אנחנו מאוד מודים לד&quot;ר סינדי נ &#39;צ&#39;יו לעזרה עם ג&#39;ל אלקטרופורזה, ואנדי ג&#39;ואו ומיכאל Grodick לתרומתם הנדיבה של DNA ואנזים הגבלה. אנו בתודה להכיר פרופ &#39;ג&#39; הית &#39;ופרופ&#39; ד &#39;מגשש לגישה נדיבה לציוד וחומרים. אנו מודים לד&quot;ר Karn Sorasaenee להצעות מועילות. אנו מודים מרי H. טאנג ליצירת האיור משמש בסקירה סכמטית בווידאו. מימון ניתן על ידי ג&#39;ונסון אנד ג&#39;ונסון וUSC Y86786.

הערה: כאשר עובד עם RNA לשמור על סביבת עבודה נקייה, כדי למנוע זיהום על ידי אנזימי DNase וRNase שלבזות DNA ו- RNA. ודא שטיפי פיפטה וצינורות הם DNase וRNase חופשי. כמו כן הוא מועיל כדי לנגב את משטחי מעבדה וציוד כגון טפטפות, מחזיקי צינור, וכו &#39;עם פתרון טיהור. 1. RNA תמלול עם טיפול Corrole <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את corrole ומעכב תרכובות ב0.01: 1 יחס טוחנת של [מורכב]: [DNA]. הערה: במקרה שלנו, היחס היה 4.3 מורכב fmol: 0.43 DNA pmol, שבו תבנית ה- DNA משמשת הייתה וקטור APET-28C עם גן Liga מE. coli תחת שליטה של אמרגן T7. DNA אחר עם אמרגן T7 גם מועמדים בתוקף להפעלת assay השעתוק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר actinomycin D, triptolide, tpfc, וGa (tpfc) בsulfoxide דימתיל (DMSO) במיכלים נקיים, נפרדים. השג את הריכוז הסופי של 0.01: 1 יחס טוחנת של [גomplex]: DNA [] ​​על ידי שימוש בדילולי סדרתי עם מים nuclease חינם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 1 מ&quot;ג actinomycin D ב1.8 מיליליטר DMSO. Aliquot 10 μl למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/100. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000. הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של actinomycin D הוא 4.3 fmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר triptolide 1 מ&quot;ג ב0.64 מיליליטר DMSO. Aliquot 1 μl למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000 שני. הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של triptolide היא 4.3 fmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר tpfc 1 מ&quot;ג ב2.9 מיליליטר DMSO. Aliquot 10 μl למכל נפרד ולדלל את מיליליטר 1 עם מים nuclease חינם כדי ליצור ד 1/100ilution. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000. הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של tpfc היא 4.3 fmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר מ&quot;ג Ga 1 (tpfc) 2.6 מיליליטר DMSO. Aliquot 10 μl למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/100. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000. הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של Ga (tpfc) היא 4.3 fmol. הערה: corroles ומעכבים אלה אינם מסיסים במים ולקבל מראש את מומס DMSO. כמויות קטנות של DMSO (מתחת ל -1%) לא לגרום cytotoxicity בתאים (נתונים שלא פורסמו). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת תגובת השעתוק, להכין את חומרים כימיים הנחוצים בנפרד או לרכוש אותם מספק מסחרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה על קרח כל קפאריאגנטים n (עיינו בטבלת 1 לרשימה של חומרים כימיים קפוא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תגובת המאגר 10x וribonucleotide 4 (ATP, CTP, GTP, וUTP) זמן פתרונות לערבב עד שהם נמסו לגמרי בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה צנטריפוגות כל ריאגנטים על מנת למנוע אובדן של חומר על השפה של הצינור. ברגע