אנו מודים לג&#39; גרסיה Celma, אני סמירנובה ור &#39;Kaback על תרומתו למדידות לייסי וא&#39; במברג על תמיכה ודיונים מועילים.

<ol>
	<li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes.">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane.">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li><li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli:+an+electrophysiological+study.">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li><li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na+/proline+transporter+of+E.coli.">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li><li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transporters:+charge+translocation+and+mechanism.">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li><li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G215R+mutation+in+the+Cl-/H+-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect.">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585 (2010).</li><li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes.">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose/H++symport.">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

1. יתרונותיו של electrophysiology מבוסס SSM בהשוואה לשיטות קונבנציונליות electrophysiology מבוסס SSM הוכיח את עצמו ככלי רב ערך של ארגז הכלים של אלקטרו. זה שימושי במיוחד במקרים בהם לא ניתן להחיל האמנה electrophysiology, כלומר תיקון מהדק ושיטות מהדק מתח,: מלבד כמה יוצאים מן הכלל נדיר שלא ניתן לחקור מובילי חיידקים באמצעות מהדק מתח או שיטות מהדק תיקון בגלל גודלו הקטן של חיידקים ובגלל הם קשים לבטא בתאים או בביציות יונקים. אלא גם מבחינה פיזיולוגית ניתן לחקור מובילי יונקים רלוונטיים. במקרה זה electrophysiology מבוסס SSM הוא אטרקטיבי למובילים מקרומים תאיים ועבור יישומי הקרנה בגילוי תרופות בגלל החוסן שלה והפוטנציאל שלה לאוטומציה. electrophysiology, אפיון קונבנציונלי SSM basedUsing פעמי ייפתר של transporters הוא מאתגר. מאז המחזור של מובילים הוא נמוך &quot;תיקון ענק&quot; או נדרשת התצורה &#39;תא כולו&#39;, שבו יש החלטה בזמן מטבעו נמוך בניסוי חילופי פתרון. ניתן להתגבר על הסיבוך באמצעות שחרור מצע photolytic. עם זאת, רק מספר מצומצם של מצעים מתאימים לגישה זו. הנה חילופי הפתרון המהיר בSSM מציעים הזדמנות הייחודית לביצוע מחקרי אלקטרו עם רזולוציה גבוהה באמצעות מצעי זמן שרירותיים. 2. מגבלות ושלבים קריטיים בניגוד לתיקון מהדק וטכניקות מהדק מתח, לא ניתן להשתמש בelectrophysiology מבוסס SSM ליישם את פוטנציאל. אפיון טרנספורטר מוגבל ולכן כדי להעביר מצבים שאינם מסתמכים על פוטנציאל הממברנה. באופן כללי, יש electrophysiology מבוסס SSM אין מגבלות הנוגעות לסוג טרנספורטר (electrogenic). אבל CL מתחשיטות מהדק מגבר או תיקון יכולות להיות יתרונות, אם רכיבים תאיים כמו חלבונים מחייבים נדרשים לתפקוד חלבון. מגבלות יכולות להתעורר, אם חילופי פתרון יוצרים זרמי ממצא גדולים. זה קורה כאשר מצע אינטראקציה חזק עם SSM כמו במקרה של תרכובות lipophilic. פקדי Artifact ניתן להשתמש כדי לתקן את האותות שנמדדו. יתר על כן רקע מלח גבוה בכל מאגרי המדידה יכול לשמש כדי להפחית את החפצים. אבל במקרים, שבו גודלו של החפץ דומה לאות החלבון, זה כמעט בלתי אפשרי לבודד אות הקשורה חלבון מהחפץ. למרבה המזל, חפצים גבוהים הם יוצא דופן בחילופי פתרון אופטימלי. ישנם כמה צעדים שהם קריטיים למימוש המוצלח של ניסוי electrophysiology מבוסס SSM. הכנת מדגם החלבון היא חלק החשוב ביותר. אם נעשה שימוש בproteoliposomes, כדי להיות בטוח את המשוחזריםתהליך titution מניב מדגם נקי, לשחזור של LPR מספיק וטרנספורטר הוא מכוון בצורה הנכונה. ניתן לבדוק LPR על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים בר הקפאה וכיוון על ידי ניסוי ELISA אם נוגדנים זמינים. השתמש אך ורק SSM אשר מציג פרמטרים אופטימליים לדוגרי מדגם החלבון. הזריקה של החלבון היא שלב קריטי אחר. Sonication הוא חיוני ויש להימנע מבועות אוויר בעת ההזרקה. לאחר הדגירה מדגם המדידות עצמו הן קריטיות, כי בועות אוויר תסיר את דגימת חלבון adsorbed משבב החיישן. לכן תמיד להסיר בועות אוויר לאחר שינוי פתרונות. עם זאת מוזנח אות יכול להתרחש. כדי לתקן מוזנח אות אפשרית, זה חיוני כדי להשיג את הפקדים מוזנחים במהלך הניסוי. 3. מערכות מיוחדות ניתן לשנות SSM-ההתקנה לפי בקשתו. יתר על כן לאהנה מערכים שונים לחלוטין, מאוד מיוחדים זמינים. קיימת האפשרות למדוד אותות חלבון בתנאים סימטריים, לדוגמה תחת שיפוע-pH. להקים חיץ קומפוזיציות סימטריות בתוך ומחוץ לproteoliposomes פתרון שלישי, הפתרון במנוחה, יש להיות הציג וזה דורש תצורת חילופי כפולה. כאן נדרש שלוש דרך שסתום נוסף מעבר בין פתרונות שאינם הפעלה ומנוחה. כדי להגדיל את הרזולוציה הזמן של המערכת שפיתחנו מסלול זרימה חלופי חסרי שסתום המסוף, אך להשתמש בסוג זה של קובט שונה. כאן הצומת של הפעלה ופתרון שאינו מפעיל נמצאת בתוך קובט, 3 מ&quot;מ מול SSM. הגדרה זו מתאימה גם לניתוח הקינטית של תהליכי הובלה מהירים. זה יכול להיות הראה כי ברזולוציה נמוכה כמו פעם 2 אלפיות שני אפשרית. F המסחריully מערכות אוטומטיות זמינות מכוונים לתפוקה גבוהה יותר באופן משמעותי עבור הקרנת סמים. יחידת מטלטלין אוספת פתרונות ומזריקה אותם על פני החיישן בצלחות 96, גם בפורמט צלחת microtiter סטנדרטי.

