Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.

הכנת .1 לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דגימות המכילות נגיף להביע לוציפראז (להלן VSVΔ51-Fluc כדוגמא) לטיטרציה והעברה ל96-גם צלחות. לחלופין, לבצע זיהומים ב96-גם צלחות תרבית הרקמה וsupernatants שימוש ישירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשאיר את שתי עמודות שלא טופלו להכללתה של עקומות סטנדרטיים. בניסויים שנעשו בצלחות 96 היטב, כייל ישירות בסוף הניסוי (לאחר זיהום 40 hr) או בחנות ב-80 מעלות צלזיוס וכייל במועד מאוחר יותר. </li></ol> .2 הכנת תאים מתירנית לכותרות וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני titering, להכין השעיה של תאי Vero בריכוז של 2.5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל במדיום הנשר שונה Dulbecco (DMEM) המכיל 10% בסרום שור העובר (FBS), 30 HEPES מ&quot;מ, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. הערה: למרות שפרוטוקול זה משתמש בתאי Vero, כל שורת תאים מתירנית מתאימה לזיהום VSV יכולה bדואר בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 2.5 x 10 4 תאים (100 μl) בצלחות שטוחות תחתונה מוצקות 96, גם לבנים באמצעות מתקן microplate. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 12 מ&quot;ל של השעיה תא לכל צלחת בתוספת 5 מ&quot;ל לתחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת נקייה microplate מתקן על ידי שטיפת צינורות עם 50 מ&quot;ל של מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את קווי מנפק microplate עם השעיה תא ולתת 5 מ&quot;ל של השעיה תא לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תכנית שלוותר 100 μl בכל טוב של צלחת 96 היטב עם קירות לבנים. לוותר, וחזור לפי צורך לצלחות נוספות. גם זרע כמה בארות בצלחת שטוחות תחתונה ברורה 96, גם אם צלחות לבן קירות אטומות התחתונה משמשות לאימות של בריאות תא וצפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים כאשר סיימו, סומק בחזרה לתוך מיכל מקורי. נקה את הקלטת על ידי הפעלת 50 מ&quot;ל של אתנול 70% אחרי 50 מ&quot;ל של מים סטריליים חמים דרך צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך קלטת בטוחה וצינורות הם apניקה propriately בין שימושים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ל24 שעות על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified 5% CO 2. </li></ol> .3 הכנת עקומת סטנדרט ויראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עקומה סטנדרטית של VSVΔ51-Fluc בסרום ללא DMEM כך שהריכוז הסופי של יחידות שלט יוצרים (pfu) לכל מ&quot;ל לאחר העברה על גבי תאי Vero הוא כדלקמן: 10 8 מ&quot;ל / pfu, 10 7 מ&quot;ל / pfu, 10 6 מ&quot;ל pfu /, 10 5 מ&quot;ל / pfu, 10 4 מ&quot;ל / pfu, 10 3 מ&quot;ל / pfu, 10 2 מ&quot;ל / pfu, ו10 1 מ&quot;ל / pfu. הכן 50 μl של כל ריכוז לכל צלחת של תאי Vero תוספת נוספים 10%. הערה: כייל של מניות וירוס לוציפראז תצטרך להיות מוערכת באופן קלאסי 10 כדי ליצור עקומה סטנדרטית שתאפשר לכימות מוחלט. אחרת כימות יחסי יכול להיות מושגת ללא מידע כייל מדויק על ידי כייל נגיף באופן שרירותי קביעת מבוססתעל צעדי דילול. לדוגמא הדילול הראשון של העקומה סטנדרטית עשוי להיות מוגדר 10 8 יחידות נגיפיות ו1/10 הדילול ל10 7 וכן הלאה הבא. בהקשר זה, אחד צריך לבטא ערכים כמו מתקפל שינוי בהשוואה למדגם שנקבע מראש ככימות מוחלט לא יהיה מדויק. </li></ol> .4 העברת Supernatants לדוגמא על תאים מתירנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו תאי Vero מצופים בצלחת 96 היטב ברורה התחתונה תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שmonolayers לפחות 95% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 25 μl של supernatant מדגם על תאי Vero זורעים בצלחות הלבנות מוקפות חומה. אל תעביר את supernatants לתוך 2 עמודים המיועדים לעקומות סטנדרטיים. הערה: ניתן לעשות זאת בו זמנית לכל הבארות בצלחת אחת באמצעות מטפל נוזלי 96 ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipettor מרובים ערוצים 8 או 12 ערוצים, להוסיף 