שהפשיר, ribonucleotides חנות על קרח, תוך שמירה על 10x תגובת הצפת בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב ריאגנטים עבור תגובת שעתוק בRT (ראה טבלה 2 לרשימה של חומרים כימיים). הערה: spermidine ב10x תגובת הצפת יכולה coprecipitate תבנית ה- DNA אם התגובה מורכבת על קרח ולא על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי מצליף הצינור או pipetting מעלה ומטה בעדינות את התערובת. לאחר הערבוב, בקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף תערובת תגובה בתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 כולל של משאבי אנוש. הערה: זמני התגובה הנדרשים ישתנועם גודל תבנית ה- DNA ורצף. צעד זה עשוי לדרוש אופטימיזציה לרצפים ספציפיים. תבניות קצרות יותר עשויות לדרוש זמני תגובה ארוכים יותר לתשואה גבוהה של רנ&quot;א הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 4 aliquots μl מכל תגובה לאחר כל שעה ולאחסן ב -20 ° C. לשנות בהתאם לצורך לנקודתי זמן רצוי. </li></ol></li></ol> טור ספין 2. RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות תגובת השעתוק, לטהר את RNA באמצעות עמודות כרומטוגרפיה microcentrifuge תואם. הערה:. שימוש בעמודות ספין RNA לטהר RNA עם יותר מ -20 תוצאות בסיסים בהתאוששות גדולה יותר מ -80% 44 הערה: כרומטוגרפיה טור היא שיטה נפוצה ונוחה לטיהור RNA. שיטות טיהור אחרות גם קיימות כגון משקעים ליתיום כלורי, פנול: מיצוי כלורופורם, משקעים isopropanol, כמו גם ערכות זמינות מסחרי אחרות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן שווה resuspend מטריצת Sephadex במאגר העמודה על ידי מרץ היפוךטור שלוש פעמים או יותר. עושה זאת על ידי מצליף את הטור בצורה חדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה העליון מהעמודה. תהיה כמה מטריצת Sephadex שייר בכובע; אם הכובע מלא המטריצה, להחליף את הכובע על הטור וחזור על השלב הקודם עד שרוב המטריצה ​​הוא בעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד מחוץ לקצה התחתון של העמודה. הערה: נוזל מסוימים עשוי לברוח מהטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לארוז את הטור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עמודת סטרילי (RNase וDNase חינם) צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות הצינור בצנטריפוגה שולחן XG ב 1000 דקות 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ eluted מהעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד מניח את הטור בצינור microcentrifuge חדש סטרילי 1.5 מיליליטר ו פיפטה המדגם למרכז מיטת העמודה. השתמש 20-50 μl של מדגם, כדי למנוע עומס יתר על העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות הצינור בצנטריפוגה שולחן XG ב 10001 דקות. הערה: eluent הוא מדגם RNA המטוהר. </li></ol></li></ol> 3. Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה (1% Agarose ג&#39;ל) 42 הערה: ברומיד Ethidium מאיר על מחייב את ה- DNA ו- RNA, ולכן ניתן דמיין מולקולות ביולוגיות אלה עם אור UV על ידי דוגריהם עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד פתרון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1,000x המניה במתיל ethidium (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר) על ידי המסת 5 מ&quot;ג ethidium ברומיד ב 10 מיליליטר של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טריס Acetate EDTA (טה) חיץ ריצה לג&#39;ל אלקטרופורזה. כדי להפוך חיץ 50x טה לשלב 2.0 M טריס-אצטט עם 0.05 חומצת M Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ולהתאים את ה- pH ל 8.