המחברים מבקשים להודות למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה, תכנית כיסאות מחקר בקנדה, מכון קנדי ​​לחקר בריאות, ואונטריו משרד המחקר והחדשנות באמצעות תכנית פרס החוקרים הראשונה שלהם לתמיכה כספית.

1. Photolithography לייצור עובש מאסטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרחץ 3 פנימה פרוסות סיליקון באצטון למשך 30 שניות ולאחר מכן מתנול למשך 30 שניות. לשטוף עם DH 2 0 מים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש השטח של רקיק עם אקדח מכת N2. מחממים את פרוסות על צלחת חמה ב 140 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלזמה חמצן פני השטח של פרוסות סיליקון (1 דקות, 50 וואט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פני השטח של רקיק ספין מעיל עם SU-8 100 photoresist 3 מ&quot;ל (40 שניות; 1,750 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאפות את רקיק המצופה על צלחת חמה על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן כבש את הטמפרטורה עד 95 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות. לשמור על הגדרה זו עבור שעה 1 נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר photomask המכיל את עיצוב הערוץ הרצוי. לחשוף להתנגד ל550-600 mJ / 2 ס&quot;מ של אור האולטרה סגול (350-400 ננומטר). Photomasks יכול להיות מתוכנן בAutoCAD ומודפס על שקיפות עם הדפסה ברזולוציה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לאפות את רקיק על צלחת חמה על 65 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 ו -95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לא rampingהוא הטמפרטורה כמו קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את פרוסות סיליקון ב- SU 8 מפתח פתרון עבור 10-15 דקות. בדקו להשלמת פיתוח על ידי שטיפה עם isopropanol. אם משקע לבן מופיע, להמשיך ולפתח. עובש האב מוצג באיור 2 א. </li></ol> 2. יתוגרפיה הרכה לייצור microchannel <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 35 מ&quot;ל polydimethylsiloxane (PDMS) בסיס אלסטומר עם סוכן ריפוי מיליליטר PDMS 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית בתבנית הבסיס מפוברקת (דפוס פונה כלפי מעלה) ופרוסות סיליקון ריקה לצלחות פטרי מרופדות ברדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 20 prepolymer PDMS מ&quot;ל לתוך צלחת אדון העובש ו15 מ&quot;ל למנה השנייה. לחסל את כיסי אוויר מתחת לפרוסות בעדינות על ידי לחיצה עליהם עם מוליך עץ חד פעמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את שתי המנות ומניחים בצד ליום אחד כדי לרפא. לחלופין, לריפוי מהיר יותר, להסיר בועות אוויר מPDMS באמצעות degasifier ואקום ולאחר מכן לעזוב את המנות על צלחת חמה על 80 מעלות צלזיוס למשך 2משאבי אנוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את נייר הכסף ולקלף את PDMS מהוופלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש האריס Uni-Core (2.5 מ&quot;מ) לאגרוף יציאות גישה נוזלים בשני הקצוות של הערוץ. חותכים את הערוץ וPDMS הריק לרצועות בגודל דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הערוץ, PDMS הרצועה הריקה ושקופיות זכוכית (75 × 25 מ&quot;מ 2) לחמצן פלזמה, סביר להניח ממוקם בחדר נקי. לחשוף לפלזמת חמצן במשך 40 שניות בכוח 40 וואט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היצמד פיסת הערוץ ושקופיות זכוכית לצדדים מנוגדים של הרצועה הריקה. מניח בצד לשעה 2 כדי להשלים את המליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המכלול על צלחת חמה ב 120 ° C. צרף צינורות פלסטיק (קוטר פנימי 1/32 &quot;, קוטר חיצוני 3/32&quot;), שכל אחד לפחות 6 אינץ&#39; ארוך, למאגרים באמצעות אגרוף prepolymer PDMS. להדביק מחבר פלסטיק fluidic לאחד או שני הצינורות כדי לאפשר למזרק מצורף, או להשתמש באבזרים זמינים מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את PDMS אבטחת צינורות כדי לרפא. הכנס 3 &quot;אורכים של 22 חוטי נחושת מבודדים מד לEACשעות מאגר, בין צינור הכניסה והערוץ, ומאובטח עם PDMS prepolymer. המוצר המוגמר הוא שמוצג באיור 2. </li></ol> 3. ניסוי Electrotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את microchannel על הבמה (רצוי XY-מטלטלין) של מיקרוסקופ עם מצלמה מותקנת מחוברת למוניטור (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את אספקת החשמל או חוטי היציאה של המגבר לאלקטרודות של microchannel. אספקת חשמל DC פשוט די אם רק אות DC היא רצויה, אבל מגבר המחובר לגנרטור פונקציה מאפשר יישום של פעם DC ואותות AC גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינור הפלט של microchannel למזרק חד פעמי. להטביע את הפה של צינור היניקה בחיץ M9 פיסיולוגי ועדינות שואפת נוזל לתוך הערוץ על ידי יישום שלילי לחץ בתוך המזרק (באופן ידני או באמצעות משאבת מזרק). כאשר צינורות הכניסה ויציאה שניהם מלאים בM9, נתק את F המזרקROM הצינור. רמת שני הצינורות לאותו הגובה כדי למנוע זרימת hydrostatically מונעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מתח DC לערוץ ולהבטיח כי התנגדות (R = V / I) היא בסביבות 0.6 MΩ (עבור 50 מ&quot;מ אורך, 0.3 מ&quot;מ רוחב ו ~ microchannel עמוק 0.1 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מרוצה מהיושרה של הערוץ, בצע את השלבים שלעיל כדי לטעון תולעים מהשעיה מדוללת לתוך התעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את המזרק וhydrostatically לתפעל את הזרימה על ידי התאמת הגובה היחסי של הצינורות. השתמש בשיטה זו כדי למקם את תולעת במרכזו של הערוץ ולאחר מכן להניח את שני הצינורות שטוחים באותו הגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את אספקת החשמל למתח המתאים: 4-12 ס&quot;מ V / לבעלי חיים בשלב L3, 4-10 V / ס&quot;מ לL4s ו2-4 V / ס&quot;מ למבוגרים צעירים. הפעל את האות החשמלית ולאפשר 1 דקות של חשיפה טרום לתולעת להתאקלם לשדה. התולעת צריכה להתחיל לנוע לכיוון הקתודה. כאשר דקות חלפו, להשתמש במצלמה כדי להתחיל בהקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור AC ודופקניסויי DC D, ניתן לאמץ את השדה החשמלי התגובה המקסימלי ממחזור של האות לעיל ותדירות והחובה יכולה להיות מווסת המועדפים 7, 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הניסוי נגמר, להסיר את כל הנוזל (ותולעים) מהערוץ, לשטוף אותו עם DH 2 0, ולהשאיר את המכשיר על צלחת חמה ב 125 מעלות צלזיוס לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ נתונים מlocomotory קטעי וידאו מוקלטים באופן ידני באמצעות NIH ImageJ <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">(http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> תוכנת מעקב תולעת מבוססת MATLAB המותאם אישית), או. </li></ol>

