我々は有用な議論のために、我々の研究室のすべてのメンバーに感謝。我々は、原稿の読み取りのために重要なジョアンナLisztwanとクリスティーナGewinnerに感謝します。この作品は、BBSRC助成BB/I021248/1とウェルカムトラスト助成090090/Z/09/ZAHによってサポートされていましたUCLのがん研究所でウェルカムトラスト·リサーチ·キャリア開発仲間です。

1。 pcDNA6_TetR_IRES_blastのクローニング<ol><li> 図3に示すように、私はTetRを遺伝子とブラストサイジン耐性（BlastR）遺伝子のプロモーターを除去するために、制限酵素 XbaIとNCOとプラスミドpcDNA6/TRの部分ダイジェスト（V1025-20、Invitrogen）を実行します。 4.6kbのベクター断片を分離します。 </li><li> TetRを遺伝子からポリアデニル化配列を削除するには、すぐに、cDNAの5 &#39;末端に節約XbaI部位間のcDNA TetRのストップコドンの後、PCRによりXhoI部位をご紹介します。サブクローンプラスミドpMigR1_TetRを生成するために、制限酵素 XbaI 及び XhoIを用いてpMigR1 17に得られた断片。 </li><li>私はTetR_IRESの断片を放出するために、制限酵素 XbaIとNCOとpMigR1_TetRベクトルを消化。 1.25キロバイトの挿入断片を分離します。 </li><li> 4.6キロバイトpcDNA6/TRと1.25キロバイトTetR_IRESフラグメントをライゲーションする。 TR有能なE.coliにライゲーション産物をansformと標準的な分子生物学的技術を用いて、所望のpcDNA6_TetR_IRES_blastコンストラクトを識別します。 </li></ol> 2。安定的TetRを発現する細胞株の生成<ol><li> 1日目、シード標準の成長培地（ 例えば、DMEM、10％FCSを補充した）を使用して、10cmの組織培養プレートあたり1×10 6細胞。シード2プレート、pcDNA6_TetR_IRES_blastを用いたトランスフェクションのためのもの、とブラストの選択のための陰性対照として他のを。可能な限り低い通路と推奨成長培地を使用することを確認します。 </li><li> 2日目に、製造元の指示に従ってFUGENE 6（E2691、Promega）を用いてpcDNA6_TetR_IRES_blast2μgのトランスフェクションと1プレート。第二のプレートをトランスフェクトしないでください。 </li><li> 3日目に、両方のプレートに5μg/ mlのブラストサイジンを含む標準的な増殖培地を追加します。最適な選択濃度が与えられた細胞株ごとに異なり、そしてnかもしれない場合がありますのでご了承くださいあらかじめ決定されてEED。 </li><li> 4日目に、10cmのプレートと5 mg / mlのブラストサイジンを含む標準的な増殖培地を用いて1/50、1/100、1/25、1/5でセルを分割する。正しく非トランスフェクトまたはトランスフェクトされた細胞を含むプレートにラベルを付けていることを確認してください。希釈段階ごとに2つのプレートを準備します。 </li><li>トランスフェクトされていないプレート上のすべてのセルが1週間以内に死亡していることを確認し、毎日の細胞をチェックしてください。 2〜3日ごとに選択培地を変更します。 </li><li> 1-2週間後、ブラストサイジン耐性コロニーが現れ始めるべきである。シングルコロニーをピックアップすることができることを保証するために5から50コロニーを含むプレートを選択します。 </li><li>コロニーは約5mm（またはより大きい）の直径に達したときは、シングルコロニーをピックアップするクローニングシリンダを使用して少なくとも12の独立したクローンを分離する。 24ウェル組織培養プレートの別々のウェルに各クローンを転送します。ときに合流、6ウェル組織培養プレートのウェル1つ1つに、各ウェルから細胞を分割します。 </li><li>文化CLに続ける選択培地のもの。 6ウェル組織培養プレートの2つの単一のウェルに各ウェルからすると合流、分割細胞。 </li><li>各クローンがテストされるためには、免疫ブロット法によるその後のテストのために他の井の中のコンフルエントの細胞と細胞の収穫だけでなく1を凍結。 </li><li>西洋は、マウスモノクローナル抗TET02抗体（MoBiTec GmbH）を用いてブロッティングによりTetRを検出します。陰性対照として親細胞株のライセートを含めることを忘れないでください。 </li><li>最高TetRを式を使って3つのクローンを選択し、各クローン培養を展開します。できるだけ早く各クローンの有望株を凍結。最後に、TetRを発現クローンと親細胞株を比較することにより、目的の分子および細胞生物学的パラメータを調べます。