העבודה נתמכת על ידי פרס מכון לפיתוח מבית החולים לילדים של פילדלפיה.

1. הכרומטין חוצה קישור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בתרבית תאי 100x20mm מנות. כמות התאים יכולה לנוע בין 1 ל -10 מיליון תאים לכל מנה בהתאם לסוג התא. כ -2 מיליון תאים מספיקים לimmunoprecipitation אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צולבות קישור בפורמלין 1% למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר עם נדנדה מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את הצלב מקשר על ידי הוספת ריכוז סופי של 125 מ&quot;מ גליצין ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם פוספט 1X שנאגרו מלוח (PBS) פעמיים, למזוג PBS, ולאחר מכן להוסיף 0.2 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים עם מגרד תא פלסטיק לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים ב 2000 סל&quot;ד במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. תאי Resuspend במאגר תמוגה SDS (1% SDS, EDTA 10mm, 50mm טריס-HCl pH 8.1) לכל תא lysate או לשמור אותם כגלולה להפקת נשק גרעיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לשמור תאים ב -80 ° C, או אחד יכול להמשיך immediatאיליי עם sonication. </li></ol> 2. הכן את הגרעינים (המשך שלב 3.5 לlysate תא השלם) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים את מאגר תמוגה סלולרי (5 מ&quot;מ pH 8.0 צינורות, 85 מ&quot;מ KCl, 0.5% NP-40) עם 1X אינהיביטור proteinase כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מופשר תא גלולה בכ 10 פעמים בנפח גלולה עם הצפת תמוגה תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dounce-Homogenize 10 פעמים עם העלי אז לדגור על קרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב -4,000 סל&quot;ד במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך supernatant, ולשמור גלולה גרעינית. </li></ol> 3. Sonication * <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את מאגר תמוגה SDS וסכום תוספת של חיץ לשימוש עם מעכבי proteinase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גרעינית גלולה בSDS תמוגה המאגר (כ 0.5 מ&quot;ל של חיץ ל1-10,000,000 תאים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על קרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל aliquots של דגימות לצינורות microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate על קרח רטוב באמצעות sonicator Misonix עם 30 שניות על 45 שניות וליד הגדרת משרעת של 2. מספר המחזורים לגודל שבר אידיאלי ניתן לקבוע על ידי ראשון שניסה את מספרים שונים (מחזור 2 שמ &#39;, 4, 8, 12, 16, 20 או יותר ומחזורים). מותג של sonicator שונה עשוי לשמש, לעומת זאת, התנאים ישתנו. ניסויים עם מספר המחזורים ואת כמות זמן וכיבוי חייבים להתבצע על מנת לקבוע את התנאים אידיאליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 20 μl של כל דגימה כדי לבדוק את תוצאות sonication ולעשות כימות,. שאר המדגם ניתן לאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את 20 μl של מדגם על ידי הוספת 30 μl של הצפת TE 0.1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את המדגם עם μl 1 של RNase על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ולאחר מכן להוסיף μl 1 של proteinase K ו לדגור על 62 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוץ 20 μl של המדגם על 2% ג&#39;ל agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הסכום הנותר של מדגם עם ערכת טיהור PCR QIAquick אז לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. </li></ol> * לצ&#39;י המקוריP, עיכול nuclease microccocal ניתן להשתמש לחלופין גזירת ה-DNA. 4. חרוזים agarose לחסום * <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חרוזים כבר חסומים, המשך לשלב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחלבון או חלבון G agarose. במשך 5 immunoprecipitations (IPS), השתמש ב600 μl של 50% חרוז תרחיף (300 μl חרוז גלולה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשטוף את החרוזים, לסובב אותם ב 800 סל&quot;ד דקות 1 על 4 מעלות צלזיוס וזורקים supernatant. הוסף מעט יותר מ -2 חיץ דילול שבב מ&quot;ל (0.01% SDS, EDTA 1.2 מ&quot;מ, 167 מ&quot;מ NaCl, 1.1% טריטון X-100, 16.7 מ&quot;מ טריס-HCl pH 8.1) ומערבב על ידי לאט צינור היפוך 10X. ספין למטה שוב ב800 סל&quot;ד דקות 1 על 4 מעלות צלזיוס וזורקים supernatant. חזור על לשטוף פי 2 יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את חרוזים על ידי סיבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בחסימת פתרון. עיין בטבלה 1 למתכון של פתרון החסימה. </li></ol> 5. הכרומטין מראש ברור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו sonicated הכרומטין על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה בסל&quot;ד ו 12,000או 10 דקות ב 4 ° C ואז לשים על קרח מייד כדי להסיר SDS (לבן גלולה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant, להשליך גלולה, ולשלב דוגמאות במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את הסכומים דרושים לצורך הניסוי המבוסס על חישובים (1-10 UG של הכרומטין ל-IP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל הכרומטין 10X בחיץ דילול שבב בתוספת מעכב proteinase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של חרוזים חסומים ל-IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li></ol> 6. Immunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה דגימות ב 800 סל&quot;ד דקות 1 ולהעביר את supernatant לצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה supernatant ב 800 סל&quot;ד דקות 1 והעברה לצינור נקי אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסוך 20 μl של supernatant, לשמש כשליטת קלט, ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot הכרומטין למספר כתובות IP שצריך לעשות בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 UG של נוגדן לUG 1-10 של הכרומטין לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה 4 ° C עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של חרוזים חסומים לכל דגימת ה-IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה החרוזים על ידי שצנח ב 800 סל&quot;ד דקות 1 ולבטל כמה שיותר את supernatant ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעם עם חיץ לשטוף קומפלקס חיסוני דל מלח. הוסף 1 מ&quot;ל של חיץ לכל צינור, לסובב בטמפרטורת חדר למשך 5-8 דקות, ספין למטה בסל&quot;ד 800 דקות 1, ולאחר מכן להשליך supernatant. חזור על לשטוף פעם עם חיץ גבוה מלח חיסוני קומפלקס לשטוף ולשטוף חיץ קומפלקס חיסוני LiCl ופעמים עם חיץ TE עבור סכום כולל של 5 כביסות (טבלה 2). </li></ol> 7. Elution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות קלט להפשיר מהיום קודם לכן כדי להיות מעובד עם eluants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך Elution הצפת טרי (טבלה 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את תערובת הורים של ההצפה elution מספיק נחוצה לשב&quot;ס ודגימות בקרת קלט בתוספת 1-2 דוגמאות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 ההצפה elution μl לכל דגימת ה-IP ולדגור על טמפ &#39;החדר למשך 15 מ&#39;בעם סיבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה בסל&quot;ד 800 דקות 1 ולהוסיף supernatant לצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl נוסף של הצפת elution על צינור אחד של חרוזים ולדגור על טמפ &#39;החדר במשך 15 דקות עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במשך 15 שניות לאחר דגירה; ספין למטה ב 5000 סל&quot;ד דקות 1, ולאחר מכן לשלב את supernatant עם supernatant מelution הראשון. (ודא שאין חרוזים שנשארו בsupernatants. אם אינך בטוח, ספין למטה supernatant שוב ב 5000 סל&quot;ד דקות 1 ולאסוף את supernatant בצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 180 μl של ההצפה elution ל20 μl של דגימות בקרת קלט. </li></ol> 8. היפוך חוצה קישור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לμl 200 של eluants ובקרות קלט, להוסיף 8 μl של 5 M NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות חותם עם parafilm ודגירה באמבט מים ב 65 ° C במשך הלילה. </li></ol> 9. טיהור ה-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בכל דגימה עם μl 1 של RNase עבור שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μl של 0.5 M EDTA, 8 1M μl טריס-HCl, לערבב, ואז להוסיף μl 1 של proteinase K לכל דגימה ולדגור על 45 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הדגימות באמצעות ערכת טיהור PCR QIAquick. ניתן לשמור את הדגימות ב -20 ° C ו-PCR בדיקה יכולה להיעשות במועד מאוחר יותר. </li></ol> * לחלופין, חרוזים מגנטיים שבב כיתה ניתן להשתמש במקום של agarose עבור חלק immunoprecipitation. 10. סימון ה-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקת PCR, השתמש פריימרים לאזורים ידועים להיות מחויבים לחלבון של עניין. כמו כן, השתמש פריימרים לאזורים בלתי מחייבים כביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את חומרים כימיים לתגובה. לדלל מדגם קלט ב1:100 (טבלה 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תגובה. תכנית ה-PCR: </li></ol> שלב 1: 94 ° C 3 דקות שלב 2: 94 מעלות צלזיוס 20 שניות 59 ° C 30 שניות 72 ° C 30 שניות (חזור על שלב 2 עבור לפחות 30 cycles) שלב 3: 72 מעלות צלזיוס 2 דקות <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל דוגמאות על 1% agarose ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העשרה גם ניתן לקבוע כמותית עם PCR בזמן אמת. </li></ol>

