המחברים מבקשים להודות Viksø-נילסן (Novozymes) על המתנה של האנזימים cellulolytic. עבודה זו מומנה על ידי חידוש FP7 ועל ידי פרויקטים BBSRC BB/G016178 ו BB/G016194.

1. הכנת הדגימות בדרך כלל אנחנו עובדים עם נובעת עשבוניים או צמחים עציים. במקרה של חומרים עשבוניים אנו גדלים הצמחים לפדיון, לאחר התפתחות הזרע שאנו אוספים נובעת יבש פעם הזדקנות תושלם. נובעת הן קצוץ לתוך 4 חלקים מ&quot;מ להציב 2 בקבוקוני מ&quot;ל עם שלושה כדורים כרסום. במקרה של חומרים וודי, הדגימות הם הקרקע נסורת גס עם קובץ עץ כמובן ולאחר מכן להציב טחנת כדור לעיבוד נוסף. דגימות ממוקמות במעמד בתוך שחיקה / עיצוב התחנה (איור 1). תחנה זו ברצף טוחן, מערבב, ושוקל כל המדגם. מספר החזרות הדרוש לדגימה היא הוקמה על ידי בדיקת חומר הקרקע בסדרה של ניסויים ראשוניים בהם השתנות פנימי בגודל חלקיק מסוים נקבע. 2 בקבוקוני מ&quot;ל הם דקרו בתחתית ואת החומרים לוותר על הרטט של הבקבוקון על כן נבחר. הזרוע רוטט נשלטת על ידי משוב מן האיזון המאפשר מחלק מדויקת של אבקה. הרובוט dispenses 4 מ&quot;ג / גם בניתוח רגיל 4 חזרות יש צורך ברוב המקרים. זה מאפשר 20 דגימות צמח / צלחת להיות מנותח. 2. Pretreatment לאחר דגימות מעוצבות, הצלחות 96-מעובדים היטב על ידי מערכת טיפול אוטומטי נוזלי (איור 2). הנה המקדים קלה מתבצע על ידי הוספת חומרים צמח 350 μL של חומצה או אלקליין פתרונות וחימום את הצלחת על גוש מותאם. כדי למנוע אידוי במהלך הניתוח, 96 צלחות חתומות היטב עם מאט סיליקון. הטמפרטורה וזמן טיפול מקדים יכול להיות שונה על פי החומרים הנלמד. הטמפרטורה המקסימלית, לעומת זאת, היא 100 ° C. הליך חלופי לבדיקה pretreatments קשים היא pretreat החומרים מעל הקו ולבטל את pretreatmet מן התהליך. 3. הידרוליזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי החומרים הם pretreated, הרובוט מסיר אוטומטית את הפתרון המקדים, ושוטף, כל הבארות, 5 פעמים עם 850 μL הצפת Acetate 25 מ&quot;מ. שטיפות מתבצעת על ידי הוספת מאגר לפתרון לפני הטיפול, ולאחר מכן הסרת 50% מהנפח הכולל לאחר המאפשר מוצקים במדגם להתיישב. גובה השאיפה מוגדר מחצית מסת הנוזל, כדי למנוע aspirating מוצקים מתחתית הבאר, יש הפסד זניח של מוצקים באמצעות גישה זו. אחרי אלו רוחץ את ה-pH בבאר הוא 4.5 ואת החומר מוכן הידרוליזה אנזימטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת המכילה אנזים פתרון של cellulases ו hemicellulases נוסף על ידי הרובוט. לתוך כל טוב, 850 μL של תערובת האנזים הוא חילק את צלחת מועבר לתוך 50 ° C רועד חממה. הידרוליזה הסטנדרטי הוא ביצע עבור 8 שעות, אבל הפעם יכול להיות מותאם לצורך הניסוי. טעינת אנזים הסטנדרטית המשמשת עבור עשבים הוא 7 FPU / g של חומר. </li></ol> 4. איתור של הפחתת סוכרים קביעת הפחתת סוכרים שוחרר לאחר הידרוליזה בוצעה באמצעות שונה 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) שיטה 3. MBTH נבחרה השיטה המתאימה ביותר כי זה היה הכי קל להפוך את רגישים פחות להפרעות תרכובות כגון חלבונים. שינינו את השיטה רגישה מאוד לשימוש בפלטפורמת רובוטית, כך שזה יכול לכמת במדויק את ריכוזי סוכרים נוכח hydrolysates ביומסה, עם נפח סופי של 250 μL אשר מתאים צלחת תקן 96 אופטי טוב. כל הפעולות הבאות נעשות באופן אוטומטי ושלושה קביעות עצמאית של הפחתת סוכרים בוצעו עבור כל תגובה saccharification. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 μL של hydrolyzate נלקח הצלחת היטב עמוקה מהולה μL 45 של 25 חיץ נתרן אצטט מ&quot;מ צלחת עקפה 96 PCR היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 μL של NaOH 1N ו - 50 μl של תמיסה המכילה 0.43 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​MBTH ו 0.14 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DTT נוספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ערבוב, הצלחת PCR היה מחומם על 60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ב thermocycler או מכשיר דומה אשר מספקת בדיוק את אותה כמות של חום לכל 96 בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובה וכתוצאה מכך הועבר צלחת אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של מגיב oxidising (0.2% FeNH4 (SO4) 2, Sulfamic Acid 0.2% ו 0.1% HCl). מערבבים היטב ולהשאיר לפתח לפחות 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלחת כל צריך להכיל גם תגובות תקן של 50 nmol, 100 ו - 150 nmol גלוקוז nmol. הצלחות אופטיים לקרוא 620 ננומטר. </li></ol> 5. נציג תוצאות: דוגמאות לסוגים שונים של ניתוחים מוצגות באיור 3 ו -4. כל התוצאות התקבלו באמצעות פלטפורמה אוטומטית. איור 3 מחדשמציג את העלייה הפחתת סוכרים שפורסמו על ידי 8 incubations h מ צפצפה הקרקע עם כמויות גדלות והולכות של אנזימים cellulolytic. איור 4 מציג את ההשפעות של חומצה המקדים אלקליין על דגימות צפצפה. טיפול מקדים NaOH הוא יעיל יותר כי המקדים בדילול H2SO4 בקידום שחרורו של סוכרים במהלך הידרוליזה. הסכום של סוכרים נמדד לאחר הידרוליזה פוחתת כאשר המקדים מבוצע באמצעות ריכוזים גבוהים יותר מאשר NaOH 1M. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. לתחנת רובוטית עבור שחיקה 96 עיצוב טוב של ביומסה <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. לתחנת טיפול נוזלי עבור ניתוח תפוקה גבוהה saccharification <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. השפעת מקדמי אנזים שונה על שחרורו של הפחתת שווי סוכר ממדגמים צפצפה <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. השפעת pretreatments שונים saccharification של דגימות צפצפה. סוכרים א שוחרר לאחר pretreament עם אחוזים שונים של H2SO4 על 90 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. B. סוכרים שוחרר לאחר pretreatments NaOH בטמפרטורת הזמן אותו מאשר המקדים את החומצה .