25 μl של כל דילול של העקומה סטנדרטית מוכן בשלב 3 לתאי Vero ב2 עמודות מיועדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות צנטריפוגה במשך 5 דקות ב430 XG ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 שעות ב37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified. </li></ol> .5 הערכה של כדאיויות תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: כאשר החל מsupernatants התקבל מניסויי זיהום נעשו ב96-גם צלחות ברורות, כדאיות מדגם ניתן להעריך לפני כימות עם צבע מחוון כדאיות תא כגון resazurin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת resazurin בסכום השווה ל10% מההיקף בכל טוב של 96 גם הצלחת של דגימות המכילות וירוס ותאים. כולל תא רק שולט, כמו גם שליטה בתקשורת רק כדי לקבוע ערכים עבור 100% ו0 כדאיות% בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 2-4 שעה (זמן דגירה משתנה בהתאם לסוג תא ועל הריכוז של אבקה זמינה מסחרי או מחדש של הצבע), לקרוא ולהקליט את האות באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי (530-560 עירור, 590 פליטה). viabili התא דווחty למדגם על פי נוסחת פעילות = ((אות מבחן מדגם - אות בקרה שלילית) / (Cell לשלוט רק אות - אות בקרה שלילית)) יחסית מטבולית x 100% </li></ol> .6 הכנת מצע Luciferin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 דקות לפני סוף הדגירה 5 שעות, להכין את וציפרין כדי להשיג פתרון / מ&quot;ל ​​2 מ&quot;ג בתמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS). הכן 2.5 מ&quot;ל לכל צלחת בתוספת 2 מ&quot;ל נוסף. הגן על פתרון מהאור. הערה: וציפרין יכול גם להיות מוכן מוקדם יותר ביום ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li></ol> .7 קריאת פליטת אור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה 5 שעות, להוסיף 25 μl של וציפרין היטב בכל תאי Vero בצלחות מוצקות הלבנות. הוספת וציפרין באופן ידני או עם מתקן אוטומטי המשולב בluminometer. הערה: השימוש במכשיר עם נקודה אחת וסופו של דבר רק קוראת עשוי לדרוש תוספת של buf תמוגה התואם לוציפראזfer לפני הוספת מצע luciferin כדי לשפר את העקביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצלחות עם הפרמטרים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער במשך 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו הארה בערך רגישות / חשיפה קבועה מתאים. אם האפשרות זמינה במכשיר, להשתמש בריבוי נקודות קוראת (לדוגמא, 3 x 3 מטריצה) כדי לשפר את הדיוק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשומה ולשמור את עוצמת bioluminescent לכמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מתקן אוטומטי היה בשימוש כדי להוסיף luciferin לטהר את וציפרין וראש הקווים עם מים סטריליים חמים. </li></ol> ניתוח .8 נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תוצאות מדויקות, לפתור רגרסיה שאינה ליניארי כדי ליצור משוואת היל מהעקומות סטנדרטית. החל משוואה זו לדגימות titered לחשב יחידות ביטוי ויראלי. וירוסים או מצבים מסוימים עשויים לייצר עקומה סטנדרטית עם קשר לינארי; במקרה זה פתר למשוואה ליניארית. </li></ol>

<ol>
	<li>Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+titration+of+measles+and+other+viruses:+optimization+with+determination+of+replication+cycle+length.">Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length.</a> PLoS One. 6 (e24135), (2011).</li><li>Lizee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>McSharry, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uses+of+flow+cytometry+in+virology.">Uses of flow cytometry in virology.</a> Clin Microbiol Rev. 7, 576-604 (1994).</li><li>Watcharatanyatip, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecies+detection+of+antibodies+to+influenza+A+viruses+by+a+double-antigen+sandwich+ELISA.">Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA.</a> J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).