עיכול תלוי DNAzyme היא שיטה שימושית ללימוד פונקציות של snoRNAs. זוהי שיטה מהירה ופשוטה לנתח מתילציה RNA ספציפית לאתר. זה דורש אוליגונוקלאוטיד DNA קצר וריג'נטים בסיסיים נוכחים בכל מעבדה ביולוגית מולקולרית.
התחל בתכנון DNAzyme עבור רצף העניין. מצא את רצף ה- RNA או אתר מתילציה putative באמצעות מסד נתונים מתאים. עבור מטרות S.cerevisiae snoRNA, השתמש במסד הנתונים snoRNA שמרים.
כדי למצוא אתר מתילציה מעניין, לדוגמה, אתר תלוי snR13, בחר snR13 וציין את המיקום של הנוקלאוטיד שהשתנה. מצא את הרצף במעלה ובמורד הזרם של הנוקלאוטיד שהשתנה באמצעות מסד נתונים מתאים, כגון מסד הנתונים הגנום Saccharomyces. חפש את שם גן המטרה.
אם אתם משתמשים ב- DNAzyme של 10 עד 23, בחר 10 עד 15 נוקלאוטידים במעלה הזרם ובמורד הזרם של אתר המתילציה. אם אתה משתמש ב- DNAzyme 8-17, בחר 20 נוקלאוטידים. צרו רצפים משלימים של הזרועות של חמשת הפריימים ושלושת הפריימים ולהשתמש בהם כדי לאגף את הרצף הקטליטי DNAzyme על שלושת הפריימים וחמשת הקצוות.
להזמין את DNAzyme כמו אוליגונוקלאוטיד DNA נורמלי. לגדל זני שמרים של עניין בינוני מתאים ותנאים. כאשר התאים מגיעים לשלב המעריכי האמצעי, גלולה אותם על ידי צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים g במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את המדיום.
המשך בבידוד RNA בהתאם לכיווני כתב היד. לאחר מכן, תן שימוש חוזר גלולת RNA ב 30 microliters של RNase ומים ללא DNase. מניחים את הצינור על קרח ומודדים את ריכוז הרנ"א על מיקרו-פקטרופוטומטר.
כדי לבצע עיכול DNAzyme באמצעות 10 עד 23 DNAzyme, להכין תערובת דגירה עם חמישה מיקרוגרם של RNA, 200 picomoles של 10 עד 23 DNAzyme, ו אחד-X 10 כדי 23 מאגר דגירה בנפח כולל של 10 microliters. לאחר מכן, הדגירה את הצינורות על בלוק חום יבש להגדיר 95 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. מיד לאחר מכן, מניחים את הצינורות על קרח ומשאירים אותם שם במשך חמש דקות.
לזמן קצר לסובב את הצינורות ולשים אותם בחזרה על קרח. מוסיפים 20 יחידות של מעכב RNase ומ מניחים את הצינורות על בלוק חום יבש להגדיר 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בינתיים, הכינו תערובת תגובה על ידי שילוב של חמישה מיקרוליטרים של חיץ תגובה של 4-X 10 עד 23 עם ארבעה מיקרוליטרים של מגנזיום כלוריד 300 טוחן ומים מיקרוליטריים אחד.
מחממים את תערובת התגובה על בלוק חום יבש שנקבע ל-37 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינור עם תערובת הדגירה על בלוק החום היבש של 37 מעלות צלזיוס ומוסיפים 10 מיקרוליטרים של תערובת התגובה לפני המלחמה. הדגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ולאחר מכן, מניחים את הצינור על קרח.
כדי לבצע עיכול DNAzyme באמצעות DNAzyme 8-17, להכין microtube 1.5 מיליליטר עם חמישה מיקרוגרם של RNA בנפח כולל של שישה microliters. לאחר מכן, להכין צינור נפרד עם 400 picomoles של 8-17 DNAzyme. בזמן העבודה, לשמור את שני הצינורות על קרח.