<ol>
	<li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+Parkinson+mutant+&#945;-synuclein+causes+dopamine+neuron+dysfunction+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Familial Parkinson mutant &#945;-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).</li><li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+reveals+involvement+of+endocytic+pathway+in+neuronal+dysfunction+in+a-synuclein+transgenic.">A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic.</a> 17 (19), 2997-3009 (2008).</li><li>Su, L. J., Auluck, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li><li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfluidic+environment.">Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).</li><li>Salam, S., Ansari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics+set+up+to+study+neuronal+degeneration+and+identification+of+neuroprotective+compounds+in+C.+elegans.">A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans.</a> , (2013).</li><li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+sorting+of+Caenorhabditis+elegans.">Electrical sorting of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).</li><li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pulse+direct+current+signals+on+electrotactic+movement+of+nematodes+Caenorhabditis+elegans+and+Caenorhabditis+briggsae.">Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae.</a> Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).</li><li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+Caenorhabditis+elegans+in+alternating+electric+field+and+its+application+to+their+localization+and+control.">Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control.</a> Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).</li><li>van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+model+identifies+genetic+modifiers+of+alpha-synuclein+inclusion+formation+during+aging.">C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging.</a> PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).</li><li>Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis+of+Caenorhabditis+elegans.">Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).</li><li>Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -. M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+measuring+parameters+of+nematode+sinusoidal+movement.">An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement.</a> BMC Genet. 6, 5 (2005).</li><li>Mani&#232;re, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -. M. D. i., Hersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+worms:+C.+elegans+self-sorting+by+electrotaxis.">Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis.</a> PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).</li></ol>

טכנולוגית assay electrotaxis microfluidic כבר הגישה בקשה לפטנט בארצות הברית של אמריקה וקנדה.