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל agarose 1% (משקל / נפח) על ידי המסת 10 גרם ultrapure Agarose ב 1 L 1x טה חיץ והמסת agarose עם תנור מיקרוגל קונבנציונלי. ברגע שזה מתקרר ל -50 מעלות צלזיוס, להוסיף 1 מיליליטר של 1,000x ethidium ברומיד ל1% solu ג&#39;ל agarosetion, לערבב בעדינות על ידי מתערבלים או על ידי היפוך במכל סגור, ואז לשפוך את פתרון agarose לפלטפורמת הליהוק ג&#39;ל ולאפשר ג&#39;ל לבסס על RT. הערה: ברומיד Ethidium הוא mutagen ומסרטן פוטנציאלי. ללבוש כפפות ולטפל פתרונות בזהירות. לנוהלי טיפול הנאותים במתיל ethidium, ראה: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;ל יש הקרושה, למקם את הג&#39;ל הסט במכל אלקטרופורזה. הוסף חוצץ TAE מספיק כדי לכסות את הג&#39;ל עד הבארות שקועות. בדוק שהרמה של חיץ טה היא כ 1 מ&quot;מ מעל לרמה של ג&#39;ל. הסר את מסרק ג&#39;ל. הערה: הסרת מסרק לאחר הבארות שקועות מונעת כיסי אוויר מלהילכד בבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את דגימות RNA. לשלב 1 μl של כל aliquot מדגם המטוהר עם טעינת ג&#39;ל μl 1 Buffer (או עם 1 μl 10x חיץ הטעינה וdiluted עד 10 μl עם מים nuclease חינם) ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה עם micropipette. הערה: מאגר טעינת 10x מכיל 20% Ficoll 400, 0.1 מ &#39;Na 2 EDTA, pH 8.0, 1.0% SDS, bromophenol 0.25% כחולים. 0.25% cyanol קסילן גם ניתן להוסיף למאגר הטעינה, כפי שהוא פועל ~ 50% מהר ככל bromophenol הכחול ויכול להיות שימושי עבור ניטור ריצות ארוכות מאוד. 42 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הג&#39;ל עם כל דגימה על ידי pipetting בזהירות את הפתרון לחלק התחתון של כל טוב. הקפד לא להשאיר את כל בועות אוויר או לערבב דגימות בין בארות. הערה: גם סולם RNA יכול לשמש כדי לקבוע את גודלו של התמליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המוביל, כך שה- DNA יהיה להעביר לתוך הג&#39;ל לכיוון להוביל החיובי. הגדר את המתח לרמה הרצויה, בדרך כלל 1-10 V / סנטימטר של ג&#39;ל. הפעל את הג&#39;ל לכמה זמן מספיק להפרדה משמעותית בין שברי RNA, באמצעות ההגירה של צבעים כדי לפקח על ההתקדמות של ההפרדה. NOTE: x 25 סנטימטר ג&#39;ל 23 סנטימטר ב 250 V ייקח כ 1 שעות, בעוד סנטימטר 8 x 8 סנטימטר ג&#39;ל ב -150 V ייקח כ 20 דקות. יש שברי RNA קטנים יותר רזולוציה טובה יותר כאשר לרוץ במתח גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את אספקת החשמל כאשר הצבע ממאגר הטעינה הגר מרחק להישפט מספיק להפרדה בין שברי RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת RNA תחת אור UV כרומיד ethidium יהיה לזרוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה של התמונה ולהשוות עוצמות הקרינה של RNA המטוהר מכל מצב. </li></ol> 4. RNA כימות באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 μl H 2 O על NanoDrop 2000, או מכונה דומה, ולמדוד את ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, מקום 2 μl של כל דגימת RNA, הבא טיהור, על ספקטרופוטומטר ולמדוד UV-Vis מטווח אורכי גל של 200 ננומטר ל -800 ננומטר. הערה: קריאת 260 של 1.0 היא שווה ערך לכ -40 מיקרוגרם / מיליליטר של RNA,וRNA הטהור יש 260/280 יחס של 2.1. 45 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה ספיגה כי הוא מעל 1 OD, לדלל את הדגימות במי nuclease ללא להשיג OD פחות מ 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת גרפים עלילת הדגימות השונות ולהשוות OD ב 260 ננומטר. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

