저자는 재정 지원에 대한 자신의 조기 연구원 상 프로그램을 통해 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회, 캐나다 연구 의자 프로그램, 건강 연구의 캐나다 연구소, 그리고 연구와 혁신의 온타리오 교육부 감사드립니다.

1. 마스터 금형 제작을위한 포토 리소그래피 <ol><li> 30 초 후 30 초와 메탄올 아세톤 실리콘 웨이퍼 인치 3 목욕. 5 분 dH보다 2 0 물로 씻어. </li><li> N2 블로우 총으로 웨이퍼의 표면을 건조. 2 분 동안 140 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 가열한다. </li><li> 플라즈마 실리콘 웨이퍼 (1 분, 50 W)의 표면을 산화. </li><li> 3 ML SU-8 100 포토 레지스트 (; 1,750 rpm으로 40 초)을 스핀 코팅 웨이퍼의 표면. </li><li> 65 뜨거운 접시에 미리 구워 코팅 웨이퍼 ° C 10 분 후, 95 ° C 2 분 이상 온도를 진입로. 추가 1 시간이 설정을 유지합니다. </li><li> 원하는 채널 설계를 포함하는 포토 마스크를 맞 춥니 다. 550-600 UV 빛의 엠제이 / ㎠ (350-400 nm의)에 저항을 노출합니다. 포토 마스크는 AutoCAD에서 설계 및 고해상도 인쇄와 투명에 인쇄 할 수 있습니다. </li><li> T를 올렸에서 10 분 동안 1 분, 95 ° C, 65 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼 포스트 구워이전과 그 온도. </li><li> 15 분 SU-8 개발자 용액에 웨이퍼를 담가. 이소프로판올로 세척함으로써 개발 완료를 확인합니다. 백색의 침전이 나타나면, 계속 개발. 마스터 형은 그림 2A에 표시됩니다. </li></ol> 2. 마이크로 채널 제작 용 소프트 리소그래피 <ol><li> 3.5 ML PDMS 경화제와 함께 35 ML 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 탄성 중합체 기반을 섞는다. </li><li> 알루미늄 호일로 늘어선 페트리 접시에 제작 된 마스터 몰드 (모양이 위를 향하게)와 빈 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. </li><li> 두 번째 접시에 마스터 금형 접시 15 ML에 20 ML PDMS의 프리폴리머를 붓는다. 부드럽게 일회용 나무 주걱으로 그들을 눌러 웨이퍼 아래에 공기 주머니를 제거합니다. </li><li> 두 접시를 커버하고 치료하는 일에 대해 따로 설정합니다. 또는 2, 빠른 치료를 위해, 진공 degasifier를 사용하여 PDMS에서 기포를 제거하고 80 뜨거운 접시에 요리를 남겨 ° C시간. </li><li> 웨이퍼에서 호일 PDMS 껍질을 제거합니다. </li><li> 채널의 양쪽 끝에서 유체 액세스 포트를 펀치 해리스 유니 코어 (2.5 mm)을 사용합니다. 비슷한 크기의 스트립에 채널과 빈 PDMS를 잘라. </li><li> 플라즈마 산화에 채널 빈 PDMS 스트립 유리 슬라이드 (75 × 25mm 2)로드 가능성 클린 룸에 위치해 있습니다. 40 W 전원에서 40 초 동안 산소 플라즈마에 노출. </li><li> 빈 스트립의 반대편에 채널 조각과 유리 슬라이드를 붙입니다. 결합을 완료하는 데 2​​ 시간 방치. </li><li> 120 핫 플레이트에 어셈블리를 배치 ° C. PDMS의 예비 중합체를 사용하여 구멍을 뚫은 저수지, 각 장기에 최소 6 in (내경 1 / 32 &quot;, 외경 3 / 32&quot;) 플라스틱 튜브를 연결합니다. 하나 또는 두 개의 튜브에 부착는 유체 플라스틱 커넥터 주사기 첨부를 허용하거나, 상업적으로 이용 가능한 피팅을 사용합니다. </li><li> PDMS는 치료하는 튜브를 확보 할 수 있습니다. EAC로 22 게이지 절연 구리 와이어의 3 &quot;길이를 삽입입구 관 및 채널과 PDMS 예비 중합체와 보안 사이의 시간 저수지. 완성 된 제품은 그림 2B에 표시됩니다. </li></ol> 3. Electrotaxis 실험 <ol><li> 모니터 (그림 1)에 연결 장착 된 카메라 현미경의 무대 (가급적 XY-이동)에 마이크로 놓습니다. </li><li> 의 마이크로 전극에 전원 공급 장치 또는 앰프의 출력 선을 연결합니다. 만 DC 신호가 필요한 경우 단순 DC 전원 공급 장치는 충분하지만, 함수 발생기에 연결된 앰프뿐만 아니라 펄스 DC 및 AC 신호의 응용 프로그램을 할 수 있습니다. </li><li> 일회용 주사기에의 마이크로 출력 튜브를 연결합니다. 잠수함 M9 생리 버퍼에있는 입구 관의 입과 부드럽게은 주사기 내부의 부압 (수동 또는 주사기 펌프를 사용)를 적용하여 채널에 액체를 열망. 입구와 출구 튜브 M9로 채워 둘 때, 주사기 F를 분리롬 관. 수압 구동 흐름을 방지하기 위해 같은 높이에 두 튜브를 수평. </li><li> 채널에 DC 전압을 적용하고 (R = V / I)이 (긴 50mm를위한 0.3 mm 폭 ~ 0.1 mm 깊이 마이크로) MΩ 0.6 주위에 그 저항을 확인합니다. </li><li> 채널의 무결성을 만족하는 경우, 채널에 희석 현탁액에서 웜을로드 위의 단계를 수행하십시오. </li><li> 주사기를 분리하고 수압 관 &#39;상대 높이를 조정하여 흐름을 조작 할 수 있습니다. 채널의 중심에있는 벌레를 놓고 같은 높이에 두 튜브가 평평하다이 방법을 사용합니다. </li><li> L3 단계 동물 용 4-12 V / cm의 L4S 4-10 V / cm, 2-4 V / 젊은 성인을위한 CM : 적절한 전압 전원 공급 장치를 설정합니다. 전기 신호를 활성화하고 현장에 순응하는 웜 사전 노출의 1 분을 허용합니다. 웜은 음극쪽으로 이동을 시작합니다. 분이 경과하면 녹음을 시작하려면 카메라를 사용합니다. </li><li> AC 및 펄스7, 8을 원하는대로 D DC 실험, 최대 반응 전계 신호의 이상과 주파수 및 듀티 사이클에서 채택 될 수 변조 할 수 있습니다. </li><li> 실험이 완료되면, 채널에서 모든 액체 (와 웜)를 제거, dH보다 2 0으로 헹굼 ° C 건조 125 핫 플레이트에 장치를 둡니다. </li><li> 수동으로 NIH ImageJ에 (사용 녹화 된 비디오에서 locomotory 데이터를 추출 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) 또는 사용자 정의 MATLAB 기반의 웜 추적 소프트웨어입니다. </li></ol>

