אנו מודים לג&#39;ון דרגה של MGH-DNA Core להכנת ספריית הקרנת ה-DNA. כריסטופר Chigas של פרקין אלמר סיפק תמיכה לא יסולא בפז עבור luminometer Wallac 1420 שלנו. סטיבן Ciacco ומרטין תומא של Agilent סיפקו תמיכה לרובוט בראבו. אנו מודים רון ג&#39;ונסון וסטיב טיטוס בNIH לנדיבות מתן פרוטוקול assay בלוציפראז כפול זוהר שלהם.

לסקירה ניסיונית, ראה איור 1. 1. הכן פלסמידים כתב המכילים יזם synuclein אלפא גורמי רגולטוריים של גן synuclein אלפא (איור 2) משתרעים על פני כ 10 בייט, מהרצף במעלה הזרם NACP (לא מרכיב הביתא של פפטיד עמילואיד) חוזר dinucleotide 1,2 באמצעות אינטרון 2 3. אנו כוללים חלק מאזור זה ב הכתב לבנות שלנו. מצאנו כי פלסמידים המכילים אינטרון 2 נהלים מיוחדים הנדרשים לצמיחה, כפי שמתוארים להלן. פלסמידים לוציפראז, pGL4.10 וpGL4.75 (איור 3), זמינים באופן מסחרי מPromega ויכולים להיות מופץ באמצעות פרוטוקולי ביולוגיה מולקולרית קונבנציונליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את 2 רכיבים של אמרגן אלפא סינוקלאין בPCRs הנפרד באמצעות המתכון בטבלה 1 ופריימרים בטבלה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Veriמוצרי פ.י. PCR על ג&#39;ל agarose ונקי באמצעות ערכת Qiaquick PCR הטיהור (Qiagen), משחררי ב50 μl של TE (טריס-EDTA). אחסן את בר kb eluted 0.9 ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את כל הנפח של בר PCR 3.4 בייט, כמו גם 5 מיקרוגרם של pGL4.10, עם SACI וXhoI. פנק את הווקטור עם עגל המעי אלקליין phosphatase (Roche) וג&#39;ל לטהר באמצעות ערכת PureLink המהיר חילוץ ג&#39;ל (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור את הבר ווקטור באמצעות האנזים T4 DNA (חוד). נקה את התגובה הושלמה באמצעות ערכת PureLink PCR מיקרו (Invitrogen), משחררי ב10 TE חיץ μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך 2 μl של ניקתה התגובה, קשירה ל20 μl של תאי ElectroMAX Stbl4 המוסמכים (Invitrogen) וelectroporate פי הוראות היצרן. לנער בC חממת 30 מעלות ב225 סל&quot;ד 90 דקות. מורחים 2 כרכים על צלחות LB המכילות אמפיצילין 100 מ&quot;ג / מיליליטר ו דגירה ב30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קיסם, בחר 4-6 מושבות קטנות עבור חיסון ל2 מיליליטר של שחפת (נהדר מרק). לגדול תרבויות miniprep אלה בO / נ C שייקר 30 ° </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA פלסמיד מ1.5 מיליליטר של כל תרבות miniprep באמצעות ערכת PureLink HiPure פלסמיד Miniprep (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את minipreps עם BamHI וElectrophorese על ג&#39;ל agarose. השיבוט הנכון צריך לייצר שברי 2.8 kb ו4.9 kb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Restreak תרבות miniprep שנותרה מהשיבוט הנכון על צלחת טרי LB (מרק לוריא) ולגדול ב30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מושבה קטנה ולחסן תרבות המתנע TB 1.5 מיליליטר. Shake O / N ב30 ° C. אל תתנו לתרבות המתנע לגדול לרוויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרבות כולה מתנע ל150 מיליליטר של שחפת prewarmed ולנער ב30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. לפני שתמשיך לשלב הבא, השתמש 1.5 מיליליטר של תרבות זו לminiprep ועיכול נוספים כדי לאשר שהשיבוט לא להשתנות במהלך replicati<html> הלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA פלסמיד מהתרבות שנותרה באמצעות ערכת PureLink HiPure פלסמיד Maxiprep (Invitrogen). תשואות צפויות של פלסמיד הביניים זה הן 50-150 מיקרוגרם למיליליטר 150 של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את בר 0.9 kb קפוא בשלב 1.2. חזור על צעדים 1.3-1.12 לשבט בר 0.9 kb לתוך פלסמיד ביניים, לעכל במקום עם KpnI וSACI. ולקשור, לשנות, לבחור ולגדול לmaxipreps כאמור לעיל. עיכול עם BamHI אמור להניב