assay זה מוכיח כי התוספת של Ga (tpfc) מעכבת שעתוק RNA דומה ל- המתחמים נגד הסרטן מחייב DNA הידוע actinomycin D וtriptolide. ציטוטוקסיות ההתנהגות של Ga (tpfc) (GI 50 = 58.1-154.7 מיקרומטר) עשויה בשל המאפיינים המעכבים שלה. מאחר שלא עיכוב שעתוק נצפה בtpfc, cytotoxicity של tpfc היא לא בשל עיכוב שעתוק RNA אבל נגרמת...

כימותרפיה כרוכה לעתים קרובות סוכנים ציטוטוקסיות ספקטרום רחב עם תופעות לוואי לא רצויים ומיקוד מוגבל, אך עם הבנה טובה יותר של ביולוגיה של הסרטן, יש ביקוש הולך וגובר לסוכנים אנטי-סרטניים ביעילות סרטן מיקוד גבוהה ופחות תופעות לוואי. 1 תאי סרטן אנושיים לעתים קרובות הופכים ל תלוי באונקוגן אחת מופעל או ביטוי יתר להישרדות 2 כך., תרופות אנטי-סרטניות רבות מוערכות על ידי היכולת שלהם לעכב שעתוק RNA. טיפולים החוסמים את הביטוי של גנים אלה הופכים יעילים בחיסול תאים סרטניים ומובילים למוות של תאים. 3 תאים שינו רגישים יותר להפרעות בשעתוק RNA מ המתאימים לתאים נורמלים. 4 תרופות נגד סרטן המעכבים שעתוק צפויים לעכב באופן סלקטיבי ביטוי של אונקוגנים הנדרשים לתאים הסרטניים לשרוד. כתוצאה מכך 5, אני שעתוק RNAnhibition היא דרך יעילה לאיתורם של מועמדי תרופה נגד הסרטן פוטנציאליים וללמוד עוד על מנגנון הפעולה שלהם. פרוטוקול זה מוכיח כי Ga (tpfc) מעכב שעתוק RNA באותו סדר כמו התרופות כימותרפיות actinomycin D וtriptolide; השוואות דומות יכולות להתבצע באמצעות פרוטוקול זה עם מועמדי תרופה נגד הסרטן אחרים. Actinomycin D הוא מעכב שעתוק RNA הנפוץ לטיפול בסרטן הריונית trophoblastic, סרטן אשכים, הסרטן של וילם, rhabdomyosacoma, וסרקומה 6 של יואינג. Actinomycin D נעשה שימוש בטיפול בסרטן במשך כמעט חמישים שנים מאז שאושר לראשונה על ידי ה- FDA ב1964.Triptolide הוא מעכב שעתוק סלקטיבית שנחקר במבחנה ובמודלים של בעלי חיים שונים נושאות גידולים במשך 30 שנים. 7 טבע macrocyclic amphiphilic של corroles מקנה יתרונות משמעותיים על פני כיתות סמים אחרות כגון מולקולות קטנות או ביולוגיs. 8-14 האופי macrocyclic מאפשר חדירות סלולריות שהוא גדול מהצפוי למולקולות גדולות כזה, והם גדולים מספיק כדי אינטראקציה עם משטחי macromolecular, כגון אלה של חלבונים. 8 Corroles ידוע ליצירת קומפלקסי noncovalent הדוקים עם מולקולות ביולוגיות וסמים. 10 בנוסף לcytotoxicity הטבועה של מסגרת corrole, אנחנו הוכחנו כי מעשי corrole פעיל מעץ כמולקולה מוביל לתרופות כימותרפיות, במיוחד דוקסורוביצין תרופת anthracycline intercalating-DNA. כאשר corrole פעיל מעץ היה coadministered עם דוקסורוביצין, שיפור של פי 3 ב -50 IC של דוקסורוביצין נצפה לDU-145 תאים. 9 מסגרת corrole היא יציבה ובעל תכונות ספיגה הקרינה טבועה ש, כאשר פונקציונליות, לעבור משמרות ספיגה ייחודיות שיכול לשמש לאפיון. 10 Functionalization של הפיגום לא מטבע affect מאפייני photophysical של corrole, 9-15 אבל, כפי שניתן לראות בcorrole פעיל מעץ, באופן סלקטיבי שינוי מסגרת corrole באופן משמעותי יכול לשנות את המאפיינים הביולוגיים שלה. 16 הערכנו בעבר שש metallocorroles נגד שבע שורות תאי הסרטן אנושיות. התוצאות מצביעות על כך שהרעילות לתאי סרטן אנושיים תלויה ביון הספציפי המתכת, כמו גם החלפת קבוצה פונקציונלית. לדוגמא, corroles גליום פעיל מעץ חווה ספיגה סלולרית גבוהה וחדר באופן סלקטיבי לתוך הגרעין של תאים במוח סרטן ערמונית גרורתי (DU-145); תאי סרטן באותו corrole, למרות שזה לא חודר לתוך הגרעין של שורות תאים אחרות, מציג cytotoxicity גדולה יותר לשד (MDA-MB-231), מלנומה (SK-MEL-28), ושחלות (OVCAR-3) מאשר ל סרטן הערמונית. 