מעבירים את שני הצינורות לגוש חום יבש המוגדר ל-95 מעלות צלזיוס ומטמירים אותם במשך שתי דקות. להזיז את דגימת RNA בחזרה על קרח ולסובב במורד הצינור עם DNAzyme במשך חמש שניות. הדגירה DNAzyme ב 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
בזמן שה-DNAzyme דגירה, הכינו 10 מירקוליטרים של חיץ תגובה של 2-X 8-17 וקדומו אותו ל-25 מעלות צלזיוס. מוסיפים את המאגר מראש לצינור עם DNAzyme ולאחר מכן, להעביר 14 microliters של תערובת תגובה זו לצינור עם RNA, יחד עם 20 יחידות של מעכב RNase. הדגירה את התגובה ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ולאחר מכן, מניחים את הצינור על קרח.
כדי לטהר את ה-RNA לאחר עיכול DNAzyme, הוסיפו 350 מיקרוליטרים של מים ו-400 מיקרוליטרים של כלורופורם לצינור התגובה. וורטקס למשך 30 שניות וצנטריפוגה ב-20,000 פעמים למשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, להעביר את השלב העליון לצינור חדש המכיל אתנול מיליליטר אחד, 40 microliters של אצטט אמוניום טוחנת 7.5, ומיקרוליטר אחד של גליקוגן.
הפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב ותגרה גם שלילי 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים או שלילי 20 מעלות צלזיוס לילה. המשך עם טיהור RNA על פי הוראות כתב היד ולאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת RNA ב 10 microliters RNase ומים ללא DNase. מניחים את צינור RNA על קרח מיד לאחר הטיהור.
כדי לבצע אלקטרופורזה RNA, להתחיל על ידי המסת 1.5 גרם של אגרוז ב 127.5 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים על ידי חימום התערובת במיקרוגל. לאחר מכן, להוסיף 15 מיליליטר של 10X MOPS ו 7.5 מיליליטר של 37% פורמלדהיד לפתרון אגרוז. מוסיפים כמות מתאימה של כתם ג'ל לפתרון אגרוז.
יוצקים את ההתעוררות לתוך המגש ולתת לו להתקרר במשך 45 דקות. הכינו את דגימות ה-RNA על ידי שילוב של 10 מיקרוליטרים של ה-RNA המתעכל והמטוהר עם חמישה מיקרוליטרים של חיץ denaturing מדגם ו 0.5 microliters של צבע טעינה שישה X. דגירה הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאחר מכן, על קרח במשך חמש דקות.
מכניסים את הג'ל המוכן למיכל האלקטרופורזה וממלאים את המיכל במאגר MOPS אחד- X. טוענים את כל 15 המיקרוליטרים של הדגימה על הג'ל ו מפעילים את הג'ל ב-80 וולט עד שכחול ברומותימול מגיע ל-2/3 מאורך הג'ל. לנתח את הג'ל עם התמונה המתאימה.
הערך של טכניקה זו ניתן להדגים על מערכת שעתוק snoRNA בלתי ניתנת לחיסון. החדרת מקדם GAL1 בלתי ניתן לאכילה במעלה הזרם של גנים snR13 או snR47 מאפשר ניתוח של מתילציה תלוית snoRNA של RNA ריבוזומלי 25S. כאשר התאים גדלים על גלקטוז, RNA ריבוזומלי 25S הוא מתילציה באתרים מונחים snoRNA ונשאר שלם לאחר טיפול DNAzyme.
לעומת זאת, כאשר ביטוי snoRNA כבוי בשל חוסר גלקטוז, מחשוף תלוי DNAzyme מתרחשת. יתר על כן, אין עיכול RNA נצפתה בפקדים מסוג פראי מאז ביטוי snoRNA הוא גלקטוז עצמאי. הפעילות של המחשוף תלוי DNAzyme בניתוח של שינויים rRNA שלנו הוכח לאחרונה בהקשר של התבגרות snoRNA.
ההתמדה תלוית DNAzyme שימשה כדי להראות כי חוסר עיבוד חמישה ראש טרום snoRNA משפיע על רמות מתילציה של 25S ו 18S rRNA ב Saccharomyces cerevisiae. פרוטוקול זה דורש שימוש פנול וכלורופורם, שהם רעילים, ויש לטפל תחת מכסה המנוע אדים.
