אנו מודים לבריאן Venema ואריק מרטינסון לבניית מנגנון electroformation. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומי לבריאות (R01GM100718 לSEG) והמכון הלאומי לעיניים של המכונים הלאומי לבריאות (R01EY017564 לSEG).

1. בתצהיר של שומנים מממסים אורגניים: פרוטוקול הקלסית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שומנים מהאחסון ב -20 ° C או -80 מעלות צלזיוס; חם לRT זהירות:. שומנים מאוד hygroscopic, ורבים מהם רגישים לחמצן. לכסות שומנים בארגון יבש או גז חנקן ובכל הצעדים לצמצם את החשיפה לאוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, להשעות את השומנים בכלורופורם או cyclohexane ב1-10 מ&quot;ג / מ&quot;ל; לציין כי הריכוזים המוצהרים של היצרן הם בדרך כלל נומינליים בלבד זהירות: ללבוש כפפות מתאימות וציוד מגן אישי אחר בעת שימוש בממסים אורגניים.. הסר PPE במהירות אם הוא נשפך על הממס, כמו רוב החומרים עדיין חדירים לממסים אלה והם מספקים הגנה זמנית בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את שני הצדדים של שתי 25 x 37.5 מ&quot;מ שקופיות איטו מצופה זכוכית עם אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את השומנים כדי להשיג את היחסים הטוחנים הרצויים. עבור כל ס&quot;מ 1 2 של שטח של איטו מחליק להיות מצופים עם שפהid, לערבב ~ מיקרוגרם 15-20 של שומנים. לדוגמה, אם שתי שקופיות 25 מ&quot;מ x 37.5 היו להיות מצופה במלואו, היינו משתמש בדרך כלל 30 μl של 10 מ&quot;ג / מיליליטר תערובת שומנים בדם. הערה: להוסיף 0.1% מול טקסס אדומה DPPE עבור דימות פלואורסצנטי, וראה להלן מזהירה על צבעי ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהצד המצופה איטו משקופיות הזכוכית הוא פונה כלפי מעלה על ידי מדידת התנגדות המשטח עם מד התנגדות או מודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את השומנים לתוך מזרק זהירות ממס עמיד:. לא דבקים או פלסטיק, חוץ מPTFE, צריך ליצור קשר עם הממס אורגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מחט המזרק לא ממש נגיעה במשטח איטו, להחיל השומנים הזזת המחט קדימה ואחורה על פני השקופית לאט. לכסות את פני השטח בצורה שווה, מחפש &quot;קשת ברק&quot; על משטח הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות במהירות תחת &lt;1 טור (מ&quot;מ כספית 1) ואקום ל0.5-1 שעות כדי להסיר כל זכר ממס. לשחרר את הוואקום בגז אינרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת אטם סיליקון, עםשכבה דקה של שומן ואקום סיליקון משני הצדדים. להשאיר לפחות 5 מ&quot;מ של שקופית חשפו נחשפה בקצה אחד של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנה מייד לסעיף 4. </li></ol> 2. הכנת Liposome קטנה להתייבשות מבוקרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת השומנים בדם כמו בצעדים 1.1-1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את השומנים באמצעות זרם של ארגון או גז חנקן בצינור בקוטר 10-15 מ&quot;מ תרבות. לכמויות קטנות של שומנים, ≤ 0.5 מ&quot;ג, סרט כתוצאה מכך יכול להיות התייבשות מייד לאחר הצבתו תחת ואקום עבור 0.5-1 שעה להסיר ממס שיורי; המשך לשלב 2.5. כמויות גדולות יותר של שומנים בדם נוטות ללכוד ממסים אורגניים בג&#39;ל סמיך, אפילו תחת ואקום, ומוכנים טוב יותר על ידי lyophilization; לראות צעדים 2.3-4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את סרט השומנים בדם המיובש בcyclohexane, מכסה בארגון וחותם עם פקק, הנח את הצינור בבלוק והקפאה קרים ב -80 מעלות צלזיוס למשך מינימום שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הגוש הקר ומדגם שומנים במערכת ואקוםמסוגל להגיע 100 mTorr. החל ואקום, זה יהיה &quot;דוכן&quot; בכ -1 טור כsublimes פעמי ממס. ואקום ברגע שהממס נמחק לחלוטין (~ 1 שעות) יהיה ירידה מתחת לרמה זו. לשחרר את הוואקום בגז