9 מבחני מבוססי תאים ראשוניים עולים כי תרכובות אלה מראים הבטחה כסוכנים טיפוליים אנטי-סרטניים, שגופת פיורדאחקירה אה למנגנון פעולה. עיכוב תמלול הוא ציין עם מתחמים אורגנו-מתכתיים מסוימים 17-27 ובקשנו לבחון את התהליך הזה כמנגנון אפשרי לציטוטוקסיות התנהגות של משפחת corrole. assay שעתוק זה מספק שיטה פשוטה, זולה, וקלילה להערכת עיכוב שעתוק, שיוביל למידע מפורט יותר על ההשפעות של מולקולות אלה בתאים חיים. כאן, עיכוב השעתוק של גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (Ga (tpfc)) והאנלוגי Freebase 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (tpfc) (איור 1) נבדקים. בניגוד לכמה מתחמי מעבר מתכת, גליום (III) הוא חיזור פעיל ולכן אינו מעורב ישירות בתהליך חיזור של מסלולי מטבוליים המבוסס על חיזור. 28 בכל מקרה, גליום (III) אין להציג נכסים רעילים לתאים ונחקר למטרות טיפוליות. גליום הוא המתכת המבטיחה ביותר השנייה לתרופות אנטי-סרטניות לאחר פלטינה ועבר מחקרים וחקירות רבים; מלחי ניטראט וגליום כלוריד נבדקו במחקרים קליניים כנגד hepatoma, לימפומה, סרטן שלפוחית ​​השתן, ומחלות אחרות. 29-34 גליום (III) לכן הוא מתאים ביותר ללימודי corrole נגד סרטן. נתונים ראשוניים מראים Ga (tpfc) וtpfc יש לי נמוך GI 50, ריכוז תרופת הצורך לעכב 50% מהתפשטות תאים מקסימליים, עם שורות תאי הסרטן שונות (ראה איור 2); זה מאשר את תוקפו של ניסויים נוספים על שני מתחמים אלה כדי לקבוע המאפיינים המעכבים שלהם. אנו משווים תרכובות אלו עם התרופות נגד הסרטן הנפוץ actinomycin D וtriptolide. Actinomycin D intercalates DNA, RNA מעכב התארכות, וגורם למות תאים בשורת תאים מסוימים בריכוזים picomolar 6,35-37 Triptolide הראה לעכב את צמיחת גידול.; הוא נקשר לXPB / ERCC3 האנושי, o למקטעגורם שעתוק f TFIIH, שהוביל לעיכוב של הפעילות השנייה RNA פולימראז. 6-7,38-40 בעוד שהוא מוכר שבcorroles תערוכת נכסים רעילים לתאים, קיים מעט מידע על המנגנונים השונים הנובעים מfunctionalization. עיכוב Corrole של שעתוק RNA היה מציע תובנה רבה יותר על יחסי הגומלין שלהם עם Biomacromolecules. מתחמים אחרים ידועים נקשרים ל- DNA, כגון dirhodium (II, II) מתחמים, כרום (III) מתחמים, רותניום (II) מתחמי polypyridyl, רודיום (III) מתחמים, ואחרים שונים, היו נתונים למבחני שעתוק RNA, 18 27 כתוצאה מכך ההבנה טובה יותר של יחסי הגומלין שלהם עם Biomacromolecules. ניסוי קליל וזמין באופן נרחב זו גם בדיקה ראשונית טובה על מנת להעריך את התכונות הרעילות של מולקולת נתונה ולקבוע אם בדיקות ביולוגיות נוסף ראויים. Assay שעתוק RNA גם מאפשר לשינויים רבים, כגון varying כמות המתחם או אנזימים המשמש; שינוי תקופת דגירה, זמן התגובה ונקודות זמן מדגם; ומשתנה באורך תבנית ה- DNA ורצף, בין משתנים אחרים של עניין, ובכך פוטנציאל לספק כמות גדולה של נתונים. assay שעתוק זה זמין גם בקלות כמו ערכות במחיר סביר עם כל מרכיבי התגובה ההכרחיים בתנאי, למרות שניתן לקנות רכיבים והכינו בנפרד. בניסויים אלה, אנו משתמשים בערכה זמינה מסחרי שידוע שיש תשואה גבוהה. 41 כדי להעריך עיכוב שעתוק, אנו משתמשים בשתי שיטות: ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose וספקטרוסקופיה UV-Vis. ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose היא שיטה פשוטה ויעילה להפרדה, זיהוי, וטיהור 0.5- לברי DNA ו- RNA 25 kb. 42 ספקטרוסקופיה UV-Vis ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז וטוהר RNA. 43