</li><li>Dawson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Direct+Quantification+of+Viruses+in+Solution+Using+the+ViroCyt+Virus+Counter.">Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).</li><li>Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+and+RT-PCR:+true+or+false.">AAV and RT-PCR: true or false.</a> Mol Ther. 1, 389-390 (2000).</li><li>Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+infection+of+live+tissue+with+oncolytic+viruses.">Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses.</a> J Vis Exp. 52, (2011).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells.">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li><li>Green, M., Loewenstein, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adenoviruses:+propagation,+purification,+quantification,+and+storage.">Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage.</a> Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).</li><li>Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+purification,+and+in+vivo+testing+of+oncolytic+vesicular+stomatitis+virus+strains.">Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains.</a> Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals.">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li><li>Diallo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers.">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הגישה מבוססת לוציפראז המתואר כאן מספקת מספר היתרונות על פני שיטות קיימות אחרות, כוללים קלות, זריזות, צורך ציוד מינימאלי, ועלות נמוכה יחסית. גורם עיקרי בזה הוא ההימנעות מצעד דילול סדרתי. יחד עם זאת, נגזרים מבוססי דילול סדרתי של פרוטוקול זה בהחלט אפשריים והיו בשימוש לאחרונה להעריך titers אבולה להביע לוציפראז במסך אנטי תפוקה גבוהה 11. בעוד מטבעו זמן רב יותר ויקר יותר, עיבודים כזה עשויים לספק טווח דינמי גדול יותר לכימות נגיפית בעת צורך. בנוסף להיות גם מתאים במיוחד להערכת titers ויראלי בהקשר של מסכי תפוקה גבוהה, השיטה הנגיפית הכימות מבוסס לוציפראז צעד אחד שלנו יוצרת הערכות מדויקות של virions זיהומיות במקרה של שכפול וירוסים. יתר על כן, מונה המציין הארה, יחד עם נתונים רעילים מאותו הניסוי לתת יותרתמונה של ההשפעה של תנאי ניסוי על תאי יעד מלא, וזה שימושי במיוחד בהקשר של וירוסי oncolytic ומסכי סמים. הדוגמא מאוירת כאן משתמשת וירוס RNA משכפלים שלילי גדיל בודד; עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למספר משכפלים ולא משכפלים את וירוסים עם כמה התאמות פרוטוקול קטין. זה כולל וירוסי DNA כגון Vaccinia, HSV, וAAV (ראה איור 5). דגימות נגועות בוירוסים תאיים, כגון וירוס Vaccinia למשל, דורשות צעד שחרור וירוס לפני כימות (למשל, מחזור ההפשרה הקפאה לפחות אחד). כאשר מיישם את הטכניקה הזאת לוירוסים אחרים, יש צורך לייעל את זמן דגירה מהעברת supernatant או lysate הנגיפיים לקריאה של הצלחות על ידי luminometer. פרמטר זה יהיה תלוי בעיקר במחזור השכפול של הנגיף בתא הקו מתירני ואת כוחו של עמ &#39;romoter נהיגה ביטוי בלוציפראז. זה נעשה הכי טוב על ידי שימוש בעקומה סטנדרטית המלאה בצעד אופטימיזציה. כדי לעשות זאת, יש להדביק את שורת התאים מתירנית המתאימה עם משכפל שונים של העקומה סטנדרטית מוכנה ולקרוא כל לשכפל בכל פעם שונה מצביע הודעה העברה. באופן אידיאלי, נקודת זמן דגירה נבחרה שמובילה לקשר לינארי בין LOG (RLU) וLOG (כייל) פורש מגוון כייל המדגם הצפוי. לVSVΔ51-Fluc, זה בדרך כלל מ10 4 pfu / מ&quot;ל -10 7 pfu / מ&quot;ל לזמן דגירה 5 שעות. אם titers נמוך יותר או גבוה יותר צפויים מדגימות, אפשר פשוט להגדיל או להקטין את זמן הדגירה בהתאמה. לחלופין, דגימות עשויות להיות מדוללים ליפול בטווח הרבה כפי שנעשה בדרך כלל עבור ELISA. כפי שצוין לעיל, שיטה זו מתאימה גם לביצוע מסכי תרופת תפוקה גבוהה באמצעות ספריות סמים כמו רוב הצעדים יכולים להיות אוטומטיים. יכולים להיות מצופים תאים דוארfficiently באמצעות מתקן microplate אוטומטי, ספריית התרופה ניתן להוסיף באמצעות מטפל נוזלי 96 