<ol>
	<li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses.">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li><li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass:+the+writing's+on+the+walls.">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li><li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li><li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials.">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li></ol>

Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.
A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination4.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> גריסה &amp; במשקל רובוט </td><td> Labman אוטומציה </td><td></td></tr><tr><td> 2 מ&quot;ל שפופרת מיקרו עם כובעים </td><td> Sarstedt בע&quot;מ </td><td> 72.694 </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;מ פלדה חרוזים חלד </td><td> Qiagen בע&quot;מ </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1.2ml Abgene מרובע גם צלחות אחסון </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> טול 050-050C </td></tr><tr><td> Whatman כובע מחצלת עבור 96 צלחות טוב מרובע </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> Hanling נוזלי רובוט </td><td> טקאן גרופ בע&quot;מ </td><td> חופש Evo 200 </td></tr><tr><td> Sulphuric חומצה </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> BPE359-500 </td></tr><tr><td> נתרן אצטט </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S8750-500 גרם </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96 גם PCR צלחות חצאית מלאה </td><td> Sarstedt בע&quot;מ </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone מימה hydrochloride </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 129739-25 גרם </td></tr><tr><td> DL-dithiothreitol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D9163-1G </td></tr><tr><td> קורנינג microplate 96 קרקעית שטוחה טוב </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> TKT-521-050H </td></tr><tr><td> אמוניום ברזל (III) סולפט dodecahydrate </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> F1668-250 </td></tr><tr><td> Sulfamic חומצה </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 242772-500 גרם </td></tr><tr><td> חומצת כלור </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