<ol>
	<li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li><li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+STAT+nuclear+traffic.">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li><li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors.">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li><li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages.">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li><li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+message+across,+STAT!+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit.">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li><li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stats:+multifaceted+regulators+of+transcription.">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li><li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+re-sequencing.">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 16, 545-552 (2006).</li><li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes.">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li><li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes.">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14,000+cases+of+seven+common+diseases+and+3,000+shared+controls.">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li><li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels.">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li><li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes.">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li><li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants.">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li><li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes.">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li><li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations:+The+DiaGen+Consortium.">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li><li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCF7L2:+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA.">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li><li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+TCF7L2.">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li><li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+suspect:+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk.">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li><li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells.">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li><li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+TCF-4+gene+(TCF7L2)+to+human+chromosome+band+10q25.3.">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li><li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer.">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li><li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling.">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li><li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

עכשיו זה אפשרי לבצע את פרופיל הגנום של עמותת אינטראקציות חלבון דנ&quot;א באמצעות שבב ואילך, כפי שהודגם לאחרונה עם גורמי שעתוק אחרים 2,3. המפתח לתוצאה מוצלחת הוא רצף של דור תבנית immunoprecipitation הכרומטין באיכות גבוהה ה-DNA. ברגע שתבנית ה-DNA כבר נוצר והוברר להיות מועשרים במידה מספקת, ואז אחד יכול לקחת את זה בספריית הכנה עבור סידור שלאחר מכן. לדוגמה, ניתן להשתמש בפרוטוקול ספריית הרצף מסופק על ידי הספק, Illumina. בחירת הגודל של ספרייה זו יכולה להתבצע על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה וכריתה שלאחר מכן וטיהור של ה-DNA ב~ 200 - לטווח של 700 נ&quot;ב. הקטנת הגודל וצמצום טווח הגודל של DNAs שנאסף מטיהור ג&#39;ל נועד לשפר את הרזולוציה של מיקומית שבב ואילך. על ידי העשרה לחתיכות קטנות יותר של דנ&quot;א הקלט מאוגד לגורם של interest, ניתן היה לצפות שמיקום האתר יקבל החלטה. בחירת גודל הדוקה יותר גם משפרת את אחידות הגודל של מושבות מולקולריות המיוצרות על פלטפורמת Illumina. אחידות גודל מושבה כזו גם מגדילה את מספר הקריאה היעיל שהושג. גודל ה-DNA קלט קצר יותר גם מייצר מושבות חזקות יותר על פלטפורמת Illumina, וזה כנראה אומר שחלקי DNA קצרים יותר בתוך כל חלוקה מדגם קלט נתון יהיו מיוצגים בצורה יעילה יותר ברצף הפלט הסופי הן קלט מחתיכות ארוכות יותר מאותה ההתפלגות. הגישות לניתוח bioinformatic רצף &quot;דור הבא&quot; ממשיכות להתפתח, עם ספקים רבים שהופכים את התוכנה שלהם בקוד פתוח לחידוד נוסף. אפשר לשנות את המפה שקוראה למקומות גנומית ייחודיים לתוך פרופיל חפיפה קטע DNA. ניתן לזהות על ידי פרופילי threshholding פסגות משמעותיות בגובה שווה ערך לשיעור גילוי משוער שווא. SP העמדהמטריצות תדר ecific הנגזרות מעבודה זו יכולות לשמש כדי לזהות ולמקם אתרי קישור DNA בגנום האנושי לגורם נתון. אבל צריך להיות זהיר לגבי מה הגורם אחד רוצה ללמוד עם שבב ואילך. לפני היציאה למחקר אחד כזה צריך להעריך אם נוגדן הוא זמין בשוק כי הוא שמיש בהגדרת השבב, כנוגדן עני יכול להיות השפעות מזיקות על אחד מאוד של תוצאות ניסוי. בנוסף, יש לשקול אם יש isoforms האחו של החלבון הנחקר, ואכן, TCF7L2 ידוע יש isoforms רבים כל כך שהיינו זהירים במיוחד בבחירת נוגדן שקשר לחומצות אמינו בהווה באופן עקבי בכל isoforms העיקרי של גורם שעתוק זה 25. לסיכום, שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות אינטראקציות-DNA חלבון ברקמה מסוימת או גקו ell. נציין כאן איך ליצור תבנית שבב באיכות גבוהה עבור סידור שלאחר מכן.