כאן אנו מדגימים גישת אלקטרו חדש המבוססת על קרום נתמך מוצק (SSM) לאפיון של החלבונים בממברנה electrogenic. התמיכה מוצקה מורכבת משכבה זהב דקיקה בשקופית זכוכית, שבב החיישן. משטח הזהב הידרופילי משמש כדי לאגד את קבוצת תיאול של מגיב alcanethiol. לאחר מכן, selfassembly של monolyer phosphatidylcholine משלים את היווצרות SSM. כדי למדוד את תגובות electrogenic של חלבונים בממברנה, או שברי proteoliposomes קרום adsorbed לSSM (איור 1). החלבון המכיל קרום וSSM אז ליצור מערכת קרום מצמידים capacitively. לכן, טרנסלוקציה תשלום בקרום המכיל חלבון יכולה להיות מזוהה על ידי צימוד קיבולי דרך SSM. שיטה זו מניבה רק לזרמי מעבר. השיא הנוכחי מייצג את פעילות התחבורה הנייחת. מ&quot;ק טרנספורטר התלוי הזמןניתן לשחזר rrents על ידי ניתוח מעגל. שבב החיישן מותקן במערכת קובט (איור 2). יש קובט נפח קובט גלילי של 17 μl (נפח נטו עם O-טבעת רכוב). פינים האביב יוצרים קשר קשר למגבר. מחבר לשקע מוברג לחלק העליון של החלק העיקרי ונושא את האלקטרודה ההפניה, חוט כסף עם כלור. קובט הוא רכוב בכלוב פאראדיי. הוא מחובר למסלול נוזל, המשמש כדי לעורר את פעילות ההובלה של חלבוני הקרום בתגובה לחילופי פתרון מהירים (איור 3). בפתרונות החליפין הפתרון יחידים שני הפרוטוקול, אחד שאינה הפעלה והפעלת פתרון אחד, נדרשים. הזרימה נשלטת על ידי אוויר דחוס באמצעות תוכנת בקרת שסתום במחשב או בוררים ידניים בתיבת ממשק.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath Sonicator</td>
 <td>Bandelin</td>
 <td>RK 52 H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tip Sonicator</td>
 <td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td>
 <td>UP50H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-way valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Terminal valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manometer</td>
 <td>Greisinger electronics</td>
 <td>GDH 14 AN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvette</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml solution containers</td>
 <td>Kartell</td>
 <td>1623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>O-rings</td>
 <td>Seal Science Inc.</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oscilloscope</td>
 <td>Tektronix</td>
 <td>TDS 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reference electrode</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Function generator</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tubings</td>
 <td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td>
 <td>AAC00006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sensor chip</td>
 <td>Fraunhofer Institut f&uuml;r Schicht und Oberfl&auml;chentechnik</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Interface box</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Keithley</td>
 <td>427</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual cog</td>
 <td>Vygon GmbH</td>
 <td>876</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>USB analog-to-digital converter</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr> 
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Regeants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2&#x2011;Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>850356</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3574</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3678 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-(+)-Glucose </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>G8270 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>43819</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol absolut</td>
 <td>VWR AnalaR NORMAPUR</td>
 <td>603-002-00-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Natural E. coli lipids polar extract</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>100600</td>
 <td>for LacY reconstitution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Decane</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D901 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecanethiol</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>O1858 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecylamine</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>74750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P3786 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P9791 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetramethylethylenediamine</td>
 <td>BIO RAD</td>
 <td>1610801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;-Lactose monohydrate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L8783 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

