייה בחינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 24-96 שעות של דגירה עם טטרציקלין, תאי קציר ותהליך לimmunoblotting באמצעות נוגדנים מתאימים. זמני דגירת טטרציקלין קצרים מומלצים כאשר מיון לאינדוקציה של ביטוי cDNA, בעוד טיפולי טטרציקלין ארוכים יותר יהיו צורך לקבוע דלדול shRNA בתיווך של חלבונים אנדוגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר לפחות שני שיבוטים עם הדלדול הרצוי / ביטוי יתר ולהרחיב כל תרבות. הקפא מניות של כל שיבוט מבטיח בהקדם האפשרי. כשגדל ט בשיבוטים לניסויים תמיד הקפד להשתמש באמצעי תקשורת בתוספת סרום טטרציקלין ללא אנטיביוטיקה ואת הבחירה המתאימה בריכוזי תחזוקה. </li></ol>

<ol>
	<li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant.">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li><li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells.">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268, 1766-1769 (1995).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins.">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li><li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3'+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells.">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li><li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNAs+(shRNAs)+induce+sequence-specific+silencing+in+mammalian+cells.">Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.</a> Genes Dev. 16, 948-958 (2002).</li><li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells.">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li><li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells.">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated,+inducible+small-interfering-RNA+vector.">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li><li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation.">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li><li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication.">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li><li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NDR/LATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases.">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li><li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A/MST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis.">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מאמינים כי ט במערכות להקל על הניתוח של תפקוד הגן באופן משמעותי, במיוחד במערכות תא שקשה לתמרן ו / או כאשר גן המניפולציות הוא חיוני להישרדות תא. יתר על כן, היכולת לשלוט על ביטוי גנים על ידי ט במערכות מאוד ספציפיות מציעה את ההזדמנות ללמוד פונקציות גנטיות בשלבים שונים (...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> עוברי בסרום שור (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> בדוק ט החופשי </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invivogen </td><td> נמלה-BL-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invivogen </td><td> נמלי Zn-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> מעבדות Paa </td><td> P31-011 </td><td> 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בתקשורת </td></tr><tr><td> אנטי TET02 </td><td> MoBiTec GmbH </td><td> TET02 </td><td> השתמש ב1 / 1000 עד 1/2000 WB </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> Invitrogen </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> PT-רקס DEST30 </td><td> Invitrogen </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> טטרציקלין </td><td> סיגמא </td><td> 87128 </td><td> 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​באתנול </td></tr><tr><td> דוקסיציקלין </td><td> סיגמא </td><td> D9891 </td><td> 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים </td></tr><tr><td> צילינדרי שיבוט </td><td> Bellco הזכוכית בע&quot;מ </td><td> 2090-00808 </td><td> מחדש שמיש </td></tr></tbody></table>

generation of stable human cell lines with tetracycline-inducible (tet-on) shrna or cdna expression