אינרטי ולאטום את הצינור או מימה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד השומנים הם תחת ואקום, מאגר לחות דגה באמצעות ואקום ותזת 15-17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה השומנים באמצעות חיץ degassed בגמר ריכוז 1-10 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לאפשר את השומנים למימה לאט. לאחר 30 דקות, 1 שעות, מערבולת כדי לשבור את הגושים שנותרו. חכה 0.5-1 שעות נוספות כדי לאפשר ללחות מוחלטת. השתמש osmoticant, כגון סורביטול או סוכרוז עד 200 מ&quot;מ, על מנת למנוע התייבשות מוחלטת בשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו ליפוזומים 100-200 ננומטר בקוטר של חול. ראה פרוטוקול שחול של היצרן לפרטים נוספים. שים לב שחייב להיות החיץ פחות מ ~ 25 מ&quot;מ חוזק יוני, או פרוטוקולי מתח electroformation מיוחדים יהיה צורך בסעיף 4. </li></ol> 3.בתצהיר של שומנים על ידי התייבשות מבוקרת של יפוזומים קטנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות: הפרוטוקול שלנו דורש שומנים כדי להיות ממוקמים בשיווי משקל עם אדי פתרונות מלח רוויים במשך שעות רבות. אנו ממליצים בחום לבצע את הפרוטוקול באווירת גז אינרטי, תוך שימוש בתא הכפפות או מתחם דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות: אם הכנת דגימות המכילות חלבונים, למנוע התייבשות מוחלטת. מימה את האווירה בכל מארז עם כוס מים חמים, או אדים מבוססי sonicator. השתמש במד לחות על מנת להבטיח שיש לפחות 30% לחות יחסית. השתמש סורביטול או סוכרוז בחיץ liposome הקטן כאמצעי זהירות נוסף על מנת למנוע התייבשות מוחלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח רוויה של לחות היחסית מתאימה. לחות יעד תלויה בosmolarity של הכנת השלפוחית. לתכשירי הosmolarity הפיזיולוגי, השתמש 30-45% לחות יחסית, ואילו הכנות שלפוחית ​​osmolarity נמוכות יכולות להיות מספקת במיובשותשיווי משקל עם 75-90% לחות יחסית (ראה גם טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את תמיסת מלח רוויה ועודף מלח במכל בחוזקה רב סגר עם מדף פנימי. מיכלי מזון מסחרי ליוגורט וגרנולה עבודה טוב מאוד. החלף את המדף לאחר המילוי, ולהפוך את הנוזל בטוח הוא 5-10 מ&quot;מ מתחת למדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות מצופים איטו נקיים כמו בסעיף 1. השתמש במודד כדי לקבוע באיזה צד הוא מוליך, ולתייג את הצד שאינו מוליך עם שם הדוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משמנים שני צידי (USP כיתה ו) אטם סיליקון (ים) עם אחד או חורים מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צד מוליך שקופיות על הספסל, ולהחיל את אטם סיליקון (ים) לכל שקופית שאליו שומנים ייושמו, כדי לוודא שיש לפחות 5 מ&quot;מ של שקופית נחשפה בקצה אחד כדי להתחבר למנגנון electroformation. להחליק את האטם על מנת להבטיח חותם טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הכנת השלפוחית ​​בחיץ מליחות נמוכה מלח ל~ 1-2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. אנו מוצאים כי concentr גבוה יותרations לייצר תוצאות עניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שומנים לשקופית בטיפות μl 1-10. טיפות קטנות יותר בדרך כלל לייצר תוצאות טובות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על מדף הפנים מעל תמיסת מלח הרווי ולאטום את המכל בחוזקה. השאר על RT במשך 3 שעות לO / נ ניתן להציב את המכל על 4 מעלות צלזיוס, אך שים לב כי עבור חלק מהמלחים, RH תלוי בחום על טמפרטורה, וקר שיגדיל את זמן איזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרט עשוי כתוצאה מכך יש לו ברק קשת קלה אליו, אבל בכל מקרה צריך להופיע כמעט מיובשת. פתרונות מתחילים מאוד האוסמוטי עשויים להיות בלתי אפשריים להתייבש לחלוטין לסרט שומנים בדם, זה לא ישפיע לרעה על התוצאות. </li></ol> 