興味のある分子細胞生物学的パラメーターに変更を加える場合には表示されません最高TetRを発現と &#39;最高&#39;クローンを選択します。 </li></ol> 3。 pTERとPT-レックスのパイロットテストDEST30ベクトルエクスプレスそれぞれるshRNAまたはcDNAは、 <ol><li> 12に記載されているようにするshRNAインサートとプラスミドpTERを生成します。 PT-レックスDEST30ベクトル（12301から016、インビトロジェン）ゲートウェイ技術（Invitrogen）を用いて、目的のcDNAを含むを構築します。 cDNA発現の場合には、cDNAへのタグの追加は後で外因的に発現されたタンパク質の検出を容易にするでしょう。 </li><li>一過性の選択のトランスフェクション試薬を用いpTERまたはPT-レックスDEST30プラスミド（shRNAのや目的のcDNAのいずれかを発現する）を持つ親の標的細胞系をトランスフェクト。 shRNA発現プラスミドのテストのために、高いトランスフェクション効率を達成することができることを確認してください。 </li><li>収穫は、目的の遺伝子の枯渇または過剰発現を検出するために期待して、適切な抗体を用いたイムノブロッティング用の細胞およびプロセスをトランスフェクションした。 </li></ol> 4。テトラサイクリン誘導性（テトオン）pTERまたはPT-レックスDEST30ベクトルを用いたshRNAまたはcDNAの発現で安定細胞株の作製</p&gt; <ol><li> 1日目、シード認定テトラサイクリン無血清（例えばInvitrogenからFB用、16000から014）を補充したあなたの標準的な増殖培地を用いて10 cmのプレートあたり&#39;最高&#39; TetRを発現クローンの1×10 6細胞。 pTER（またはPT-レックスDEST30）、二重選択のための陰性対照として、一枚の板を用いたトランスフェクションのための種1プレ​​ート。可能な限り低い通路を使用してください。 </li><li> 2日目に、トランスフェフェクション6を使用してpTER2μgの（またはPT-レックスDEST30）と1プレート。第二のプレートをトランスフェクトしないでください。 </li><li> 3日目、5μg/ mlのブラストおよび500μg/ mlのゼオシン（または1 mg / mlのG418）を含む標準培地を追加します。 </li><li> 4日目、5μg/ mlのブラストおよび500μg/ mlのゼオシン（または1 mg / mlの含む10cmのプレートと標準的な増殖培地を用いて1/50、1/100、1/25、1/5でセルを分割するG418）。希釈段階ごとに2つのプレートを準備します。 </li><li> 1週間以内にトランスフェクトしていないプレート上の全ての細胞が死亡していることを確認しながら、毎日の細胞をチェックしてください。3〜4日ごとにブラストとゼオシン（またはG418）を含む標準培地を変更します。 </li><li> 2-3週間後、ブラストサイジン/ゼオシン（またはblasticidin/G418）二重耐性コロニーが現れ始めるべきである。シングルコロニーをピックアップし5から50コロニーを含むプレートを選択します。 </li><li>コロニーは約5mm（またはより大きい）の直径に達したときは、シングルコロニーをピックアップしクローニングシリンダーを使用しています。少なくとも24個々のクローンを単離する。 24ウェル組織培養プレートの別々のウェルに各クローンを転送します。 </li><li>ブラストサイジン（5μg/ ml）をとゼオシン（250μg/ ml）を含む培地メンテナンス濃度の培養クローン[またはG418（0.5 mg / ml）を]。ときに合流、6ウェル組織培養プレートのウェル1つ1つに、各ウェルから細胞を分割します。 </li><li>各クローンがテストされるためには、6ウェルプレートの3つの単一のウェルに6ウェルプレートの1がコンフルエントに分割。コンフルエント時、よく1から細胞を凍結。テトラサイクリンをテストするために、残りの2ウェルを使用電子誘導発現。無料第2ウェルテトラサイクリンを残しながら、よく1〜1μg/ mlの濃度でテトラサイクリンを追加します。 </li><li>適切な抗体を用いたイムノブロッティング用のテトラサイクリン、収穫細胞やプロセスとのインキュベーションの24から96時間後。 cDNA発現の誘導のためにスクリーニングする際に長くテトラサイクリン治療が内因性タンパク質のshRNA媒介枯渇を決定することが必要になりますしながら短いテトラサイクリンのインキュベーション時間は、推奨されています。 </li><li>希望の枯渇/過剰発現を有する少なくとも2つのクローンを選択し、それぞれの文化を展開します。できるだけ早く各クローンの有望株を凍結。実験用クローンのTet-に生育する場合は必ずテトラサイクリン無血清およびメンテナンス濃度で各選択抗生物質を添加した培地を使用してください。 </li></ol>