ברי 5.8 kb ו2.8 kb. זהו פלסמיד אשר ישמש למסך. </li></ol> 2. הכן את תאי 293T, פלסמידים כתב, וספריית ה-DNA להקרנה תאי 293T הם זורעים ראשון לתוך צלחות 96 היטב וtransfected ביום המחרת. פלסמידים כתב וDNAs הספרייה הם בדילול לתוך צלחות 96 היטב. אנחנו השגנו צלחות של ה-DNA ספריית כיתה transfection מליבת ה-DNA בבית החולים כלליים מסצ&#39;וסטס (מקבל = &quot;_blank&quot;&gt; dnacore.mgh.harvard.edu). פרוטוקול זה transfects צלחת ספרייה אחת ל2 צלחות זהות של תאי 293T (איור 1), ובכך 2 צלחות של תאי זרע צריכה להיות לכל צלחת ספרייה שיוקרנו. הערה: לגדל תאים בתקשורת ללא פנול אדום או אנטיביוטיקה, כמו אלה להפריע למבחני לוציפראז ולהגדיל את הרעילות במהלך transfection, בהתאמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת ספרייה שיוקרנו, תאי 293T trypsinized resuspend לריכוז של 1.5 x 10 5 תאים / מיליליטר בDMEM המכיל FBS 14%. יוצקים לתוך מאגר סטרילי (Axygen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המאגר, 2, צלחות ברורות עם תחתית 96 היטב (קורנינג), ותיבה של טיפים pipet המסנן (Agilent) על סיפון הרובוט. לוותר תאי 100 μl לבאר כל שני הצלחות, לצפיפות של 1.5 x 10 4 תאים לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות תא ב50 XG במשך 2 דקות, שימוש במהירויות רמפה נמוכות כדי להבטיח שוויוןצפיפות תאים לאורך כל טוב. דגירה על 37 מעלות צלזיוס ו10% 2 O / נ CO </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הגחלילית ופלסמידים כתב Renilla ל5 ng / μl בסרום ללא מדיה. מערבבים את דילולים על יחס של 5:03 גחלילית לפלסמיד Renilla (לפי נפח) בצינור חרוטי 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet פלסמידים בשילוב לבאר כל צלחת 96 היטב, מחלק 17 μl לכל צלחת ספרייה, בתוספת עודפת 2-10 μl, לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג צלחות ספריית ה-DNA בדרגת transfection כאמור לעיל ולדלל את 13.3 ng / μl עם מים ללא רעלן פנימי. ההיקף המינימאלי לכל גם צריך להיות 28 μl. </li></ol> 3. בצע transfections ביום 2 של המסך, פלסמידים כתב וDNAs הספרייה הם transfected לתוך תאי 293T. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת ספרייה, לערבב 107.5 μl של RT Optifect (Invitrogen) עם 4.3 מיליליטר סרום ללא מדיה (1:40 דילול) בצינור קלקר. דגירה במשך 5 דקות ב RT, וn לוותר 44 μl (לכל צלחת ספרייה) לבאר כל צלחת 96 היטב, תחתית-V קלקר (גריינר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת של Optifect בדילול מלא, פלסמידים כתב (שלב 2.5), DNAs ספרייה (שלב 2.6), ותיבה של טיפים pipet על סיפון הרובוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב 17 μl של פלסמידים כתב, 43 μl של Optifect בדילול מלא, ו26 μl של ה-DNA ספרייה, החדרת אוויר פער 5 μl בין כל שאיפה. ה-DNA הספרייה צריכה להישאף אחרון כדי למנוע זיהום צולב. לוותר התוכן של הטיפים לתוך צלחת עם תחתית V קלקר חדשה, לערבב, לכסות ולהניח בצד ל20 דקות, כדי לאפשר מתחמי שומנים / DNA כדי ליצור. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, להחליף הטיפים pipet וצלחת ספרייה, וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את צלחת תערובת Optifect / DNA ולמקם אותו על סיפון הרובוט עם 2 צלחות של תאי 293T. שימוש בקופסה אחת של טיפים pipet, לשאוב 80 μl של Optifect: תערובת ה-DNA ולוותר לאט 40 μl על כל צלחת של תאים. אם טרנסfecting צלחות ספרייה מרובות, חזור על כל Optifect: צלחות ה-DNA. כסה תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות התא ב1,200 XG במשך 30 דקות. כסה ולחזור לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 4-6 שעות. במהלך דגירה זה, להכין תקשורת טרי על ידי ערבוב DMEM 12 מיליליטר מכיל 10% FBS ו10 מיקרוגרם / מיליליטר ציפרופלוקסאצין (Cellgro) לכל צלחת ספריית