4. Electroformation של יפוזומים ענק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרטי שומנים בדם, במיוחד אלו שנוצרו מיפוזומים מיובשים, הם משתחררים ממקומם בקלות. מימה בזהירות כל אחד גם על ידי הצבת מחט 27 G מזרק בקצה של האטם וליישם את החיץ לאט. מאגרים יכוליםכולל מים, סוכרוז ≤ 200 מ&quot;מ, ≤ M 1 סורביטול ו≤ 5 HEPES המ&quot;מ. תמיסת מלח יותר מ -10 מ&quot;מ עשויה לדרוש פרוטוקולי מתח electroformation חלופיים. תמלא יותר מדי בכל אטם היטב על ידי ~ 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: פעם אחת השומנים הם התייבשות, להמשיך במהירות בשלבים הנותרים, שכן סרטי שומנים מתחילים delaminate באופן מיידי. התשואה וגודל הם מוגדל אם electroformation מתחילה מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתנועה אחת חלקה, יחול, שקופית פנים מוליך שני איטו ב, לחלק העליון של האטם. לוודא שיש לפחות 5 מ&quot;מ של הסככה מחוץ לאזור האטם ומול הסככה הראשונה. לחץ בעדינות על מנת להבטיח חותם טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את שתי סככות באמצעות אתנול ולוודא כי צדדים העומדים בפני האטם הם מוליך עם מודד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא יכול להיות מאובטח יותר עם parafilm או קליפים אביב מתח קלים אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו לתא electroformation למקור מתח על ידי הבטחת סורגי אלומיניום או נחושת, &quot;EMI Gaskקצף ואח &quot;, או סרט מוליך מודבקות למשטחים מוליכים של שתי השקופיות. אנו משתמשים בקצף אטם EMI. תוכניות ללנענע ותפס מוצגים באיור 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שאין קצר חשמלי בין המגעים, וכי המגעים להתחבר כראוי למשטחי איטו, באמצעות מודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את החדר 10 מעלות צלזיוס מעל טמפרטורת ההתכה הגבוהה ביותר של כל אחד משומני הווה; למשל עבור DPPC, חום עד 52 מעלות צלזיוס לפחות, 10 ° C מעל טמפרטורת התכת השרשרת של 42 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למאגרים דלי מלח, להחיל 10 הרץ גל סינוס, ~ 0.7 V RMS לכל מילימטר פער בין שני המשטחים המצופים איטו, עבור 60-90 דקות. למאגרי מלח גבוהים, יש להשתמש בפרוטוקולי מתח אחרים (ראה הפניות). </li></ol> 5. הדמיה ופתרון בעיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת liposome באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת במסנן עבור קוביית Rhodamine או אדום צבעי טקסס. Liposome צריך להיות כדורי,בעיקר unilamellar לפי העין, ונקי מפגמים, כגון &quot;מחרוזות&quot; תלויות מעל liposome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הם קטנים מדי ליפוזומים, להשתמש בפחות שומנים בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש פגמים רבים או כמה ליפוזומים, זה יכול להיות בגלל שומני ג&#39;ל שלב. לשקול העלאת טמפרטורת electroformation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כמה, אם בכלל, ליפוזומים ענק נוצרו בכל מיפוזומים קטנים מיובשים, להפחית את כוח האוסמוטי של חיץ liposome, או להגדיל את כוח האוסמוטי של חיץ electroformation. זרימה פנימית של חיץ לפתרון חיץ ביניים המרוכז יכולה לגרום delamination של סרט השומנים שהופקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תשואת שלפוחית, איכות, או גודל הוא עניה, ואתה כלל מלחים או תמיסות בופר במאגרי electroformation או liposome, לשקול פרוטוקולי מתח electroformation חלופיים. לדוגמה, פוט, et al. -11, ממליץ פרוטוקול שלושה צעד באמצעות 500 הרץ sinewave, העלאת המתח מ50-1,300 Vpp / מ &#39;מעל 30 דקות, מחזיק עבור 90 דקות,n יורד תדירות ל -50 הרץ מעל 30-60 דקות. אלקטרודות פלטינה או טיטניום ייתכן שתהיינה הצורך במקרה הזה, אבל זה לא משנה באופן מהותי את הפרוטוקול. </li></ol>

