Os autores gostariam de agradecer ao Conselho de Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia do Canadá, Canadá programa de Cátedras de Pesquisa, Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, e Ontário Ministério da Investigação e da Inovação através de seu Programa de investigadores em início Prêmio de apoio financeiro.

1. Fotolitografia para Master Mold Fabricação <ol><li> Banho de 3 cm da bolacha de silício em acetona durante 30 segundos e em seguida com metanol, durante 30 seg. Enxágüe com dH 2 0 água por 5 min. </li><li> Seque a superfície do wafer com uma pistola de ar N2. Aquece-se a bolacha em uma chapa quente a 140 ° C durante 2 min. </li><li> Plasma oxidar a superfície da bolacha de silício (1 min, 50 W). </li><li> A superfície da bolacha de spin-revestimento com 3 ml SU-8 100 fotossensível (40 seg; 1.750 rpm). </li><li> Pré-coze a pastilha revestida sobre uma placa quente a 65 ° C durante 10 min, depois rampa a temperatura até 95 ° C ao longo de 2 min. Manter essa configuração para uma 1 hora adicional. </li><li> Alinhar um photomask contendo o projeto do canal desejado. Expor a resistir a 550-600 mJ / cm 2 de luz UV (350-400 nm). Máscaras podem ser projetados em AutoCAD e impresso em uma transparência com impressão de alta resolução. </li><li> Pós-cozer a bolacha sobre uma placa quente a 65 ° C durante 1 min e 95 ° C durante 10 min, rampa tele temperatura como antes. </li><li> Mergulhe o wafer em SU-8 solução reveladora por 10-15 min. Verifique para a conclusão do desenvolvimento de lavagem com isopropanol. Se um precipitado branco aparece, continuar a desenvolver. O molde mestre é mostrado na Figura 2A. </li></ol> 2. Litografia suave para Fabricação de microcanais <ol><li> Misture 35 ml polidimetilsiloxano (PDMS), base de elastômero com 3,5 ml de agente de cura PDMS. </li><li> Coloque o molde mestre fabricado (padrão para cima) e uma pastilha de silício em branco em placas de Petri forradas com papel alumínio. </li><li> Verter 20 mL de pré-polímero de PDMS no prato molde mestre e 15 ml no segundo prato. Eliminar bolsões de ar sob os wafers pressionando suavemente sobre eles com um aplicador de madeira descartáveis. </li><li> Cubra ambos os pratos e reserve um dia para curar. Alternativamente, para a cura mais rápida, remover as bolhas de ar do PDMS usando um desgaseificador a vácuo e depois deixam-se os pratos em uma placa quente a 80 ° C durante 2hr. </li><li> Retire o papel alumínio e retire o PDMS das bolachas. </li><li> Utilizar a Harris Uni-Core (2,5 mm) para perfurar aberturas de acesso de fluidos em ambas as extremidades do canal. Corte o canal e branco PDMS em tiras de tamanho similar. </li><li> Carregar o canal, a tira de placa de PDMS e uma lâmina de vidro (75 x 25 mm 2) no plasma de um oxidante, provavelmente localizado numa sala limpa. Expor a plasma de oxigênio por 40 segundos a 40 W de potência. </li><li> Furar a peça de canal e lâmina de vidro para os lados opostos da tira de placa. Retiradas para 2 horas para completar a ligação. </li><li> Coloque a montagem sobre uma placa quente a 120 ° C. Anexar tubos de plástico (diâmetro interno de 1/32 &quot;, o diâmetro exterior de 3/32&quot;), cada um, pelo menos, 6 cm de comprimento, com os reservatórios perfurados que utilizam pré-polímero de PDMS. Apor um conector de plástico fluídico para um ou ambos os tubos para permitir a ligação da seringa, ou utilizar acessórios disponíveis comercialmente. </li><li> Permitir que o PDMS proteger a tubulação para curar. Insira 3 &quot;comprimentos de calibre 22 fio de cobre isolado em each reservatório, entre o tubo de entrada e o canal, e seguro, com pré-polímero de PDMS. O produto final é mostrado na Figura 2B. </li></ol> 3. Electrotaxis Experiment <ol><li> Coloque a microcanais na fase (de preferência XY-móvel) de um microscópio com uma câmara montada ligada a um monitor (Figura 1). </li><li> Ligue a fonte de alimentação ou fios de saída do amplificador para os eletrodos do microcanais. Uma simples fonte de alimentação DC é suficiente que apenas um sinal de corrente contínua for desejado, mas de um amplificador conectado a um gerador de funções permite a aplicação de sinais AC e DC pulsada bem. </li><li> Aplica o tubo de saída do microcanal para uma seringa descartável. Imergir a boca do tubo de entrada em M9 tampão fisiológico e suavemente aspirar o líquido para dentro do canal por aplicação de uma pressão negativa no interior da seringa (quer manualmente ou utilizando uma bomba de seringa). Quando os tubos de entrada e de saída são ambas cheias com M9, desligar a seringa from o tubo. Nivelar os dois tubos para a mesma altura para impedir o fluxo de acionamento hidrostático. </li><li> Aplicar uma tensão de CC para o canal e garantir que a resistência (R = V / I) é de cerca de 0,6 mohms (para uma redução de 50 mm de comprimento, 0,3 milímetros de largura e -0,1 mm de profundidade microcanal). </li><li> Se estiver satisfeito com a integridade do canal, siga os passos acima para carregar os vermes de uma suspensão diluída para o canal. </li><li> Retirar a seringa e hidrostática manipular o fluxo ajustando altura relativa dos tubos. É este método para colocar um sem-fim no centro do canal e, em seguida, colocar ambos os tubos no mesmo plano de elevação. </li><li> Definir o fornecimento de energia para a tensão apropriada: 4-12 V / cm, para os animais fase L3, 4-10 V / cm, e para L4s 2-4 V / cm, para os adultos jovens. Ative o sinal elétrico e permitir que 1 min de pré-exposição para o worm para se aclimatar ao campo. O worm deve começar a se mover em direção ao cátodo. Quando o minuto passou, usar a câmera para começar a gravar. </li><li> Para AC e pulsoexperimentos d CC, o campo elétrico resposta máxima pode ser adotada a partir do ciclo do sinal acima e freqüência e duty pode ser modulada como desejado 7, 8. </li><li> Quando o experimento for concluído, remova todo o líquido (e vermes) do canal, lave-o com dH 2 0, e deixar o dispositivo em uma placa quente a 125 ° C para secar. </li><li> Extrair dados locomotores de vídeos gravados manualmente usando NIH ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) ou software de monitoramento verme baseada em MATLAB personalizado. </li></ol>