introduction to solid supported membrane based electrophysiology

שיטת אלקטרו אנו מציגים מבוססת על קרום מוצק נתמך (SSM) המורכב משכבת ​​octadecanethiol chemisorbed על שבב חיישן מצופה זהב וmonolayer phosphatidylcholine על העליונה. מכלול זה הוא רכוב לתוך מערכת קובט המכילה אלקטרודה השוואתית, חוט כסף עם כלור. לאחר הספיחה של קרום שברים או proteoliposomes המכיל חלבון הקרום של עניין, משמש חילופי פתרון מהירים כדי לזרז את פעילות ההובלה של חלבוני הקרום. בפתרונות החליפין הפתרון יחידים שני הפרוטוקול, אחד שאינה הפעלה והפעלת פתרון אחד, יש צורך. הזרימה נשלטת על ידי מערכת שסתום וצינור אוויר דחוס ובתוך כלוב פאראדיי. קינטיקה של פעילות התחבורה electrogenic מתקבלת באמצעות צימוד קיבולי בין SSM וproteoliposomes או שברים בממברנה. השיטה, אם כן, מניבה רק transienזרמים לא. השיא הנוכחי מייצג את פעילות התחבורה הנייחת. ניתן לשחזר את זרמי טרנספורטר התלויים בזמן ניתוח על ידי מעגל. שיטה זו מתאימה במיוחד למובילי פרוקריוטים או המובילים אוקריוטים מקרומים תאיים, שאינו יכול להיחקר על ידי מהדק תיקון או שיטות מהדק מתח.