במשך שנים רבות יש כבר צורך מסופק לזהות הסט של גנים כפותים ומוסדרים על ידי חלבון נתון הגנום רחב, במיוחד אלה בכיתה גורם שעתוק. אודום et al. 1 משמש הכרומטין immunoprecipitation (שבב) בשילוב עם microarrays האמרגן לזהות באופן שיטתי את הגנים שנכבשו על ידי רגולטורים תעתיק שהוגדרו מראש בכבד האנושי ואיי לבלב. כתוצאה מכך, ג&#39;ונסון ואח&#39;. 2 פיתחה assay immunoprecipitation הכרומטין בקנה מידה גדולה המבוסס על רצף ישיר אולטרה תפוקה גבוהה DNA (שבב ואילך) על מנת למפות באופן מקיף אינטראקציות-DNA חלבון על פני הגנום כולו יונקים. כמקרה מבחן, הם מיפו in vivo המחייב של הגורם מגביל משתיק נוירון (NRSF) עד 1946 מקומות בגנום האנושי. הנתונים מוצגים ברזולוציה חדה של עמדה מחייבת (+ 50 זוגות בסיסים), שאפשרה גם ליsolation של מוטיבים וזיהוי של מוטיבים NRSF מחייבים. גם היו נתונים שבב seq אלה רגישות גבוהה וספציפיות וביטחון סטטיסטי (p -4 &lt;10), תכונות שחשובות להסקת מסקנות אינטראקציות מועמד חדשה. רוברטסון et al. 3 משמשים גם שבב ואילך על מנת למפות STAT1 מטרות באינטרפרון-γ (IFN-γ) מגורה וunstimulated תאי S3 הלה אדם in vivo. על ידי שבב ואילך, באמצעות 15.1 ו12.9 מיליון רצף ממופה ייחודי קורא, ושיעור גילוי שקר משוער של פחות מ 0.001, הם זיהו 41,582 11,004 ואזורים STAT1 מחייבים משוערת בתאי מגורה וunstimulated, בהתאמה. מ -34 הלוקוסים ידועים STAT1 4-8 אתרי קישור אינטרפרון מגיבים, שבב אילך מצא 24 (71%). מטרות שבב seq היו מועשרים ברצפים דומים לSTAT1 מוטיבים מחייבים ידועים. השוואות עם שני נתונים שבב ה-PCR קיימים מגדירה הציעושרגישות שבב אילך הייתה בין 70% ו 92% וסגוליות היה 95% לפחות. בנוסף, היה ברור שהשבב ואילך מציע גם מורכבות אנליטית נמוכות ורגישות שעולות עם רצף עומק. כמו טכנולוגיות רצף הגנום כגון, &quot;הדור הבא&quot; לספק 1-2 סדרי גודל גידול בסך של רצף שיכול להיות זולה ויעיל שנוצר על פני טכנולוגיות ישנות 9. שיטות שבב seq לכן ישירות לספק כיסוי הגנום כולו לאפיון יעיל של אינטראקציות-DNA חלבון 3 יונקים. בשנת 2006, קשר חזק של גרסאות בגורם השעתוק דמוי 7 2 (TCF7L2) גן עם סוכרת מהסוג 2 התגלה 10. חוקרים אחרים כבר משוכפלים באופן עצמאי את הממצא הזה בקבוצות אתניות שונות ומעניין, מן הגנום מחקרי העמותה הרחב הראשונים של סוכרת מהסוג 2 שפורסמו בכתב עת Nature 11,12 </sעד&gt;, מדע 13-15 ובמקומות אחרים 16,17, הקשר החזק ביותר אכן היה עם TCF7L2, זה נחשב כיום הממצא הגנטי המשמעותי ביותר בסוכרת מהסוג 2 עד כה 18-20. בנוסף, TCF7L2 נקשר לסיכון לסרטן 21,22, ואכן, הקשר הזה היה ברור יותר, כאשר מוקד 8q24 מתגלה על ידי מחקרי עמותה רחבות הגנום של מספר סוגי הסרטן, כולל קרצינומה של מעי גס, הוצג להיות בשל הזרם קיצוני אלמנט TCF7L2 מחייב נהיגה השעתוק של MYC 23,24. ככזה, יש עניין רב בקביעת גנים במורד הזרם מוסדרים על ידי גורם שעתוק זה מפתח. בהתבסס על ניסיון של עם TCF7L2 כדוגמה למתודולוגיה, מאמר זה מתאר כיצד ליצור תבנית ה-DNA שבב באיכות גבוהה. צ&#39;יפ היה מתבצע בשורת תאי סרטן המעי הגס, HCT116, עבור סידור שלאחר מכן על מנת לבנות גבוה Resolמפת ution מהגנים מאוגדים על ידי TCF7L2 25 במאמץ להניב תובנה נוספת לתפקיד המרכזי שלה בפתוגנזה של תכונות מורכבות.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