ניצול של התופעה התנהגותית שתוארה לראשונה על ידי גייבל ועמיתיו ובונים על עבודת המניפולציה dielectrophoretic של צ&#39;ואנג ועמיתים 11,12, assay electrotaxis microfluidic מבוסס שלנו מספק שיטה קלה, חזקה ורגישה לבדיקת פעילות עצבית בתולעים באמצעות תנועה כ פלט. הניתוח של פרמטרים תנועה מאפשר הש?...

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>CALEDON Labs</td><td>1200-1-30</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>CALEDON Labs</td><td>6700-1-30</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>CALEDON Labs</td><td>8600-1-40</td><td></td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Microchem Corp.</td><td>Y131273</td><td>SU-8 100</td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>Microchem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>92x16mm Petri Dish</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Contains elastomer base and curing agent</td></tr><tr><td>Function generator</td><td>Tektronix Inc.</td><td></td><td>Model AFG3022B</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Trek Inc.</td><td></td><td>Model 2210-CE</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4506</td><td>Model 11 ELITE</td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>11675916Q</td><td>Model HP131725Q</td></tr></tbody></table>

microfluidic-based electrotaxis for on-demand quantitative analysis of caenorhabditis elegans' locomotion

את Caenorhabditis elegans נמטודות הוא אורגניזם מודל תכליתי למחקר ביו בגלל השימור של גנים הקשורים למחלות ושבילים, כמו גם את קלות הטיפוח שלה. כמה ג מודלים המחלה elegans כבר דיווחו, כולל הפרעות ניווניות כגון מחלת הפרקינסון (PD), הכולל ניוון של דופאמין (DA) תאי עצב 1. שני transgenes והכימיקלים neurotoxic היו בשימוש כדי לגרום לניוון מוחיה תובע וליקויי תנועה וכתוצאה מכך בתולעים, מה שמאפשר לחקירות הבסיס של ניוון מוחיים והמסכים לגנים ותרכובות 2,3 neuroprotective. מסכים באאוקריוטים נמוכים כמו ג elegans לספק אמצעי יעיל וחסכוני לזיהוי תרכובות וגנים המשפיעים על איתות העצבית. מסכי קונבנציונליים מבוצעים בדרך כלל באופן ידני וכבש על ידי בדיקה חזותית, וכתוצאה מכך, הם זמן חסרונות-<html> uming ונוטה לטעויות אנוש. בנוסף, רובם מתמחים בניתוח רמה תאי תוך התעלמות מתנועה, שהוא פרמטר חשוב במיוחד להפרעות תנועה. אנחנו פיתחו מערכת microfluidic הקרנת רומן (איור 1) ששולטת ומכמת ג התנועה &#39;אלגנס באמצעות גירויי שדה חשמליים בתוך microchannels. אנחנו הראינו כי שדה (DC) זרם ישיר וחסונה יכול לגרום על פי דרישת תנועה לכיוון הקתודה (&quot;electrotaxis&quot;) 4. היפוך הקוטביות של השדה גורם לתולעת להפוך את כיוונו במהירות גם כן. יש לנו גם הראו כי פגמים בעצב סנסורי דופאמין ואחרים לשנות את תגובת שחייה 5. לכן, ניתן לקבוע ליקויים באיתות העצבית באמצעות תנועה כקריאה החוצה. תגובת התנועה ניתן לכמת במדויק תוך שימוש במגוון של פרמטרים כגון שחייה מהירות, תדירות כיפוף גוף וזמן היפוך. S = &quot;jove_content&quot;&gt; העבודה שלנו גילתה כי תגובת electrotactic משתנה עם גיל. באופן ספציפי, הצעירים להגיב לטווח תחתון של שדות חשמליים ולנוע מהר יותר בהשוואה לזחלים 4. ממצאים אלה הובילו אותנו לעצב מכשיר microfluidic חדש למיין תולעים פסיביים על ידי גיל ופנוטיפ 6. כמו כן, אנו צריכים לבדוק את התגובה של תולעים ל DC פעם לסירוגין ושדות (AC) זרם חשמלי. שדות DC פעם של מחזורי החובה שונים electrotaxis שנוצר בצורה יעילה בשניהם ג elegans ובת דודתו ג briggsae 7. בניסוי נוסף, שדות סימטריים AC עם תדרים הנעים בין הרץ 1 עד 3 קילוהרץ משותק תולעים בתוך הערוץ 8. יישום של השדה החשמלי בסביבת microfluidic מאפשר ביצוע מהיר ואוטומטי של assay electrotaxis. גישה זו מבטיחה להקל על מסכי גנטיים וכימיים תפוקה גבוהה עבור גורמיםהמשפיע על תפקוד וכדאיות עצביים.