עד עכשיו, electrophysiology מבוסס SSM שימש לאפיין יותר מ -20 מובילים, בעיקר ממוצא פרוקריוטים, למשל 3 Melb, NhaA 4 וPutP 5 (סיכם ב6). אבל גם מובילים אוקריוטים מקרומים תאיים, למשל ClC7 7, כמו גם תעלות יונים, למשל קולטן האצטילכולין ניקוטינית 8 נחקרו. כאן אנו מציגים כדוגמה של כ מדידות הסוכר / H + cotransporter ייסי מחיידקי Escherichia באמצעות proteoliposomes עם לפחות 85% צד ימין מתוך אוריינטציה לייסי בLPR של 5 9, 10. אנו מתמקדים בשלבים העיקריים שהובילו למודל הקינטית מינימאלי של חלבון תחבורה זה. 1. אפיון אלקטרו של תחרת wildtype הצעד הראשון הוא אפיון כללי של תגובת electrogenic על ידי מדידת ערכי pH שונים ( <strong<html> &gt; איור 4), ריכוזי מצע (איור 5) ומצעים. כדי לאמת את הטכניקה, K M וערכי PK ניתנו בספרות היו לשחזרו. תלות pH של לייסי מציגה שתי תגובות electrogenic שונות. העליות הנוכחיות מצמידים capacitively בין חומציות pH 8.5 5 ו, אלא גם משנה את צורתו. תחת תנאים בסיסיים תחבורה מצב יציבה הוא ציין, בעוד שעבור pH חומצי מעריכה רק תגובה מהירה electrogenic נשארה. כדי להבדיל את אותות המצב יציבים מתגובות electrogenic מהר אנחנו משמשים ניתוח מעגל לשחזר זרמי טרנספורטר (איור 6). ב-pH 7 אות monophasic הופכת biphasic. זה גם מצביע על כך שיש שתי תגובות electrogenic שונות. ההערכה היא מהתשלום הועבר (נפרד של האותות), יש שתי התגובות% ו -94% מelectrogenicity הכולל של מחזור התחבורה על 6. ove_step &quot;&gt; 2. הקצאה מתגובות electrogenic כדי להקצות שתי תגובות electrogenic לשלבים מסוימים במחזור של תחרת התגובה, גרסת ייסי E325A נמדדה (איור 7). וריאנט זה רק מראה לקטוז חילופי אבל הוא חסר לכל מצבי התחבורה הפעילים, בשל העיכוב של שחרור פרוטון. האות של E325A ייסי מייצגת חולפת מהיר וקבועה לכל ערכי ה-pH שנמדד. הצורה והמשרעת של האות דומה לאות של wildtype ייסי בתנאים חומציים. בנוסף אנו צופים בשלב שלילי קטן אחרי זרם השיא במגמת ירידה, שהיא אופיינית לזרמי מעבר מהירים שנמדדו במערכות מצמידים capacitively. בגלל מחייב ושחרורו לקטוז הוא לא electrogenic, חולף מהר חייב לתאם עם מעבר קונפורמציה electrogenic בעקבות קטוז מחייב. זה ידוע כי צעד שחרור הפרוטון הוא שיעור limiting למחזור ייסי במצב התחבורה מונע ריכוז השיפוע לקטוז. במקרה זה אנו מצפים לעלייה של שיעור התחבורה עם pH בסיסי, כי שחרור פרוטון הוא מועדף. זהו המקרה להובלת המצב היציב קורלציה אות של wildtype ייסי. יתר על כן זה יכול להיות מוצג על ידי מדידת שיפוע pH שרק את ה-pH הפנימי משפיעה על המצב היציב של התחבורה ייסי (לא פורסם). לכן תגובת electrogenic הגדולה יכולה להיות מוקצה לשלב שחרור הפרוטון. 3. מדידות לצורך הניתוח הקינטית לאחר זיהוי של תגובות electrogenic לסירוגין מחירי התחבורה נקבעו באמצעות הגדרת SSM עם רזולוציה גבוהה של זמן כ -4.5 אלפיות שנייה. זה אפשרי רק בתנאים, כאשר תגובה אחת שולטת באות. במקרה זה ניתן לגזור את קבועי קצב מהזרמים החולפים תחת שיקול של הרזולוציה הזמן של האותות באמצעות איטרטיבי הפחות ריבועי דה<html> אלגוריתם פיתול (איור 8). קבועי השיעור שנקבעו, כמו גם את המודל הקינטית מינימאלי המוצע (איור 9) ולבסוף שמשו לסימולציה של קינטיקה טרנספורטר. העקומות מדומה לשחזר את נתוני SSM אשר בנוסף מוכיח מודל קינטית. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> איור 1. הגיאומטריה ספיחה של proteoliposomes על SSM. SSM נוצר על שבב חיישן, שקופיות זכוכית מצופים זהב מובנה. כדי למדוד את תגובות electrogenic של חלבונים בממברנה, או שברי proteoliposomes קרום adsorbed לSSM. שתי ממברנות ליצור מערכת מצמידים capacitively. זו הסיבה שרק לזרמי מעבר מזוהים. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; איור 2. SSM קובט נושא את החיישן ושבב אלקטרודה השוואתי. שבב החיישן הוא דחוקה בין בסיס קובט וראש קובט. אלקטרודה ההשוואתית מבודדת ממסלול הזרימה על ידי גשר מלח ג&#39;ל polyacrylamide. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="איור 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> איור 3. מסלול נוזלים ומעגל חשמלי של התקנת SSM. בפרוטוקול חילופי הפתרון היחיד אחת בלבד שאינם מפעיל (NA) והפעלה אחת () פתרון הנדרש. הזרימה נשלטת על ידי שני שסתומים 2-way (V1) וסתום מסוף אחד (V2). בוררי סתום הקצה בין פתרונות שאינם הפעלה והפעלה, בימוי אחד מפתרונות לקובט ופתרון האחר למכל פסולת (W). שבב החיישן (SSM) מחובר למגבר (I / U),<html> בעוד אלקטרודה ההשוואתית (AgCl) מחוברת לגנרטור הפונקציה (F) במעגל החשמלי החיצוני. מחשב (PC) ותיבת ממשק משמשים להפעלת שסתום ורכישת נתונים. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="איור 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> איור 4. זרמי מעבר נמדדו עם proteoliposomes ייסי wild-type לאחר 100 קפיצות ריכוז לקטוז מ&quot;מ בערכי pH שונים. הפתרון ללא ההפעלה הכיל גלוקוז 100 מ&quot;מ תוך פתרון ההפעלה הכיל לקטוז 100 מ&quot;מ. כל פתרונות הוכנו במאגר פוספט אשלגן 100 מ&quot;מ ב-pH המצוין עם DTT 1 מ&quot;מ. לפרטים בדבר תנאי מדידה בזה ואת הנתונים הבאים עיינו 9 ו -10. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; איור 5. זרמי שיא מנורמלים ממוצע נמדדו עם proteoliposomes ייסי פראי מסוג שלאחר קפיצות ריכוז לקטוז בריכוזים שונים וערכי pH. ערכי m K מתקבלים מההתקפים היפרבולית. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="איור 6" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> איור 6. שחזור של זרמי טרנספורטר. הזרמים החולפים () המשמש לשחזר את זרמי טרנספורטר (B) נמדדו עם proteoliposomes ייסי wild-type לאחר 100 קפיצות ריכוז לקטוז מ&quot;מ בpH 8.5 (כחול זכר) וה-pH 5.2 (אדום זכר). ב-pH 8.5 מחזור מתמשך הוא ציין אילו ב-pH 5.2 תגובה electrogenic מהירה מתרחשת. זה ברור הוא ציין בנוכחי המשוחזר (ב &#39;). files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;alt =&quot; איור 7 &quot;עבור: תוכן-width =&quot; 4in &quot;עבור: src =&quot; / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; איור 7. נוכחי חולף נמדד עם proteoliposomes ייסי E325A לאחר קפיצת ריכוז לקטוז 100 מ&quot;מ ב-pH 5.2. גרסת ייסי זה מעוכב בשלב שחרור הפרוטון של מחזור התחבורה ולכן תחבורה לקויה. המרכיב השלילי הקטן ציין אופייני לזרמי מעבר מהירים שנמדדו במערכות מצמידים capacitively והיא נגרמת על ידי השחרור של קיבול הקרום לאחר תגובת electrogenic מהר. π0 קבוע הזמן שלו נקבע על ידי הקיבולים וconductances של המערכת (איור 1). <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="איור 8" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> איור 8. זרמי מעבר נמדדו עם proteoliposomes ייסי פראי מסוג afteקפיצות r שונות לקטוז בריכוז ה-pH 5.2. בתנאים אלה אין תחבורה מצב יציבה הוא ציין, אבל מעבר קונפורמציה electrogenic על קטוז מחייב. הקו המקווקו מראה את פונקציית ההעברה המייצגת את ההחלטה בזמן של המערכת. הבלעה מראה את הנחישות של לסירוגין קבועי קצב מKobs הקבועים הנצפה השיעור עם כושר ההיפרבולי לנתונים. השיעור הקבוע שנצפו היה נחוש מהזרמים החולפים עם איטרטיבי הפחות ריבועי deconvolution אלגוריתם 10. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="איור 9" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> איור 9. מודל הקינטית למעגל של שני שלבי electrogenic ייסי. התגובה יכול להיות מזוהה ומאופיין במדידות SSM. תגובה חזקה electrogenic מייצגת ~ 94% מתזוזת המטען הכולל בתגובההמחזור נצפה רק בערכי ה-pH ניטראליים ובסיסיים. זה יכול להיות מוקצה לשלב שחרור הפרוטון (חץ כחול). צעד חלוש electrogenic הוא ציין ב-pH חומצי כאשר המחזור מתמשך של טבע מסוג ייסי מעוכב. אנחנו מוקצים התגובה הזו למעבר קונפורמציה electrogenic על קטוז מחייב, המייצג 6% מתזוזת המטען הכולל של מחזור התגובה.

Watch this Scientific Journal Video about Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology at JoVE.com

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

כאן אנו מציגים שיטת אלקטרו מבוססת על ממברנות נתמכות מוצקות עם דגש על היישומים שלה לאפיון של המובילים בממברנה electrogenic.

מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

introduction-to-solid-supported-membrane-based-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Views.  Max Planck Institute of Biophysics. כאן אנו מציגים שיטת אלקטרו מבוססת על ממברנות נתמכות מוצקות עם דגש על היישומים שלה לאפיון של המובילים בממברנה electrogenic.

Video: Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

יישום מיקרופלואידיקה Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

חוט השדרה Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...