transfected. יוצקים תקשורת טרי לתוך מאגר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2 קופסות של טיפים רובוט, צלחת אחת של תאים, המאגר המכיל תקשורת טריות, ומאגר פסולת על סיפון הרובוט. של תקשורת לשאוב 100 μl מהתאים ולוותר למאגר הפסולת מלא באופן חלקי עם 70% אתנול. בעזרת טיפים טריים, של תקשורת הטרי לשאוב 100 μl ולוותר לאט על גבי התאים. חזור על פעולה עבור כל הצלחות של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור צלחות החממה ל48 שעות. </li></ol> 4. בצע כפול לוציפראז-מבחני ביום 4 של המסך,מבחני גחלילית בלוציפראז וRenilla מבוצעים. הערה: assay הכפול לוציפראז דורש תוספת רציפה של 2 מאגרים assay, חיץ גחלילית assay 3X וחיץ assay 3X Renilla, כפי שמתואר בטבלה 3 luciferases Firefly וRenilla אינם מופרש, ולכן תאים חייבים להיות lysed לפני מדידת פעילות לוציפראז. . חיץ assay Firefly lyses תאים ומספק מצע לגחלילית בלוציפראז; חיץ assay Renilla מרווה את אות הגחלילית ומספק מצע ללוציפראז Renilla. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת ספרייה, להכין 8 מיליליטר של חיץ גחלילית assay 3X מפתרונות מניות כפי שמתואר בטבלה 3, ולוותר 82 μl לבאר כל צלחת עם תחתית V 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת ספרייה, גם להכין 12 מיליליטר של חיץ assay 3X Renilla ולוותר 122 μl לבאר כל צלחת עם תחתית V 96 היטב. מניח בצד שנימאגרי assay גחלילית וRenilla. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קופסא הטיפים pipet, מאגר פסולת, ו2 צלחות של תאים (transfected מאותה צלחת ספרייה) על סיפון הרובוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב 60 μl של תקשורת מכל צלחת וזורקים במאגר הפסולת מלא באופן חלקי עם 70% אתנול. צלחות וכיסוי מניח בצד. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, חזור על כל הסטים של צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2 קופסות של טיפים pipet, הצלחת של חיץ גחלילית assay 3X, ומערכת של צלחות תא על סיפון הרובוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב 40 μl של חיץ גחלילית assay 3X ולהוסיף אותו לצלחת הראשונה של תאים, מערבב היטב. מעבר לטיפי pipet חדשים, לחזור לצלחת התא השנייה. מקום תאים ב RT עבור 10 דקות כדי להשלים תמוגה. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, להחליף את התיבות של טיפים וצלחות תא, וחוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא הארה מכל טוב של כל צלחת תא בluminometer, הקלטה ל1 שניות לכל טוב. חזור צלחות לרובוטסיפון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2 קופסות של טיפים pipet, הצלחת של חיץ assay 3X Renilla, ומערכת של צלחות תא על סיפון הרובוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב 60 μl של חיץ assay 3X Renilla, ולהוסיף אותו לצלחת הראשונה של תאים, מערבב היטב. מעבר לתיבה חדשה של טיפים pipet, חזור לצלחת התא השנייה. אם transfecting צלחות ספרייה מרובות, חזור על כל הסטים של צלחות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא הארה מכל הצלחות על luminometer, הקלטה היטב כל אחד לשנייה 1 כאמור לעיל. בטל צלחות. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הגחלילית: יחס הארה Renilla (&quot;F: יחס R&quot;) לכל אחד גם על ידי חלוקת הסעיפים של אות גחלילית ידי הסעיפים של אות Renilla. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את ערך האינדוקציה על ידי חלוקת F: יחס R של כל אחד גם על ידי F הממוצע: יחס R של הצלחת, למעט 25% הגבוהים ביותר והנמוכים ביותר של בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע ערכי האינדוקציה ברחבי משכפללצלחת ספריית transfected אחת. גנים גרימת או מדחיקים אלפא סינוקלאין יותר משלושה קיפולים נחשבים &quot;להיטים&quot; במסך הזה והם כפופים להוכחה נוספת ומסכים המשני. </li></ol>