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	<li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant.">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li><li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells.">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268, 1766-1769 (1995).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. 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Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li><li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells.">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication.">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li><li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NDR/LATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases.">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li><li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A/MST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis.">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々はテトオンシステムが大幅に特に操作遺伝子は細胞の生存に必須であるときに操作および/またはすることが困難である細胞系において、遺伝子機能の解析を容易にすると信じています。さらに、高度に特異的なテトオンシステムによって遺伝子発現を制御する能力は、様々な段階（細胞周期の進行や、明確に定義された分化プロセス中など）で遺伝子の機能を研究する機会を提供してい...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 16000-044 </td><td>テストされたテトフリー</td></tr><tr><td>ブラストサイジン</td><td> Invivogen </td><td> ANT-BL-1 </td><td></td></tr><tr><td>ゼオシン</td><td> Invivogen </td><td> ANT-Zn系5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> PAAラボラトリーズ</td><td> P31-011 </td><td>メディアでは100 mg / mlの</td></tr><tr><td>抗TET02 </td><td> MoBiTec社</td><td> TET02 </td><td> WBのための1/1000〜1/2000に使用</td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td>インビトロジェン</td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> PT-レックスDEST30 </td><td>インビトロジェン</td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>シグマ</td><td> 87128 </td><td>エタノールで2 mg / mlの</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>シグマ</td><td> D9891 </td><td>水中で2 mg / mlの</td></tr><tr><td>クローニングシリンダー</td><td>ベルコグラス株式会社</td><td> 2090から00808 </td><td>再利用可能な</td></tr></tbody></table>

generation of stable human cell lines with tetracycline-inducible (tet-on) shrna or cdna expression

哺乳類の細胞生物学の分野での主要なアプローチは、遺伝子の安定/一過性過剰発現またはノックダウンを使用して、1つ以上の遺伝子の機能のいくつか（複数可）を明らかにする目的で、選択された細胞株において、目的の遺伝子の発現の操作です興味のある。残念なことに、様々な細胞生物学的研究のためにこのアプローチは、細胞の成長/増殖欠陥や不要な細胞分化における遺伝子発現結果の不適切な操作です。したがって、研究者は、 大腸菌から取らテトラサイクリンリプレッサータンパク質（TetRを）、適応している大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロン1、2,3、哺乳動物細胞でのcDNAを表現するために非常に効率的かつタイトな規制制度を生成する。要するに、TetRをINにするテトラサイクリン（Tet-オフシステムと呼ばれる）を添加した際のプロモーター領域におけるテト - オペレーター（TO）に結合すること、または（2）に結合することにより転写のブロック（1）開始のいずれかに変更されましたトンテトラサイクリンの彼が不在（システムテトオンと呼ばれる）（ 図1）。テトオフシステムは非常にタイトなの開発で、その結果、テトラサイクリンの連続的な存在（組織細胞培養培地中で約24時間の半減期を持っている）テトオンシステムがより広範囲に最適化されているが必要であることを不便与えとcDNA発現のための効率的なベクター系は、ここで使用される。 まもなく、哺乳動物細胞における4遺伝子ノックダウンのためのRNA干渉（RNAi）の設立後、ショートヘアピンRNA（shRNA）を発現ベクターは、siRNAは5月11日と非常によく似て、その関数を記述した。遺伝子標的は、細胞の生存に必須であるときに安定枯渇が現実的ではありませんので、しかし、これらのshRNAによるノックダウンのアプローチは、従来のノックアウト戦略と同じ制限があります。この制限を克服するために、バン·デ·ウェテリンクらは12のshRNA発現ベクターpSUPER 5変更 </suP&gt;彼らが興味のある標的遺伝子のテトラサイクリン誘導性の枯渇との安定した細胞株を生成する場合に有効にプロモーター領域、INに挿入することによって。 ここでは、効率的に安定した人間テトオンを生成するために、確実に目的の遺伝子の過剰発現誘導または枯渇のどちらかを駆動する細胞株の方法を説明します。この方法を使用すると、我々は正常に生成したテトオン著しく中心体13,14と15,16シグナリングアポトーシスのMST / hMOB / NDRカスケードの解析を容易にした細胞株。本稿では、選択した私たちのベクトルを記述し、効率的に生成するために必要な2つの連続した操作手順を記述することに加えて、人間テトオン細胞株（ 図2）。さらに、ヒトテトオン細胞株を樹立するためのプロトコルを概説に加えて、我々は技術的な手順およびTet-上の細胞の特性に関する重要な側面について説明します。