גישה מרכזית בתחום הביולוגיה של תא יונקת היא המניפולציה של הביטוי של גנים של עניין שורות תאים נבחרות, במטרה לחשוף את אחד או כמה מתפקודו של הגן (ות) באמצעות ביטוי יתר או מציאה חולף / יציב של הגן של עניין. למרבה הצער, לחקירות ביולוגיות תאים שונות גישה זו אינה מתאימה כאשר תוצאת מניפולציות של ביטוי גנים בתאי פגמי צמיחה / שגשוג או התמיינות תאים לא רצויה. לכן, חוקרים התאימו את החלבון המדכא טטרציקלין (TetR), נלקח מE. coli התנגדות טטרציקלין 1 אופרון, לייצר מערכות ויסות יעילות מאוד וחזקות להביע cDNAs בתאי יונקי 2,3. בקיצור, TetR שונתה כדי או (1) ייזום בלוק של שעתוק באמצעות קשירה למפעיל ט (TO) באזור המקדם על תוספת של טטרציקלין (שמכונה מערכה ט הכבוי) או (2) לאגד ל לאהוא היעדר טטרציקלין (מכונה ט במערכת) (איור 1). בהתחשב באי הנוחות שהמערכה ט הפעמי דורשת נוכחות הרציפה של טטרציקלין (שבו יש זמן מחצית חיים של כ 24 שעות במדיום תרבית תאי רקמה) ט במערכת כבר מותאם באופן נרחב יותר, וכתוצאה מכך להתפתחות מאוד הדוק ומערכות וקטור יעילות לביטוי cDNA משמשות כאן. זמן קצר לאחר הקמתה של התערבות RNA (RNAi) למציאת גנים בתאי יונקים 4, וקטורים המבטאים RNAs-מכבנה קצרה (shRNAs) תוארה שפונקציה דומה מאוד לsiRNAs 5-11. עם זאת, גישות מציאת shRNA בתיווך אלה יש להם מגבלה כאסטרטגיות נוקאאוט קונבנציונליות, שכן דלדול יציב הוא לא ריאלי כאשר מטרות גנים הן חיוניות להישרדות תאים. כדי להתגבר על מגבלה זו, ואן דה Wetering et al. שונים 12 shRNA ביטוי וקטור pSUPER 5 </su&gt; P על ידי החדרה לאזור האמרגן, שאפשר להם להפיק שורות תאי יציבות עם דלדול טטרציקלין-מושרה של גני מטרת עניין שלהם. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה להפקה יציבה אדם ט בשורות תאים שיניעו מהימן או ביטוי יתר מושרה או דלדול של הגן של עניין. באמצעות שיטה זו, יש לנו נוצרו בהצלחה ט בשורות תאים אשר הקלו באופן משמעותי על הניתוח של MST / hMOB / NDR המפל בcentrosome 13,14 ואפופטוזיס איתות 15,16. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים הווקטורים של בחירה שלנו, בנוסף לתיאור שני שלבי המניפולציה הרצופים הנדרשים ביעילות כדי ליצור אדם ט בשורות תאים (איור 2). יתר על כן, מלבד מתאר פרוטוקול עבור הדור של אדם ט בשורות תאים, נדונו היבטים קריטיים לגבי הנהלים הטכניים והאפיון של ט בתאים.

דוגמה לאפיון הראשוני של-1 RPE שורות תאי יציבות מבטאות TetR מוצגת באיור 4. שים לב כי כל שיבוטי רשתית-1 מביעים רמות שונות של TetR (השווה נתיבים 2 ו 5), ואילו קו התא ההורי (המשמש כשליטה שלילית) אינו מבטא את חלבון TetR אקסוגני (איור 4, 1 נתיב). וריאציה זו בביטוי TetR בין הר...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression at JoVE.com

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

דרך מהירה ופשוטה ליצירת שורות תאים אנושיות עם מושרה וביטוי יתר הפיך cDNA או shRNA בתיווך עקום למטה של ​​הגן של עניין. שיטה זו מאפשרת לחוקרי שורות תאים ואמינים ביותר reproducibly מניפולציות שקשה לשנות בשיטות transfection חולפות או אסטרטגיות קונבנציונליות מציאה / נוקאאוט.

דור של שורות תאים אנושיות יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) shRNA או ביטוי cDNA

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

generation-stable-human-cell-lines-with-tetracycline-inducible-tet-on

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

35.0K Views.  UCL Cancer Institute. דרך מהירה ופשוטה ליצירת שורות תאים אנושיות עם מושרה וביטוי יתר הפיך cDNA או shRNA בתיווך עקום למטה של ​​הגן של עניין. שיטה זו מאפשרת לחוקרי שורות תאים ואמינים ביותר reproducibly מניפולציות שקשה לשנות בשיטות transfection חולפות או אסטרטגיות קונבנציונליות מציאה / נוקאאוט.

Video: Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts of cell culture, and tend to acquire karyotypic abnormalities with high population doublings.  Proper passaging is essential for maintaining a healthy, undifferentiated, karyotypically normal HuES human embryonic stem cell culture.  First, an expanding culture is washed in PBS to remove residual media and cell debris, then cells are overlaid with a minimal volume of warm 0.05% Trypsin-EDTA.  Trypsin is left on the cells for up to five minutes, then cells are gently dislodged with a 2mL serological pipette.  The cell suspension is collected and mixed with a large volume of HuES media, then cells are collected by gentle centrifugation.  The inactivated trypsin media mixture is removed, and cells resuspended in pre-warmed HuES media.  An appropriate split ratio is calculated (generally 1:10 to 1:20), and cells re-plated onto a 1-2 day old plate containing a monolayer of irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells.  The newly seeded HuES culture plate is left undisturbed for 48 hrs, then media is changed every day thereafter.  It is important not to trpsinize down to a single cell suspension, as this increases the risk of introducing karyotypic abnormalities.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin. Brought to you by JoVE.

גוונים Passaging האדם עובריים לתאי גזע קווי עם טריפסין

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

התמרה של תאים אנושיים עם Lentivirus פולימר-ומורכבת Ecotropic עבור Enhanced biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.