<ol>
	<li>Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+allelic+variation+at+the+NACP-Rep1+repeat+upstream+of+the+&#945;-synuclein+gene+(SNCA)+on+transcription+in+a+cell+culture+luciferase+reporter+system.">Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the &#945;-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).</li><li>Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+intra-allelic+variation+at+NACP-Rep1+in+the+alpha-synuclein+gene.">Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene.</a> 113 (5), 426-431 (2003).</li><li>Scherzer, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA+transcription+factors+directly+regulate+the+Parkinson's+disease-linked+gene+&#945;-synuclein.">GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene &#945;-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).</li><li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+Bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy Bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Pankratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+Parkinson's+disease:+identification+of+a+novel+locus,+RIT2.">Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2.</a> Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).</li><li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson's+disease.">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li><li>Sim&#243;n-S&#225;nchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson's+disease.">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li><li>Polymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson's+disease.">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+relationship+between+a-synuclein+gene+duplication+and+familial+Parkinson's+disease.">Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).</li><li>Chartier-Harlin, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson's+disease.">a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).</li><li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson's+disease.">a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302 (5646), 841 (2003).</li><li>Ahn, T. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+gene+duplication+is+present+in+sporadic+Parkinson+disease.">a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease.</a> Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).</li><li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells.">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li><li>Montigny, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+influencing+high-efficiency+transfection+of+bacterial+artificial+chromosomes+into+cultured+mammalian+cells.">Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells.</a> Biotechniques. 35, 796-807 (2003).</li><li>Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+genomes+which+express+chloramphenicol+acetyltransferase+in+mammalian+cells.">Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+Component+of+the+Yeast+Origin+Recognition+Complex+by+a+One-Hybrid+System.">Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System.</a> Science. 262, 1870-1874 (1993).</li><li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci.">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouseGenome.">A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome.</a> Nature. 488, 116-120 (2012).</li><li>Fan, F., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+high-throughput+screening.">Bioluminescent assays for high-throughput screening.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).</li><li>Hampf, M., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+combined+Photinus+and+Renilla+luciferase+quantification+compatible+with+protein+assays.">A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+PTC124+activity+in+cell-based+luciferase+assays+of+nonsense+codon+suppression.">Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).</li><li>Pearlberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screens+using+RNAi+and+cDNA+expression+as+surrogates+for+genetics+in+mammalian+tissue+culture+cells.">Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells.</a> Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).</li></ol>