שבב רצף (Chip-אילך) שיטות להציע ישירות כיסוי הגנום כולו, שבו שילוב של הכרומטין immunoprecipitation (שבב) ויכול להיות מנוצל רצף מקביל מסיבי כדי לזהות את הרפרטואר של רצפי DNA יונקים מאוגדים על ידי גורמי שעתוק in vivo. &quot;דור הבא&quot; טכנולוגיות רצף הגנום לספק 1-2 סדרי גודל גידול בסך של רצף שיכול להיות זול ויעיל שנוצר על פני טכנולוגיות ישנות יותר ובכך מאפשר לשיטות שבב seq כדי לספק כיסוי הגנום כולו ישירות לפרופיל יעיל של יונקים אינטראקציות חלבון ה-DNA. למוצלחים שבב seq גישות, צריך ליצור תבנית ה-DNA שבב באיכות גבוהה כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר רצף. התיאור מבוסס סביב ניסיון עם מוצר החלבון של הגן הכי חזק מעורבים בפתוגנזה של סוכרת מסוג 2, כלומר גורם שעתוק גורם השעתוק דמוי 7 2 (TCF7L2). גורם זה גם היה מעורב בסוגים שונים של סרטן. התווה הוא איך ליצור תבנית ה-DNA שבב באיכות גבוהה הנגזרת משורת תאי קרצינומה של המעי הגס, HCT116, על מנת לבנות את המפה ברזולוציה גבוהה באמצעות רצף כדי לקבוע את הגנים מאוגדים על ידי TCF7L2, נותן תובנה נוספת לתפקיד המרכזי שלה בפתוגנזה של תכונות מורכבות.