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	<li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+Parkinson+mutant+&#945;-synuclein+causes+dopamine+neuron+dysfunction+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Familial Parkinson mutant &#945;-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).</li><li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+reveals+involvement+of+endocytic+pathway+in+neuronal+dysfunction+in+a-synuclein+transgenic.">A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic.</a> 17 (19), 2997-3009 (2008).</li><li>Su, L. J., Auluck, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li><li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfluidic+environment.">Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).</li><li>Salam, S., Ansari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics+set+up+to+study+neuronal+degeneration+and+identification+of+neuroprotective+compounds+in+C.+elegans.">A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans.</a> , (2013).</li><li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+sorting+of+Caenorhabditis+elegans.">Electrical sorting of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).</li><li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pulse+direct+current+signals+on+electrotactic+movement+of+nematodes+Caenorhabditis+elegans+and+Caenorhabditis+briggsae.">Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae.</a> Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).</li><li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+Caenorhabditis+elegans+in+alternating+electric+field+and+its+application+to+their+localization+and+control.">Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control.</a> Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).</li><li>van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+model+identifies+genetic+modifiers+of+alpha-synuclein+inclusion+formation+during+aging.">C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging.</a> PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).</li><li>Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis+of+Caenorhabditis+elegans.">Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).</li><li>Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -. M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+measuring+parameters+of+nematode+sinusoidal+movement.">An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement.</a> BMC Genet. 6, 5 (2005).</li><li>Mani&#232;re, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -. M. D. i., Hersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+worms:+C.+elegans+self-sorting+by+electrotaxis.">Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis.</a> PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).</li></ol>

미세 electrotaxis 분석 기술은 미국과 캐나다, 미국에 특허 출원되어 있습니다.