<ol>
	<li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+Parkinson+mutant+&#945;-synuclein+causes+dopamine+neuron+dysfunction+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Familial Parkinson mutant &#945;-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).</li><li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+reveals+involvement+of+endocytic+pathway+in+neuronal+dysfunction+in+a-synuclein+transgenic.">A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic.</a> 17 (19), 2997-3009 (2008).</li><li>Su, L. J., Auluck, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li><li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfluidic+environment.">Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).</li><li>Salam, S., Ansari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics+set+up+to+study+neuronal+degeneration+and+identification+of+neuroprotective+compounds+in+C.+elegans.">A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans.</a> , (2013).</li><li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+sorting+of+Caenorhabditis+elegans.">Electrical sorting of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).</li><li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pulse+direct+current+signals+on+electrotactic+movement+of+nematodes+Caenorhabditis+elegans+and+Caenorhabditis+briggsae.">Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae.</a> Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).</li><li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+Caenorhabditis+elegans+in+alternating+electric+field+and+its+application+to+their+localization+and+control.">Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control.</a> Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).</li><li>van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+model+identifies+genetic+modifiers+of+alpha-synuclein+inclusion+formation+during+aging.">C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging.</a> PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).</li><li>Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis+of+Caenorhabditis+elegans.">Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).</li><li>Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -. M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+measuring+parameters+of+nematode+sinusoidal+movement.">An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement.</a> BMC Genet. 6, 5 (2005).</li><li>Mani&#232;re, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -. M. D. i., Hersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+worms:+C.+elegans+self-sorting+by+electrotaxis.">Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis.</a> PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).</li></ol>

A tecnologia de ensaio electrotaxis microfluídicos foi apresentado para a patente nos Estados Unidos da América e Canadá.

Aproveitando-se do fenômeno comportamental descrita pela primeira vez por Gabel e colegas e com base no trabalho de manipulação dieletroforética de Chuang e colegas 11,12, nosso ensaio electrotaxis baseado em microfluídica fornece um método fácil, robusto e sensível para investigar a atividade neuronal em vermes usando o movimento como uma saída. A análise dos parâmetros de movimento permite a comparação quantitativa entre os diferentes genótipos. A precisão de fabrico de microcanais e aplicaç...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>CALEDON Labs</td>
			<td>1200-1-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>CALEDON Labs</td>
			<td>6700-1-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>CALEDON Labs</td>
			<td>8600-1-40</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8</td>
			<td>Microchem Corp.</td>
			<td>Y131273</td>
			<td>SU-8 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem Corp.</td>
			<td>Y020100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92x16 mm Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Contains elastomer base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>Tektronix Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Model AFG3022B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Trek Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Model 2210-CE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Model 11 ELITE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11675916Q</td>
			<td>Model HP131725Q</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic-based electrotaxis for on-demand quantitative analysis of caenorhabditis elegans' locomotion