<ol>
	<li>Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+giant+vesicles.+Probing+the+membrane+nanoregime+via+optical+microscopy.">A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy.</a> Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).</li><li>Luisi, P. L., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Giant Vesicles. , (2000).</li><li>Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposomes:+a+model+system+in+which+to+obtain+patch-clamp+recordings+of+ionic+channels.">Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels.</a> Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+a+voltage-gated+potassium+channel+in+giant+unilamellar+vesicles.">Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles.</a> PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).</li><li>Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles.">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).</li><li>Manley, S., Gordon, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+giant+unilamellar+vesicles+via+hydration+of+a+lipid+film.">Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).</li><li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation:+a+comparison+by+fluorescence+microscopy.">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li><li>Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields.+Kinetics+and+applications.">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications.</a> Progressin Colloid &amp; Polymer Science. 89, 127-131 (1992).</li><li>Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC-electric+field+dependent+electroformation+of+giant+lipid+vesicles.">AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).</li><li>Pott, T., Bouvrais, H., M&#233;l&#233;ard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicle+formation+under+physiologically+relevant+conditions.">Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions.</a> Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).</li><li>Sens, P., Isambert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Undulation+Instability+of+Lipid+Membranes+under+an+Electric+Field.">Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field.</a> Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).</li><li>Green, N. G., Ramos, A., Gonz&#225;lez, A., Morgan, H., Castellanos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+induced+by+nonuniform+ac+electric+fields+in+electrolytes+on+microelectrodes.+I.+Experimental+measurements.">Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements.</a> Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).</li><li>Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+damp+lipid+film+for+better+lipid+compositional+uniformity.">Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).</li><li>Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dissolved+gases+in+high+-performance+liquid+chromatography.">The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 158, 277-293 (1978).</li><li>Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+degassing+and+other+factors+affecting+liquid+chromatographic+detector+stability.">Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability.</a> J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).</li><li>Dolan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+Phase+Degassing-Why,+When,+and+How.">Mobile Phase Degassing-Why, When, and How.</a> LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).</li><li>Cheng, H., Jiang, X., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+lipid+homeostasis+of+mouse+dorsal+root+ganglia+induced+by+apolipoprotein+E+deficiency:+a+shotgun+lipidomics+study.">Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study.</a> J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).</li><li>Rockland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saturated+Salt+Solutions+for+Static+Control+of+Relative+Humidity+between+5+&#176;+and+40+&#176;C.">Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 &#176; and 40 &#176;C.</a> Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).</li><li>Washburn, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).</li><li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposomes+in+physiological+buffer+using+electroformation+in+a+flow+chamber.">Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).</li><li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Peroxides+Promote+Large+Rafts:+Effects+of+Excitation+of+Probes+in+Fluorescence+Microscopy+and+Electrochemical+Reactions+during+Vesicle+Formation.">Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation.</a> Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li><li>Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUV+preparation+and+imaging:+minimizing+artifacts.">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li><li>Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+phosphatidylcholine+in+aqueous+liposome+dispersions.">Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions.</a> Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).</li><li>Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidation+of+polyunsaturated+phosphatidyl-choline+lipids+during+electroformation.">Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation.</a> Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).</li><li>Farkas, E. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+polarization+imaging+of+steady-state+molecular+order+in+ternary+lipid+vesicles+for+the+purpose+of+lipid+phase+assignment.">Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment.</a> J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).</li><li>Hauser, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ultrasonic+irradiation+on+the+chemical+structure+of+egg+lecithin.">The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).</li><li>Hauser, H., Cevc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+vesicles.">Phospholipid vesicles.</a> Phospholipids Handbook. , (1993).</li><li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases.">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).</li><li>Kim, R. S., LaBella, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+analytical+methods+for+monitoring+autoxidation+profiles+of+authentic+lipids.">Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids.</a> J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).</li><li>Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+alter+miscibility+phase+boundaries+in+ternary+vesicles.">Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles.</a> J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).</li><li>Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probe+partitioning+in+GUVs+of+binary+phospholipid+mixtures:+implications+for+interpreting+phase+behavior.">Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).</li><li>Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+electroformation+of+supergiant+unilamellar+vesicles+containing+cationic+lipids+on+ITO-coated+electrodes.">Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes.</a> Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Electroformation של יפוזומים ענקים התפתח טכניקה גמישה תואמת עם שומנים שונים, תכשירים, וחוצצים. שליטה מדוקדקת של התהליך בתצהיר השומנים היא קריטית ביותר להצלחה. יש לנו הצגנו כלים פשוטים כדי להפוך תצהיר מבוקר של שומנים מהכנות liposome קטנות תהליך פשוט. הלחות היחסית היא קריטית להתי?...