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1410</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triptolide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3652</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">nuclease-free H2O&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tris Acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mini Quick Spin RNA Columns</td>
			<td style="width:219px;">Roche Life Science</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11814427001</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:219px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3232S</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

כימותרפיה כרוכה לעתים קרובות סוכנים ציטוטוקסיות ספקטרום רחב עם תופעות לוואי רבים ומיקוד מוגבל. Corroles היא קבוצה של macrocycles tetrapyrrolic שתערוכת נכסי ההפרש cytostatic ורעילים לתאים בשורות תאים ספציפיים, בהתאם לזהות של מתכת chelated וקבוצות פונקציונליות. ההתנהגות הייחודית של corroles פונקציונליות לשורות תאים ספציפיות מציגה את האפשרות של כימותרפיה ממוקדת. תרופות אנטי-סרטניות רבות מוערכות על ידי היכולת שלהם לעכב שעתוק RNA. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד-אחר-צעד לשעתוק RNA בנוכחות מעכבים ידועים ופוטנציאליים. ההערכה של מוצרי RNA של תגובת השעתוק על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה ו- Vis UV ספקטרוסקופיה מספקת מידע על מאפיינים מעכבים של מועמדים פוטנציאליים ותרופה נגד הסרטן, עם שינויים assay, נוספים על מנגנון הפעולה שלהם. קטןידוע על המנגנון המולקולרי של פעולה של cytotoxicity corrole. בניסוי זה, אנו רואים שני מתחמים corrole: גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (Ga (tpfc)) ואנלוגי Freebase 5,10,15- (טריס) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Assay שעתוק RNA שימש לבדוק את המאפיינים המעכבים של corroles. חמש תגובות שעתוק הוכנו: DNA שטופל בactinomycin D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc ב[ מורכב]: יחס [בסיס תבנית ה- DNA] של 0.01, בהתאמה, וקבוצת ביקורת. תגובות השעתוק נותחו לאחר 4 שעות באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose וספקטרוסקופיה UV-Vis. יש עיכוב ברור על ידי Ga (tpfc), actinomycin D, וtriptolide. assay שעתוק RNA זה יכול להיות שונה כדי לספק פירוט מכניסטית יותר על ידי שינוי הריכוזים של המתחם אנטי-סרטני, DNA, או אנזים פולימראז, או על ידי דוגרים DNA פולימראז או עם המכלוליםXES לפני שעתוק RNA; שינויים אלה היו להבחין בין מנגנון עיכוב מעורב DNA או האנזים. הוספה המורכבת לאחר שעתוק RNA יכול לשמש כדי לבדוק אם המתחמים להשפיל או hydrolyze RNA. גם assay זה יכול לשמש כדי לחקור מועמדים אנטי-סרטניים נוספים.

RNA תמלול איכותי הוערך על ידי Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose משמשת לתמונת RNA עיבד. Ethidium רומיד מאיר על מחייב (λ = 605 nm, λ = 210 nm לשעבר, 285 ננומטר) 46 הדמיה מאפשרת של RNA. להקות כהות יותר בג&#39;ל מתאים לר?...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles at JoVE.com

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) והאנלוגי Freebase להציג cytotoxicity תא מייקרו הנמוך. כתב יד זה מתאר תגובת RNA שעתוק, RNA הדמיה עם ג&#39;ל מוכתם ברומיד ethidium, ו- RNA כימות עם ספקטרוסקופיה UV-Vis, על מנת להעריך עיכוב שעתוק על ידי corroles ומדגימה שיטה פשוטה של ​​הערכת נכסי מועמד אנטי-סרטני.

<em&gt; במבחנה</em&gt; אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

11.5K Views.  California Institute of Technology.  גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) והאנלוגי Freebase להציג cytotoxicity תא מייקרו הנמוך. כתב יד זה מתאר תגובת RNA שעתוק, RNA הדמיה עם ג'ל מוכתם ברומיד ethidium, ו- RNA כימות עם ספקטרוסקופיה UV-Vis, על מנת להעריך עיכוב שעתוק על ידי corroles ומדגימה שיטה פשוטה של ​​הע?...

Video: An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Ocular כדי לבדוק עדשות מגע

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

טכניקה כירורגית הרומן כבסיס In Vivo חלקי הכבד הנדסה בעכברוש

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

שיטת הלימוד הסטנדרטית והמדמדית למחקר בלבלוב אנגיוגנטית בתלת-ממד של התאים הנגזרים מתוך מבחנה

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...