Os nemátodo Caenorhabditis elegans é um organismo modelo versátil para a investigação biomédica devido à sua conservação dos genes e vias relacionadas com a doença, bem como a sua facilidade de cultivo. Vários C. elegans modelos da doença têm sido relatados, incluindo desordens neurodegenerativas tais como a doença de Parkinson (PD), que envolve a degeneração de dopaminérgica (DA) neurónios 1. Ambos os transgenes e produtos químicos neurotóxicos têm sido utilizados para induzir a neurodegeneração promotor e consequentes defeitos de circulação em vermes, permitindo investigações sobre a base da neurodegeneração e telas para os genes e compostos neuroprotectores 2,3. Telas em eucariotos mais baixas, como C. elegans proporcionar um meio eficiente e econômico para identificar os compostos e os genes que afetam a sinalização neuronal. Telas convencionais normalmente são realizados manualmente e marcado por inspeção visual e, conseqüentemente, eles são tempo-consuming e propenso a erros humanos. Além disso, a maior enfoque na análise nível celular, ignorando a locomoção, que é um parâmetro muito importante para desordens de movimento. Desenvolvemos um novo sistema de rastreio de microfluidos (Figura 1), que controla e quantifica C. locomoção elegans &#39;usando estímulos campo elétrico no interior de microcanais. Mostrámos que um campo de corrente contínua (DC) pode induzir robustamente on-demand locomoção para o cátodo (&quot;electrotaxis&quot;) 4. Invertendo a polaridade do campo faz com que o worm para reverter rapidamente a sua direção. Também mostrámos que os defeitos em neurónios sensoriais e outros dopaminérgicos alterar a resposta de natação 5. Portanto, anormalidades na sinalização neuronal pode ser determinada utilizando a locomoção como uma leitura. A resposta de movimento podem ser quantificados com precisão, utilizando uma gama de parâmetros, tais como velocidade de natação, corpo frequência de flexão e do tempo de reversão. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; O trabalho revelou que a resposta electrotactic varia com a idade. Especificamente, os jovens respondem a uma menor variedade de campos elétricos e se mover mais rápido em comparação com larvas de 4. Estes resultados levaram-nos a projetar um novo dispositivo micro para classificar passivamente vermes por idade e fenótipo 6. Também testamos a resposta de vermes para pulsado DC e alternada campos de corrente elétrica (AC). DC campos pulsados ​​de vários ciclos electrotaxis efetivamente gerados, tanto C. elegans e seu primo C. briggsae 7. Numa outra experiência, os campos AC simétricas, com frequências que vão de 1 Hz a 3 kHz vermes imobilizada no interior do canal 8. Implementação do campo elétrico em um ambiente de microfluídica permite a execução rápida e automatizada do ensaio electrotaxis. Esta abordagem promete facilitar telas genéticas e químicas de alto rendimento para os fatoresafetando a função neuronal e viabilidade.

Um vídeo representante electrotaxis um nematóide adulto jovem do tipo selvagem e sua posição e saídas de velocidade a partir do software de rastreamento verme são mostrados na Suplementar Video 1 e Figura 3. O próprio software de análise de movimento não reconhece a direção da polaridade do campo eo tempo de inversão de polaridade, mas sim, esta informação deve ser obtido a partir da fonte de vídeo. Isso pode ser feito usando um taco de áudio ou visual no vídeo ou escre...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion at JoVE.com

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

Um método de micro-electro-fluídico semi-automatizado para induzir a demanda de locomoção em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; É descrito. Este método baseia-se no fenómeno neurophysiologic de vermes respondem a campos eléctricos ligeiros (&quot;electrotaxis&quot;) no interior de canais microfluidicos. Microfluidic electrotaxis serve como um baixo custo, e escalável técnica rápida, sensível, para triagem de fatores que afetam a saúde neuronal.

Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

microfluidic-based-electrotaxis-for-on-demand-quantitative-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

9.7K visualizações.  McMaster University. Um método de micro-electro-fluídico semi-automatizado para induzir a demanda de locomoção em Caenorhabditis elegans É descrito. Este método baseia-se no fenómeno neurophysiologic de vermes respondem a campos eléctricos ligeiros ("electrotaxis") no interior de canais microfluidicos. Microfluidic electrotaxis serve como um baixo custo, e escalável técnica rápida, sensível, para triagem de fatores que afetam a saúde neuronal.