high-throughput saccharification assay for lignocellulosic materials

סוכרים שמרכיבים ביומסה במפעל lignocellulosic יכול להיות שבור למטה כדי לייצר מגוון של סוכרים, כי לאחר מכן ניתן להשתמש הקמת biorefinery. אלה חומרי הגלם יהווה פלטפורמה התעשייה החדש, שהוא גם בר קיימא פחמן ניטרלי, כדי להחליף את התלות הנוכחי על דלק מאובנים. סרבנות על הדקונסטרוקציה שנצפתה חומרים lignocellulosic מופק על ידי מספר מאפיינים מהותיים של קירות תא הצמח. תאית הקריסטל מוטבע סוכרים כגון מטריקס ו xylans arabinoxylans, ואת המבנה כולו עטוף על ידי פנוליות הפולימר ליגנין, שהוא גם קשה לעיכול 1. כדי לשפר את העיכול של חומרי הצמח אנחנו צריכים לגלות את צווארי הבקבוק העיקריים saccharification של קירות התא וגם מוטציה מסך אוכלוסיות הרבייה להעריך את משונות saccharification 2. משימות אלה דורשות גישה תפוקה גבוהה וכאן אנו מציגים פלטפורמה אנליטית כי ניתן לבצע ניתוח saccharification בפורמט 96-היטב צלחת. פלטפורמה זו פותחה כדי לאפשר את הקרנת העיכול lignocellulose של אוכלוסיות גדולות של מיני צמחים שונים. יש לנו scaled למטה הכרכים תגובה עבור המקדים עדין, הידרוליזה אנזימטית חלקית ונחישות סוכר, כדי לאפשר במספרים גדולים כדי להעריך במהירות מערכת אוטומטית. זו פלטפורמה אוטומטית עובדת עם כמויות מיליגרם של ביומסה, ביצוע כרסום כדור בתנאים מבוקרים כדי לצמצם את חומרי צמח לגודל החלקיקים סטנדרטית באופן לשחזור. לאחר הדגימות הם הקרקע, הרובוט עיצוב אוטומטי dispenses הסכומים שצוינו נרשם חומר לתוך בארות המקביל צלחת 96 באר עמוקה (איור 1). בדרך כלל, אנו מחלקים את אותו חומר תוך 4 בארות יש 4 משכפל לניתוח. לאחר הצלחות מלאים בחומר צמח בפריסה הרצויה, הם מועברים באופן ידני לתחנת טיפול נוזלי (איור 2). בתחנה זו הדגימות כפופים המקדים קלה עם חומצה או לדלל או אלקליין מודגרות בטמפרטורות של עד 90 ° C. הפתרון המקדים יוסר לאחר מכן את הדגימות שטפה עם חיץ להחזיר אותם pH מתאים הידרוליזה. הדגימות מודגרת מכן בתערובת אנזים לאורך זמן משתנה של 50 ° C. Aliquot נלקח hydrolyzate לבין הפחתת סוכרים נקבעים באופן אוטומטי על ידי שיטת colorimetric MBTH.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials at JoVE.com

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

שיטה פשוטה, מהירה לקביעת פוטנציאל saccharification של מספר גדול של דגימות ביומסה הצמח מתואר. הפלטפורמה אוטומטיים לניתוח זה כרוך בהכנה של ביומסה הצמח לניתוח ב 96 צלחות היטב את הביצועים הבאים של הידרוליזה המקדים, וכימות של סוכרים שוחרר.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

high-throughput-saccharification-assay-for-lignocellulosic-materials

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K Views.  University of York. שיטה פשוטה, מהירה לקביעת פוטנציאל saccharification של מספר גדול של דגימות ביומסה הצמח מתואר. הפלטפורמה אוטומטיים לניתוח זה כרוך בהכנה של ביומסה הצמח לניתוח ב 96 צלחות היטב את הביצועים הבאים של הידרוליזה המקדים, וכימות של סוכרים שוחרר.

Video: High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...