ערוצים, ניתן להוסיף וירוס באמצעות מתקן microplate וצלחות לקרוא באמצעות luminometer אוטומטי. בתאוריה, זה יכול גם להיות מותאם ל384 גם או פורמטים קטנים יותר; עם זאת, ההגבלה לשם כך הוא מספר התאים שיכולים להיות מצופה, תאים פחות נתונה מובילה למגוון צר יותר בליניאריות של LOG (RLU) לLOG מערכת יחסים (כייל). לבסוף, הערכה של כדאיות תא באמצעות resazurin או צבעים מטבולים אחרים ניתן לשלב בקלות בזרימת העבודה, המאפשר לאפליה של תרכובות רעילות לתאים במסכים אנטי או זיהוי של תרכובות שהובילו להרג סינרגיסטי בשילוב עם וירוסים 12. עם זאת, מגבלות של שיטה זו כוללות את הדרישה של וירוס transgene להביע לוציפראז, וזה לא תמיד אפשרי, ואת הזמינות של שורת תאים מספיק מתירנית. עם זאת, סביר להניח ניתן להתאיםהשיטה לשימוש עם גני כתב אחרים (למשל, GFP) בתנאים שיש שיטת כימות כתב ליניאריות מתאימה ויחס אות לרעש. בסך הכל, שיטת התפוקה גבוהה שתוארה יכולה להיות שונה כדי להתאים לוירוסים רבים ושונים ומותאם ליישומים מגוונים.

Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive &#8220;plaquing&#8221; cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9. 
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV&#8710;51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbeccos&#39; Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NorthBio Inc.</td>
			<td>NBSF-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:136px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HEPES</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP310-1</td>
			<td style="width:251px;">Prepare a&#160; 1mM solution, pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alamarBlue&#160;</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>BUF012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Luciferin potassium salt</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10101-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3917</td>
			<td style="width:251px;">384-well plates can also be used for higher throughput</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy Mx</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>SMTBL</td>
			<td>Monochromator microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquidator96</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>LIQ-96-200</td>
			<td>96 tip manual pipetting system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td style="width:136px;">LQR-200F</td>
			<td style="width:251px;">Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microflo</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>111-206-21</td>
			<td>Used to plate cells in a 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroskan Ascent FL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5210450</td>
			<td>Microplate fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput titration of luciferase-expressing recombinant viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

סיכום של העבודה המתארת ​​את שיטת התפוקה הגבוהה מתואר באיור 1. איור 2 מראה את התוצאות של עקומת סטנדרט טיפוסית ofVSVΔ51-Fluc. ארבעה פרמטר ניתוח רגרסיה שאינו ליניארי שנוצר עלילת היל שממנו pfu קלט לא ידועים (הערכה של כייל נגיף) יכולים להיות באינטרפולציה. ההערכה היא titers אלה מכונים יחידות ביטוי נגיפיות (VEU). איור 3 א מציג VEUs וtiters מתקבלים על ידי ביצוע assay פלאק סטנדרטי עם אותו הדגימות 10. דגימות שמקורם ניסוי שבו כימיקלים שונים המשמשים כדי לשפר את השכפול ואת ההתפשטות של VSVΔ51-Fluc ב786-0 תאים. VEUs אינטרפולציה מהעקומה סטנדרטית יש להכפיל בפקטור המבוסס על הדילול של supernatants המדגם מועבר לתאי Vero (במקרה זה, גורם לדילול הוא 5). קשר לינארי בין titers וVEU מוצג באיור 3 ב </strong&gt; עם ציון r של פירסון של .899 (p &lt;0.0001) R 2 של .8083 ו. באיור 4, נתונים cytotoxicity התא טיפוסיים המתקבלים מassay חילוף חומרים מוצגים ל786-0 תאים שטופלו בכימיקלים לפני הדבקה עם VSVΔ51-Fluc. לבסוף, איור 5 מראה עקומות טיפוסיות סטנדרטית שהושגו עם וירוסים שונים (וירוס הרפס סימפלקס (HSV), וירוס Vaccinia, וAdeno הקשורים וירוס (AAV), כל לוציפראז Firefly להביע) ומתאר פעמים דגירה ולהקפיא להפשיר מחזורים, כנדרש. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 זרימת עבודה של titering תפוקה גבוהה וירוס וassay cytotoxicity באמצעות VSV Δ 51-Fluc. (א) זרעים 2.5 x 10 4 תאי Vero לכל טוב (100 μl) ו לדגור על 37 ° C. (B) 24ההעברה מאוחר יותר לשעה 25 μl של עקומת סטנדרט לתאי Vero (2 עמודים לכל צלחת). העברה (C) 25 μl של דגימות להיות titered על תאי Vero שנותרו. הצלחות וצנטריפוגה לדגור על 37 מעלות צלזיוס. (ד) בסכום השווה ל10% מהנפח בבאר, להוסיף מגיב resazurin לצלחת המכילה את הדגימות המקוריות. דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס. (E) לאחר 3 שעות, לקרוא וקרינת שיא ולהעריך רעילה. (F) אחרי 5 שעות, להוסיף 25 μl של פתרון 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל של וציפרין היטב בכל תאי Vero. קראו הארה ולחשב יחידות ביטוי ויראלי. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 צפוי עקומה סטנדרטית של VSV Δ 51-Fluc. ביטוי לוציפראז- היה ליasured 5 העברת ההודעה supernatant שעה בחמש נקודות שונות בתוך גם באמצעות luminometer ופליטת האור באה לידי הביטוי בממוצע יחידות יחסי אור (RLU). אומר RLU היה להתוות נגד קלט ידוע pfu / מ&quot;ל ​​כדי לפתור את רגרסיה שאינה ליניארי וליצור משוואת היל. הממוצע של שתי עקומות לשכפל וברים שגיאה סטנדרטיים מוצג (r 2 = .9993). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 השוואה בין titers assay פלאק הסטנדרטי עם אלו המתקבלות בשיטת תפוקה גבוהה. () Titers ויראלי בpfu / מתקבל על ידי assay פלאק הסטנדרטי על תאי Vero הושוו עם titers מחושב נגיפי (VEU / מ&quot;ל) מאותו הדגימות titered באמצעות assay לוציפראז תפוקה הגבוהה. (ב) קשר לינארי בין מ&quot;ל VEU / מ&quot;ל וכייל להשיג באמצעות p הסטנדרטיassay laque. עקומת רגרסיה ליניארית ומקדם של נחישות (R 2) מוצגים. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 דוגמא כדאיות. כדאיות לדוגמא לפני העברת supernatant על ​​תאי Vero נקבעה על ידי הערכת פעילות המטבולית סלולרית באמצעות פתרון resazurin זמין מסחרי. ערכי הקרינה גלם היו מנורמלים לזה של בארות שלא טופלו, נגוע. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5 צפוי עקומות סטנדרטיים עם HSV, Vaccinia, ווירוסים AAV. ביטוי לוציפראז- נמדד בחמש נקודות שונות בתוך גם באמצעות luminometer ופליטת האור באה לידי ביטוי ברלה הממוצעתיחידות אור מופרזות (RLU). () העקומה סטנדרטית HSV נוספה על תאי Vero מצופה 24 שעות קודם לכן בצפיפות של 2.5 x 10 4 תאים לכל טוב (100 μl) ומדידת לוציפראז נעשתה העברת ההודעה supernantant 17 שעה (R 2 = .9489, N = 1). משוואת היל נוצרה על ידי פתרון רגרסיה שאינה ליניארי. העקומה סטנדרטית (B) Vaccinia נוספה על תאי Vero מצופה 24 שעות קודם לכן צפיפות של 2.5 x 10 4 תאים לכל טוב (100 μl) וטופחו במשך 2.5 שעה על 37 מעלות C, לאחר שמדידות לוציפראז נלקחו (R 2 = .9892). משוואה ליניארית נוצרה על ידי הפתרון לרגרסיה ליניארית. (C) AAV עקומה סטנדרטית נוספה על תאים אנושיים קרצינומה של ריאה (A549) מצופה 24 שעות קודם לכן בצפיפות של 2.5 x 10 4 תאים לכל טוב (100 μl) ומדידת לוציפראז נעשה 24 הודעה שעה זיהום. משוואת היל נוצרה על ידי פתרון רגרסיה שאינה ליניארי. הממוצעשל חמש עקומות לשכפל וברים שגיאה סטנדרטיים מוצגים (R 2 = .9926).

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses at JoVE.com

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

high-throughput-titration-of-luciferase-expressing-recombinant-viruses

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  Ottawa Hospital Research Institute. This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Video: High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...