ליפוזומים ענקים (הנקרא לעתים קרובות שלפוחית ​​unilamellar ענקית, או GUVs) יש בעיקר נעשו שימוש כדי ללמוד את הפיזיקה וכימיה פיסיקלית של bilayers שומנים, כולל מחקרים של עיוות bilayer, דו קיום שלב לרוחב (&quot;רפסודות&quot;), איחוי קרום, וכו &#39;1-4. יש להם מבנה גס דמוי תא: מעטפת כדורית של קרום המקיפה פנים מימיות אשר יכול בקלות להתבצע שונה מהמאגר הימי שמסביב. הם, בהגדרה, ≈ 1-100 מיקרומטר קוטר, כך שהם יכולים להיות צילמו באמצעות מגוון של גישות אור מיקרוסקופית. הם יכולים להתבצע באמצעות מתוחים הדרגתיים אוסמוטי או מתח מיושם באופן מכאני, כך שבדרך כלל תוך רכה, ניתן להשפיע המאפיינים שלהם לטיפול קל. בפרט, שליטה על &quot;הקשיחות&quot; של liposome עושה את זה פשוט כדי ליצור תיקונים &quot;liposome-מצורפים&quot; או נכרת לאלקטרופיזיולוגיה. בעבר, הכינון מחדש ערוץ יון בוצע בעיקר בסעיף ב &#39;שומנים מישורייםilayers. עכשיו, היכולת ליצור כתמים מיפוזומים ענקים ולהשתמש אשפה מבוטלת של כלים שפותחו עבור electrophysiology הקונבנציונלי (מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שאיפת micropipette, זלוף המהיר ובקרת טמפרטורה, וכו &#39;) גורמת ליפוזומים ענקים אטרקטיבית יותר ויותר עבור לימודי כינון מחדש 5,6. ליפוזומים ענקים שנעשו על ידי אסטרטגיות רבות. למעשה, ליפוזומים ענקים בצורה ספונטנית על ידי תהליך נפיחות כאשר סרט שומנים בדם מיובש הוא rehydrated 4,7,8. התשוקה במהירות רבה יותר כדי להכין גדולים יותר, אחידים יותר ליפוזומים הביאו את החוקרים לגישות אחרות, ובראשם electroformation 1,9. Electroformation גם מסתמך על הידרציה של סרט שומנים בדם מיובש, אבל מאיץ את התהליך באמצעות היישום של שדה חשמלי על פני נדנוד סרט השומנים בדם. תחום מיושם באמצעות שתי אלקטרודות, או חוטי פלטינה או שקופיות זכוכית מצופים אינדיום בדיל תחמוצת (איטו), מופרד על ידי מים אוהמאגר ואליו השומנים מופקדים. נהיגה במהירות מופרזת על ידי הנפיחות של יפוזומים, אחד משיג תשואה גבוהה יותר של יפוזומים גדולים יותר. לפיכך, electroformation הפך שיטת ברירת המחדל כדי לייצר ליפוזומים ענקים 4. המנגנון של electroformation לא מובן לחלוטין, ורוב הפרוטוקולים שפותחו באופן אמפירי (למשל 10,11). יחד עם זאת, אנו יכולים ללמוד קצת על מה לצפות על ידי בהתחשב בתאוריה וכמה תוצאות אמפיריות. הוא האמין נרחב כי electroformation מתרחש על ידי הנהיגה זרימת אלקטרו האוסמוטי של חיץ בין bilayers שומנים הבודדים שנערמו בסרט השומנים הופקד 10,11. צימוד אלקטרוסטטית לתנודות תרמיות של bilayers השומנים הוא כנראה מעורב גם 12. השערות אלה לחזות איכותי גבולות עליונים לתדר השדה החשמלי וכוח שניתן להשתמש בי 10,12. בפרט, הוא נבאה פתרונות מוליכות גבוהים ש( <e&gt; פתרונות מלח פיסיולוגיים כלומר מ &#39;) להפחית את כוחות electrohydrodynamic שעשוי ליזום electroformation liposome 12. ספיקות Electroosmotic בדרך כלל יורדות עם הגדלת ריכוז המלח והגיעו לשיאו בתדירות גבוהה בתדירות כלשהי תנודת שדה חשמלית (לדוגמה אם כי בגיאומטריה שונה, הירוק ואח&#39;. 13). לכן, עוצמות שדה גבוהות יותר ותדרים גבוהים יותר הם סבירות לפתרונות מוליכות גבוהים, בגבולות 10. עם זאת, חלבוני קרום עשויים להיות בקנה אחד עם שיטת הרגילה של הפקדת שומנים על גבי אלקטרודות להליך electroswelling, כלומר בממסים אורגניים אשר לאחר מכן התאדו לעזוב את סרט שומנים בדם דק. ישנם שני מסלולים עיקריים סביב קושי זה: לשלב חלבונים לאחר היווצרות liposome ענקית, או להתאים את האופן שבו השומנים מופקדים. הגישה שלנו בונה על אחרים 5,11 להפקיד את השומנים וreconstituted חלבון קרום יחד מהשעיה של &quot;proteoliposomes&quot; קטן או גדול. אנו מתארים את התהליך הארוך ומאתגר יותר של ייצור proteoliposomes ממטוהרי חלבון ושומנים במקומות אחרים (וקולינס גורדון, בסקירה). כאן אנו מתארים את הפרוטוקול בהיעדרו של כל חלבון, אבל זה אותו הדבר כאשר החלבון משולב; אנו כוללים תוצאות מראות כי proteoliposomes המכיל יון הערוץ TRPV1 ניתן להפוך GUVs ומשמש לתיקון מהדק electrophysiology. בכל גישת electroformation, בדיקה ויזואלית של מדגם השומנים במהלך תהליך הדחת השומנים בדם היא קריטית להצלחה. הגישה שלנו עשויה להיות רלוונטית מעבר ליישום מיוחד לכינון מחדש תעלת יונים. בזמן מאז שפותחנו לראשונה פרוטוקול זה ועכשיו, יש לו גם הראה כיצד אופן שבו שומנים מופקדים על אלקטרודות לelectroformation משפיע ההטרוגניות ההלחנה של GUVs כתוצאה מכך. Baykאל Caglar et al. הראה כי 14 GUVs נוצר בזהירות ליפוזומים המיובשים הייתה וריאציה קטנה יותר פי 2.5 בטמפרטורת המעבר של miscibility GUVs נוצר מתערובות של פוספוליפידים וכולסטרול שונים. העבודה שלהם מצביעה על כך ששומנים וכולסטרול במיוחד נמהר, במאי מתערובת השומנים בדם, כאשר הופקדו מממסים אורגניים, וכתוצאה מהווריאציה המרחבית גדולה בהרכב של סרט השומנים שהופקד. זה חשוב במיוחד ללימודים של התנהגות שלב קרום שומנים בדם, אך הוא עשוי להיות גם קריטי לניסויים כמותיים על תפקוד תעלת יונים. Baykal-Caglar אח&#39; &#39;s. פרוטוקול הוא דומה אך לא זהה לזו שלנו, ואנו מעודדים את קוראים ללמוד אותו גם כן. פרוטוקול זה (ראה סקירה, איור 1) הוא אחד מרבים שיכולים להיות בשימוש. בהצלחת electroformation עיקרון תלויה בתערובת השומנים בדם, לחות, טמפרטורה, מומסים אחרים (בעיקר יונים), ושלכמובן מתח ותדר בשימוש במבנה. כelectroformation הופך להבין טוב יותר, אנו מצפים לשפר את הפרוטוקול שלנו יותר. לבסוף, לעתים קרובות יש עקומה למידה תלולה בelectroforming יפוזומים ענקיים. אנו ממליצים מאסטרינג פרוטוקול המקובל (סעיפים 1 ו -4, ואם יש צורך, סעיף 5) לפני שלומדים להפקיד שומנים מהשעיות liposomal (סעיפים 2-5).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>U1232A or similar</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>117 or 177</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>33210A or similar</td>
			<td>Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 &Omega; load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td>
			<td>CB-90IN-S107 or similar</td>
			<td>Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a></td>
			<td>CNi3233 or similar</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td>
			<td>445815</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td>
			<td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td>
			<td>Use USP Grade VI silicone for its high purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMI gasket</td>
			<td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td>
			<td>4202-PA-51H-01800 or similar</td>
			<td>Distributed by Mouser <a href="http://www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TxR-DHPE</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td>
			<td>850457P or 850457C</td>
			<td>Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034P/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology

הכינון מחדש של תעלות יונים בממברנות שומנים בדם הגדרה כימית להקלטת אלקטרו כבר טכניקה רב עוצמה כדי לזהות ולחקור את תפקודם של החלבונים החשובים אלה. עם זאת, הכנות הקלסיים, כגון bilayers מישוריים, להגביל את המניפולציות וניסויים שניתן לבצע בערוץ המשוחזר וסביבת הקרום שלה. מבנה דמוי תא יותר ליפוזומים ענקים מתיר ניסויי תיקון-מהדק מסורתיים מבלי להקריב את השליטה בסביבת השומנים בדם. Electroformation הוא ממוצע יעיל כדי לייצר ליפוזומים ענקים&gt; 10 מיקרומטר בקוטר אשר מסתמך על היישום של מתח חילופין לסרט שומנים רזה, מסודר שהופקד על פני האלקטרודה. עם זאת, מאחר שהפרוטוקול הקלסית קורא את השומנים שיופקדו מממסים אורגניים, זה לא תואם עם חלבונים בממברנה פחות חזקים כמו תעלות יונים וחייב להיות שונה. לאחרונה, יחסי ציבורotocols פותחו כדי electroform יפוזומים ענקים מיפוזומים קטנים באופן חלקי מיובשים, שיש לנו להתאים ליפוזומים המכילים חלבון במעבדה שלנו. אנו מציגים כאן את הרקע, ציוד, טכניקות, ואת החסרונות של electroformation של יפוזומים ענקים מתפוצות liposome קטנות. אנחנו מתחילים עם הפרוטוקול קלאסי, שאמורה להיות שולטים ראשון לפני שתנסו את הפרוטוקולים מאתגרים יותר שבאים אחרי. אנו מדגימים את התהליך של התייבשות חלקית מבוקרת של שיווי משקל ליפוזומים קטנים באמצעות אדים עם פתרונות מלח רוויים. לבסוף, אנחנו מדגימים את התהליך של electroformation עצמו. נתאר ציוד פשוט, זול, שיכול להתבצע בבית כדי לייצר ליפוזומים באיכות גבוהה, ולתאר בדיקה ויזואלית של ההכנה בכל שלב כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר.