ברגע שהכרומטין כבר sonicated וטופל עם RNase וproteinase, הדגימות לרוץ על 2% ג&#39;ל agarose צריכה להציג למרוח עם חלק הארי של ה-DNA בגודל הרצוי. אם מספר מחזורים שונים נבדקים, ירידה הדרגתית בגודלו יש לראות במספר מחזורי הגידול (איור 2). לאחר שסיים את חלק immunoprecipitation של הפרוטוקול או ניתן לבדוק את ההעשרה על ידי PCR או PCR בזמן אמת. לקבלת דוגמיות PCR לרוץ על ג&#39;ל agarose צריכה להיות בלהקות הקלט והשבב (באמצעות נוגדן לחלבון של עניין, שהוא TCF7L2 במקרה זה) לדוגמה נתיבים ולא שום דבר או לכל היותר, להקה קלושה מאוד (רעש רקע) ב נתיב ביקורת (שלילי) IgG לאזור המחייב החיובי. לאזור המחייב השלילי לא צריכה להיות מאוד קלוש, אם בכלל, להקה לשליטה IgG ונתיבי שבב. לא צריך להיות להקה בנתיב הקלט (איור 3). <html> איור 4 מראה את אותן דגימות שנבדקו על ידי בזמן אמת PCR. כמו עם הדמות הקודמת, לא אמורה להיות העשרת קיפול משמעותית של האזור מחייב החיובי לדוגמא השבב על שליטת IgG. כמו כן, לא אמורה להיות העשרה מעט מאוד, אם בכלל, ראתה באזור מחייב השלילי. <img src="/files/ftp_upload/50286/50286fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50286/50286fig1highres.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה של תהליך שבב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50286/50286fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50286/50286fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. ג&#39;ל לבדוק sonication של ה-DNA. &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50286/50286fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. בדוק PCR של שבב. <img src="/files/ftp_upload/50286/50286fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. Real-Time PCR של TCF7L2 שבב. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> נפח </td></tr><tr><td> חרוז גלולה </td><td> 300 μl </td></tr><tr><td> ארגון ה-BSA (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> 30 μl </td></tr><tr><td> אינהיביטור proteinase 100X </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> חיץ דילול שבב </td><td> 660 μl </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 1,000 μl </td></tr></tbody></table> טבלת 1. מתכון לחסימת agarose. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חוצץ </td><td> רכיבים </td&gt; </tr><tr><td> הצפת לשטוף קומפלקס חיסוני דלת מלח </td><td> 0.1% SDS 1% טריטון X-100 2 מ&quot;מ EDTA 20 מ&quot;מ טריס-HCl pH 8.1 150 מ&quot;מ NaCl </td></tr><tr><td> הצפת לשטוף קומפלקס חיסוני מלח גבוה </td><td> 0.1% SDS 1% טריטון X-100 2 מ&quot;מ EDTA 20 מ&quot;מ טריס-HCl pH 8.1 500 מ&quot;מ NaCl </td></tr><tr><td> הצפת לשטוף קומפלקס חיסוני LiCl </td><td> 0.25 מ &#39;LiCl 1% NP-40 1% Deoxycholate 1 mM EDTA 10 מ&quot;מ טריס-HCl pH 8.1 </td></tr><tr><td> TE חיץ </td><td> 10 מ&quot;מ טריס-HCl pH 8.1 1 mM EDTA pH 8.0 </td></tr></tbody></table> טבלת 2. מאגרים לשטוף שבב. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> נפח </td></tr><tr><tד&gt; 20% SDS מאגר </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 1 M NaHCO 3 </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 170 μl </td></tr></tbody></table> לוח 3. מאגר elution לIP אחת. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> 50 תגובת μl </td><td> 20 תגובת μl </td></tr><tr><td> מים </td><td> 27 μl </td><td> 10.8 μl </td></tr><tr><td> מאגר תגובת PCR 5X </td><td> 10 μl </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 4 μl </td><td> 1.6 μl </td></tr><tr><td> dNTP (10 מ&quot;מ) </td><td> μl 1 </td><td> 0.4 μl </td></tr><tr><td> לערבב פריימר (5 אום כל אחד) </td><td> 2 μl </td><td> 0.8 μl </td></tr><tr><td> תקי (Promega Hotstart) </td><td> &lt;Μl 1/ P&gt; <td> 0.4 μl </td></tr><tr><td> ה-DNA השבב </td><td> 5 μl </td><td> 2 μl </td></tr></tbody></table> לוח 4. כרכי תגובת PCR.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq at JoVE.com

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

generation-high-quality-chromatin-immunoprecipitation-dna-template

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

24.3K Views.  Children's Hospital of Philadelphia Research Institute. שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

Video: Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

שיטות ששונו לטעינת לוחות מיצוי DNA בתפוקה גבוהה להפחית את הפוטנציאל לזיהום

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...