עבודה זו נתמכה על ידי תמלוגים המתקבלים על ידי BacMamreagents רישוי (פטנט בארה&quot;ב 5,731,182).

אלפא סינוקלאין היה מעורב במחלת פרקינסון (PD) כמרכיב של גופי לוי 4, תכלילים תאיים נחשבים pathognomonic למחלה. מחקרי עמותה הגנום רבים מצאו קשר בין פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד בsynuclein אלפא עם סיכון מוגבר לספורדיים פ&quot;ד 5,6,7. אמנם פחות נפוצה מאשר פ&quot;ד סדיר, פ&quot;ד המש...

היכולת לזהות מרכיבים עיקריים גנטיים רגולציה וגורמים הפועלים עליהם היא יסוד לחקר של תהליכים ביולוגיים רבים. עם זאת, זיהוי גורמים המווסתים את הביטוי של גנים בסוגי תאים נדירים, כגון אוכלוסיות עצביות ספציפיות, יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי רגולטורים תעתיק רומן של synuclein אלפא (אס.אנ.סי. איי), גן הקשור למחלת פרקינסון, והביע בנוירונים דופאמין בsubstantianigra PARS אזור compacta של המוח התיכון. אנו משיגים זאת באמצעות מסך כתב תפוקה גבוהה, כפול לוציפראז, במבחנה כדי לפרק ביטוי אלפא סינוקלאין בתאי 293T. אמרגן אלפא סינוקלאין הוא משובט ראשון לתוך פלסמיד כתב המכיל את גן גחלילית בלוציפראז. פלסמיד זמין מסחרי המכיל את לוציפראז Renilla תחת השליטה של אמרגן פעיל constitutively משמש כבקרה פנימית. Thesכתב בונה דואר היא שיתוף transfected לתוך תאי 293T בmicroplates עם פלסמידים מספריית ביטוי ה-DNA, כך שכל אחד גם הוא transfected עם פלסמיד ספרייה אחת. לאחר 48 שעה, פעילות לוציפראז עבור כל כתב נמדדה ברצף באמצעות assay כפול זוהר. הביטוי היחסי של אלפא סינוקלאין בתגובה לכל גן ספרייה הוא להסיק לפי היחס של גחלילית: פעילות Renilla לוציפראז בכל טוב (F: יחס R) לאחר נורמליזציה מבוססת צלחת. פרוטוקול זה מספק את יכולת מסך מספר רב של גנים (~ 2,500 בשבוע) ביכולתם transactivate גן כתב באמצעות כוח אדם מינימאלי (1-2 אנשים) ובעלות מינימאלית (כ -3 דולרי עלות מגיב לכל assay microplate). רגולטורים תעתיק של גנים עצביים (למשל, synuclein אלפא), שקשה ללמוד בנוירונים בתרבית עקשן למניפולציה גנטית, ניתן להשוות Side-by-צד בassay הפונקציונלי ישיר זה. אנו כוללים בנופרוטוקול מפורט שיטה לשכפול ולצמיחה של פלסמידים המכילים את אמרגן synuclein אלפא, שכן מצאנו כי פלסמידים המכילים אזור זה הם לא יציבים כאשר גדלו עם נהלים מקובלים (ראה דיון). אנו גם חלופה זולה לחומרים כימיים הכפול לוציפראז זמינים מסחרי עבור מבחני תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות למקד אלמנטים רגולטוריים נוספים של ריבית, או לכל תהליך הדורש transfections החולף תפוקה גבוהה.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAQuick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink PCR Micro Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K310250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bravo Robot</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>-</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips with Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips without Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear-bottomed 96-well Plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3610</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reservoirs</td>
 <td>Axygen</td>
 <td>RES-SW96-HP-SI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polystyrene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive Plate Covers</td>
 <td>CryoStuff</td>
 <td>#FS100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phusion DNA Polymerase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0530L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAC 2002-D6</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>2002-D6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calf Intestine Alkaline Phosphatase</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10713023001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA Ligase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0202L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.10</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6651</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.74</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6931</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ElectroMAX Stbl4 Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11635-018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Subcloning Efficiency DH5&alpha; Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18265-017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM without Phenol Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>31053-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optifect</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12579017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ciprofloxacin</td>
 <td>CellGro</td>
 <td>61-277-RF</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Hydrochloride Powder</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93287</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Base Powder </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93286</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100 Pure Liquid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP151-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15508-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coenzyme A</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>309</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6419</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luciferin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>L2912</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>h-CTZ</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTC124</td>
 <td>SelleckBiochemicals</td>
 <td>S6003</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

high-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay

אנו מציגים פרוטוקול תפוקה גבוהה הקרנה מהירה וזול לזיהוי רגולטורים תעתיק של synuclein אלפא, גן הקשור למחלה פרקינסון. תאי 293T הם transfected transiently עם פלסמידים מספריית ביטוי ORF ערוך, יחד עם פלסמידים כתב בלוציפראז, בפורמט microplate אחד של גן לכל כן. פעילות גחלילית בלוציפראז היא assayed לאחר 48 שעה כדי לקבוע את ההשפעות של כל גן ספרייה על שעתוק synuclein אלפא, מנורמל לביטוי ממבנה בקרה פנימי (אמרגן HCMV בימוי לוציפראז Renilla). פרוטוקול זה הוא הקל על ידי רובוט ספסל העליון הסגור בארון בטיחות ביולוגי, אשר מבצע טיפול נוזל מזוהם בפורמט 96 היטב. פרוטוקול transfection האוטומטי שלנו הוא בקלות להתאמה לייצור ספריית lentiviral תפוקה גבוהה או פרוטוקולי הקרנה פונקציונליים אחרים הדורשים משולש transfections של מספר הגדול של פלסמידים ספרייה ייחודיים בconjunction עם סט משותף של פלסמידים עוזר. אנו מציגים גם חלופה זולה ומאומתים לחומרים כימיים, זמינים מסחרי, כפולים לוציפראז המעסיק PTC124, EDTA, וpyrophosphate לדכא פעילות גחלילית לוציפראז לפני המדידה של לוציפראז Renilla. שימוש בשיטות אלה, אנו הוקרנו 7670 הגנים אנושיים וזיהינו 68 רגולטורים של אלפא סינוקלאין. פרוטוקול זה הוא שינוי בקלות למקד גנים אחרים של עניין.

ערכי לוציפראז טיפוסיים, F: יחס R וערכי אינדוקציה עבור חצי צלחת אחת מוצגים באיור 4 שימו לב ללהיט בגם H2, משדל פי 32.. גנים הגורמים לרעילות מוגזמת (לדוגמא, גם E3), או בארות שהיו transfected גרוע, יפיקו ערכים נמוכים לגחלילית והן luciferases Renilla, אבל ערך אינדוקציה ממוצע. גנים ה...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay at JoVE.com

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

high-throughput-functional-screening-using-homemade-dual-glow

Research

JoVE Journal

Biology

23.3K Views.  Massachusetts General Hospital.  אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין. 

Video: High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...