בדוגמאות שלנו, שאנו מכינים ליפוזומים מתערובת של כ -55% מול POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-phosphocholine), 15% מול POPS (1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-phosphoserine , 30% מול כולסטרול, ו -0.1% מול טקסס האדומה שכותרתו 1,2-dipalmitoyl-SN-phosphoethanolamine (TxR-DPPE). הרכב זה נבחר כנציג של שומנים כ גנגליון שורש הגבי 18....

Watch this Scientific Journal Video about Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology at JoVE.com

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

בנייה מחדש של חלבונים בממברנה פונקציונליים ליפוזומים ענקים של הרכב מוגדר היא גישה רב עוצמה בשילוב עם electrophysiology תיקון מהדק. עם זאת, ייצור liposome ענק קונבנציונלי עשוי להיות בקנה אחד עם יציבות חלבון. אנו מתארים פרוטוקולים לייצור ליפוזומים ענקים משומנים טהורים או ליפוזומים קטן המכיל תעלות יונים.

הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

giant-liposome-preparation-for-imaging-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K Views.  University of Washington. בנייה מחדש של חלבונים בממברנה פונקציונליים ליפוזומים ענקים של הרכב מוגדר היא גישה רב עוצמה בשילוב עם electrophysiology תיקון מהדק. עם זאת, ייצור liposome ענק קונבנציונלי עשוי להיות בקנה אחד עם יציבות חלבון. אנו מתארים פרוטוקולים לייצור ליפוזומים ענקים משומנים טהורים או ליפ...

Video: Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

חוט השדרה Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

היכרות עם פונקצית עורקי שריר חלק Kv7 אשלגן ערוץ באמצעות אלקטרופיזיולוגיה קלאמפ תיקון וMyography לחץ

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...