סרטון מייצג של electrotaxis של נמטודות מבוגר הצעירה פראי סוג והמיקום שלה ותפוקות מהירות מתוכנת מעקב התולעת מוצג בוידאו משלים 1 ואיור 3. תוכנת ניתוח התנועה עצמה אינה מזהה את הכיוון של קוטביות שדה ואת הזמן של היפוך קוטביות, אלא במידע זה יש לקבל ממקור הווידאו. זה יכול ?...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion at JoVE.com

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מתואר. שיטה זו מבוססת על תופעת neurophysiologic של תולעים המגיבים לשדות חשמליים קלים (&quot;electrotaxis&quot;) בתוך ערוצי microfluidic. Microfluidic electrotaxis משמש כטכניקה מהירה, רגישה, בעלות נמוכה, וניתן להרחבה למסך לגורמים המשפיעים על בריאות עצבית.

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

microfluidic-based-electrotaxis-for-on-demand-quantitative-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

9.8K Views.  McMaster University. שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה ב Elegans Caenorhabditis מתואר. שיטה זו מבוססת על תופעת neurophysiologic של תולעים המגיבים לשדות חשמליים קלים ("electrotaxis") בתוך ערוצי microfluidic. Microfluidic electrotaxis משמש כטכניקה מהירה, רגישה, בעלות נמוכה, וניתן להר?...

Video: Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

אחת אורך גל צל הדמיה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; נידות כולל כוח אומדנים

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Engineering

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Behavior

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Neuroscience

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and move toward food sources and move away from stimuli that may be toxic or harmful. Chemotaxis is also important at the cellular level. For example, chemotaxis is required for the movement of sperm toward an egg prior to fertilization. In the lab, chemotaxis is frequently examined in the nematode, C. elegans, which is known to migrate towards food sources in soil, but away from toxins such as heavy metals, substances with a low pH, and detergents. This video demonstrates how to perform a chemotaxis assay, which includes preparing the chemotaxis plates and the worms, running the assay, and analyzing the data. Then, we discuss examples of how chemotaxis assays can be used in C. elegans as a tool to understand learning and memory, olfactory adaptation, and neurological disease such as Alzheimer&quot;s disease. Chemotaxis experiments in C. elegans have near-limitless possibilities for learning more about the cellular and genetic mechanisms of many biological processes, and may lead to a greater understanding of human biology, development, and disease.

Chemotaxis Assay in Caenorhabditis elegans

ג. אלגנס Chemotaxis Assay

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and ...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Electrotaxis Assay: A Method to Observe Locomotion in C. elegans

Source: Tong, J,&#160;et al. <a href="https://www.jove.com/video/50226/microfluidic-based-electrotaxis-for-on-demand-quantitative-analysis">Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013).
Researchers can trigger on-demand movement in C. elegans by applying an electric field that worms sense and respond to.&#160; This video introduces electrotactic behavior and shows a sample protocol that is done in a microfluidic device.

בדיקת Electrotaxis: שיטה לצפייה בתנועה ב- C. elegans

Source: Tong, J,&#160;et al. Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.&#160;J. ...

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אחת אורך גל צל הדמיה של

התקני microfluidic פשוטים עבור