처음으로 추앙와 동료 11,12의 dielectrophoretic 조작 작업에 GABEL 및 동료와 건물에 의해 기술 된 행동 현상을 활용, 우리의 마이크로 유체 기반 electrotaxis 분석은 운동을 같이 사용하여 웜에 신경 활동을 조사하기 쉽고 강력하고 중요한 방법을 제공합니다 출력. 운동 매개 변수의 분석은 서로 다른 유전자형 사이의 정량적 인 비교를 할 수 있습니다. 함께 마이크로 제조 및 전기 분야의 응용 프?...

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>CALEDON Labs</td><td>1200-1-30</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>CALEDON Labs</td><td>6700-1-30</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>CALEDON Labs</td><td>8600-1-40</td><td></td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Microchem Corp.</td><td>Y131273</td><td>SU-8 100</td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>Microchem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>92x16mm Petri Dish</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Contains elastomer base and curing agent</td></tr><tr><td>Function generator</td><td>Tektronix Inc.</td><td></td><td>Model AFG3022B</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Trek Inc.</td><td></td><td>Model 2210-CE</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4506</td><td>Model 11 ELITE</td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>11675916Q</td><td>Model HP131725Q</td></tr></tbody></table>

microfluidic-based electrotaxis for on-demand quantitative analysis of caenorhabditis elegans' locomotion

선충 Caenorhabditis의 elegans의 때문에 질병 관련 유전자와 경로뿐만 아니라 재배의 용이성 자사의 보존 생물 의학 연구를위한 다양한 모델 생물이다. 여러 C. 엘레 질병 모델은 같은 도파민 (DA) 뉴런 1의 변성을 포함 파킨슨 병 (PD)와 같은 퇴행성 신경 질환 등이보고되었다. 도입 유전자와 신경 독성 화학 물질을 모두 신경 변성 및 신경 유전자와 화합물을 2,3에 대한 화면의 기초로 조사를 허용, DA의 신경 퇴화 및 웜의 필연적 인 움직임 결함을 유도하는 데 사용되었습니다. C. 같은 낮은 진핵 생물의 화면 엘레은 신경 신호에 영향을 미치는 화합물 유전자를 식별 할 수있는 효율적이고 경제적 인 방법을 제공합니다. 기존의 스크린은 일반적으로 수동으로 수행하고 육안 검사에 의해 채점, 결과적으로, 그들은 시간이 단점입니다uming과 인간의 오류가 발생하기 쉬운. 또한, 세포 수준 분석에 대부분의 초점은 운동을 무시하면서, 이는 운동 장애를위한 특히 중요한 매개 변수입니다. 우리는 C.를 제어하고 정량화 새로운 마이크로 유체 심사 시스템 (그림 1) 개발 elegans의 &#39;운동은 마이크로 내부 전기장 자극을 사용하여. 우리는 직류 (DC) 필드가 견고 음극쪽으로 운동 ( &quot;electrotaxis&quot;4) 주문형 유도 할 수있는 것으로 나타났습니다. 필드의 극성을 반전하면 웜이 빠르게뿐만 아니라 방향을 반전됩니다. 우리는 또한 도파민과 다른 감각 뉴런에 결함이 수영 응답 5을 변경 것으로 나타났습니다. 따라서 신경 세포의 신호 전달에 이상이 읽기 아웃으로 운동을 사용하여 확인할 수 있습니다. 운동 반응은 정확히 같은 속도, 몸을 구부리는 주파수와 반전 시간을 수영과 같은 매개 변수의 범위를 사용하여 정량화 할 수있다. 4에 비해 더 빠르게 이동합니다. 이러한 연구 결과는 우리가 수동적으로 연령과 표현형 (6)에 의해 벌레를 정렬하는 새로운 microfluidic 장치를 설계했다. 우리는 또한 펄스 DC에 웜의 반응을 테스트하고 전류 (AC) 전기 분야를 교류했다. C. 둘 다에있는 다양한 듀티 사이클 펄스 DC 필드 효과적으로 생성 electrotaxis 엘레과 사촌 C. 7 briggsae. 또 다른 실험에서, 1 Hz에서에서 3 kHz의 주파수 범위 대칭 AC 필드는 8 채널 내부의 벌레를 고정. 미세 환경에서 전기장의 구현은 electrotaxis 분석의 신속하고 자동 실행을 할 수 있습니다. 이 방법은 요소에 대한 높은 처리량 유전 및 화학 화면을 촉진하기 위해 약속신경 세포의 기능과 생존에 영향을 미치는.