安定TetRを発現し、RPE-1細胞株の初期特性の例を図4に示します。親細胞ラインは（ネガティブコントロールとしても機能します）外因TetRタンパク質を発現しない間、すべてのRPE-1クローンは（ 図4、レーン1）、（レーン2および5を比較）TetRのレベルを変えることで表現することに注意してください。発現プラスミドTetRの発現プラスミドの組込み部位に大きく依存して?...

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Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

誘導性と目的の遺伝子のcDNAを過剰発現可逆またはshRNA媒介ノックダウンしたヒト細胞株を生成するために迅速かつ簡単な方法です。この方法は、確実に研究を可能にし、高度な再現性一過性トランスフェクションの方法または従来のノックダウン/ノックアウト戦略によって変更することは困難である細胞株を操作します。

テトラサイクリン誘導性（テトオン）shRNAまたはcDNA発現で安定ヒト細胞株の世代

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

generation-stable-human-cell-lines-with-tetracycline-inducible-tet-on

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

35.0K ビュー.  UCL Cancer Institute. 誘導性と目的の遺伝子のcDNAを過剰発現可逆またはshRNA媒介ノックダウンしたヒト細胞株を生成するために迅速かつ簡単な方法です。この方法は、確実に研究を可能にし、高度な再現性一過性トランスフェクションの方法または従来のノックダウン/ノックアウト戦略によって変更することは困難である細胞株を操作します。

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Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts of cell culture, and tend to acquire karyotypic abnormalities with high population doublings.  Proper passaging is essential for maintaining a healthy, undifferentiated, karyotypically normal HuES human embryonic stem cell culture.  First, an expanding culture is washed in PBS to remove residual media and cell debris, then cells are overlaid with a minimal volume of warm 0.05% Trypsin-EDTA.  Trypsin is left on the cells for up to five minutes, then cells are gently dislodged with a 2mL serological pipette.  The cell suspension is collected and mixed with a large volume of HuES media, then cells are collected by gentle centrifugation.  The inactivated trypsin media mixture is removed, and cells resuspended in pre-warmed HuES media.  An appropriate split ratio is calculated (generally 1:10 to 1:20), and cells re-plated onto a 1-2 day old plate containing a monolayer of irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells.  The newly seeded HuES culture plate is left undisturbed for 48 hrs, then media is changed every day thereafter.  It is important not to trpsinize down to a single cell suspension, as this increases the risk of introducing karyotypic abnormalities.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin. Brought to you by JoVE.

トリプシンで継代色合いヒト胚性幹細胞、線

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

生物学

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

ヒトCD40活性化B細胞の生成

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

遺伝子発現解析のための胚ゼブラフィッシュとcDNA合成からのRNA分離

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

強化されたバイオセーフティのためのポリマー複合エコトロピックレンチウイルスによるヒト細胞のトランスダクション

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.