웜 추적 소프트웨어에서 야생형 젊은 성인 선충의 electrotaxis 그 위치와 속도 출력의 대표적인 비디오 보충 비디오 1과 그림 3에 나와 있습니다. 동작 분석 소프트웨어 자체 필드 극성의 방향 및 극성 반전의 시간을 인식하지 않고 오히려이 정보는 소스 비디오에서 얻을 수 있어야합니다. 이 동영상의 오디오 또는 시각적 신호를 사용하거나 실험 조건 및 조작을 작성 할 수 있습니다. </p...

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Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

에 주문형 운동을 유도하는 반자동 마이크로 전기 유체 방법<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt;이 설명되어 있습니다. 이 방법은 미세 유체 채널 내부에 약한 전기 필드 ( &quot;electrotaxis&quot;)에 응답 벌레의 neurophysiologic 현상을 기반으로합니다. 미세 electrotaxis는 신경 세포 건강에 영향을 미치는 요인 화면으로 신속하고 민감한, 낮은 비용, 확장 성이 뛰어난 기술로 제공합니다.

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

9.8K 조회수.  McMaster University. 에 주문형 운동을 유도하는 반자동 마이크로 전기 유체 방법 Caenorhabditis의 엘레이 설명되어 있습니다. 이 방법은 미세 유체 채널 내부에 약한 전기 필드 ( "electrotaxis")에 응답 벌레의 neurophysiologic 현상을 기반으로합니다. 미세 electrotaxis는 신경 세포 건강에 영향을 미치는 요인 화면으로 신속하고 민감한, 낮은 비용, 확장 성이 뛰어난 기술로 ?...

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Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

단일 파장 그림자 영상<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 로코 모션을 포함하여 강제 추정

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

연구

공학

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

생체공학

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

자유롭게 미생물 수영의 양적 운동 연구는 레이저 회절을 사용하여

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

행동분석학

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

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In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

신경과학

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and move toward food sources and move away from stimuli that may be toxic or harmful. Chemotaxis is also important at the cellular level. For example, chemotaxis is required for the movement of sperm toward an egg prior to fertilization. In the lab, chemotaxis is frequently examined in the nematode, C. elegans, which is known to migrate towards food sources in soil, but away from toxins such as heavy metals, substances with a low pH, and detergents. This video demonstrates how to perform a chemotaxis assay, which includes preparing the chemotaxis plates and the worms, running the assay, and analyzing the data. Then, we discuss examples of how chemotaxis assays can be used in C. elegans as a tool to understand learning and memory, olfactory adaptation, and neurological disease such as Alzheimer&quot;s disease. Chemotaxis experiments in C. elegans have near-limitless possibilities for learning more about the cellular and genetic mechanisms of many biological processes, and may lead to a greater understanding of human biology, development, and disease.

Chemotaxis Assay in Caenorhabditis elegans

예쁜 꼬마 선충 주화성 분석

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and ...

교육

JoVE Science Education

기초 생물학

생물학 I : 효모, 초파리, 예쁜 꼬마 선충

Electrotaxis Assay: A Method to Observe Locomotion in C. elegans

Source: Tong, J,&#160;et al. <a href="https://www.jove.com/video/50226/microfluidic-based-electrotaxis-for-on-demand-quantitative-analysis">Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013).
Researchers can trigger on-demand movement in C. elegans by applying an electric field that worms sense and respond to.&#160; This video introduces electrotactic behavior and shows a sample protocol that is done in a microfluidic device.

Electrotaxis Assay: 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 이동을 관찰하는 방법

Source: Tong, J,&#160;et al. Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.&#160;J. ...

의 주문형 정량 분석을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis

요약

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단일 파장 그림자 영상

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치

자유롭게 미생물 수영의 양적 운동 연구는 레이저 회절을 사용하여

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

예쁜 꼬마 선충 주화성 분석

Electrotaxis Assay: 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 이동을 관찰하는 방법

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