The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

הערה: זה קריטי כדי לשמור על תנאי RNase ללא במהלך ההליך כולו. 1. Adenylation של 3 &#39;לינקר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל oligonucleotide DNA המיועד לתגובות קשירה &#39;3 עד 100 מיקרומטר בH nuclease ללא 2 O. הערה: oligonucleotide צריך &#39;קבוצת פוספט, dinucleotide אקראי ב5&#39; 5 הסוף, וdideoxycytosine &#39;3. 5 &#39;קבוצת פוספט היא דרישה של אנזים MTH ל5 יעיל&#39; adenylation 10. פוספט ניתן להוסיף על ידי טיפול מקדים של oligonucleotide עם kinase polynucleotide, או הורה עם השינוי באופן ישיר. Dinucleotide האקראי בסוף &#39;5 הוא חשוב למזעור העדפת הרצף שתערוכת ligases RNA לסוף-סוף מסוים הצטרפות תגובות על פני אחרים 6. 3 &#39;dideoxycytosine מציב אלמנט חסימה ב3&#39; סוף t oligonucleotideo מעכב את ההיווצרות של concatamers מקשר מקשר במהלך שלבי קשירה לאחר מכן ומשמש גם לחסום &quot;סוף מולקולת מירנה-לינקר נוצרה בסוף 3 &#39;3 תגובת קשירת 11. רצף מקשר oligonucleotide שנבחר לשיטת miR-Seq משוחד הוא כדלקמן: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התגובה הבאה adenylation: 200 pmol 3 &#39;oligonucleotide מקשר, 4 μl 10x 5&#39; חיץ adenylation DNA, 4 μl 1 מ&quot;מ ATP, 4 μl האנזים MTH RNA, H nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 40 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תגובה על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לסיים תגובה על ידי חימום עד 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז מקשר adenylated על ידי התוספת של 2.5 כרכים של 100% אתנול ו 1/3 נפח של 10 אצטט M אמוניום להסיר ATP שייר ולמנוע ligations בלתי צפוי בתגובות עתידיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לערבב אלcohol, מלח, ופתרון אוליגו להומוגניות, מסתובב במהירות מלאה בmicrocentrifuge (~ 15,000 XG) על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שטוף את הכדור באתנול 70%, אוויר יבש, וגלול בנפח המתאים של H nuclease ללא 2 O להניב 50-100 מיקרומטר של אוליגו adenylated. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר adenylation על ידי הפעלת ג&#39;ל polyacrylamide 18%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הג&#39;ל על ידי הערבוב הבא ביחד: 6.3 אוריאה g, 6.75 מיליליטר של acrylamide 40%, ו -1.5 מיליליטר של 10x TBE. הוספת H 2 O ל -15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים עד האוריאה נמס לגמרי ולהוסיף 150 μl 10% (w / v) persulfate אמוניום (APS) ו -15 tetramethlyethylenediamine μl (TEMED). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שג &#39;קבע, שלפני ריצה למשך 30 דקות ב 24 V / סנטימטר של רוחב ג&#39;ל עם TBE 1x חיץ פועל בטמפרטורת חדר. ברגע 30 דקות היא עד בארות מיושרות עם הפעלת מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 5 pmol של אוליגונוקלאוטידים adenylated עם ונפח שווה של חיץ טעינת RNA denaturing 2x (95% v / v) Formamide (,0.02% (w / v) SDS, 0.02% bromophenol כחול (w / v), 0.01% (w / v) קסילן Cyanol, 1.0 מ&quot;מ EDTA), חום לזמן קצר ל -75 מעלות צלזיוס, וצמד מקורר בקרח. לוותר מדגם כולו לתוך הבאר של הג&#39;ל. כמו כן כולל סכום זהה של שליטה שאינה adenylated, ותקני גודל משקל מולקולריים נמוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 24 V / סנטימטר עד bromophenol הכחול הוא ¾ מהדרך לתחתית הג&#39;ל. לפרק מנגנון, ג&#39;ל לאחר כתם עם פתרון SYBR-זהב 1x ב1x TBE ולדמיין על תיבת UV-transilluminator (איור 2). הערה: ג&#39;ל לטהר את אוליגו adenylated באופן דומה לזה שתואר לעיל, אם &quot;אין RNA קלט&quot; בקרות וכתוצאה מכך כמות גבוהה של מוצר ה- PCR בהשוואה לדגימות עם RNA קלט. </li></ol></li></ol> 2. לינקר קשירת 3 End &quot;של מירנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קשירת &#39;3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את הרכיבים על הקרח הבאים, לפי הסדר הרשום: 1.0 מיקרוליטר 50% (w / v) 8000 PEG, 0.5 &amp;956 #; l 10x חיץ האנזים RNA (500 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.5, 100 מ&quot;מ MgCl 2, 10 מ&quot;מ DTT), 1.0 מיקרוליטר adenylated 3 &#39;לינקר (100 מיקרומטר), מעכב RNase 0.5 μl, .5-8.0 מיקרוגרם רנ&quot;א הכל, האנזים 0.5 μl RNA T4 2, H nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 5 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התגובה על ידי pipetting כפתרון הוא צמיג מדי למערבולת בשל הריכוז הגבוה של PEG 8000. מעורבים ברגע יסודיות, למקם את התגובה בCycler תרמית עם מכסה מחומם. הגדר את הבלוק 16 מעלות צלזיוס, ודגירה של 4 שעות. הערה: התגובה יכולה להיות מדורגת עד נפח סופי של 20 μl בלי לפגוע ביעילות קשירה. להגיב ל4 שעות בטמפרטורת הסביבה או הלילה ב 4 ° C כדי להניב את יעילות קשירה זהה במהות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות קשירה &#39;3, לערבב את התגובה עם נפח שווה של חיץ טעינת 2x RNA. חום עד 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולהצמיד מגניב על קרח. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המדגם על 15% ג&#39;ל polyacrylamide לטיהור עמוד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל polyacrylamide 15% המכיל 7 M אוריאה, באופן דומה לזה שתואר קודם לכן בשלב 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להפעיל את הג&#39;ל על 24 V / סנטימטר של רוחב ג&#39;ל ללפחות 30 דקות. כבה את אספקת חשמל, בארות סומק, מדגם עומס וג&#39;ל לרוץ באותו מתח כמו לפני ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם ולהפעיל את עמוד עד bromophenol הכחול יש רק יצא ג&#39;ל. המוצר הרצוי יעבור קרוב לcyanol קסילן. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים, ויזואליזציה, וכריתה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק מנגנון ג&#39;ל וג&#39;ל המקום במגש נקי עם חיץ 1x פועל (TBE), SYBR-זהב 1x, ורוק במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ג&#39;ל ממנה מכתימה ולדמיין על תיבת transilluminator UV המכוסה בניילון נצמד נקי. מוצר קשירה צריך להיות סביב 45 נוקלאוטידים באורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו האזור הכולל את מוצר קשירה עם razo נקילהב r ומקום ב0.5 מיליליטר צינור מיקרו צנטריפוגות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד מוצר ורטיבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחתון פירס של 0.5 צינור מיליליטר microcentrifuge עם מחט G 30 ובמקום צינור הפירסינג בנמוך ההחזקה נקייה שנייה,, 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב~ 15,000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזותי לאשר שכל פרוסה ג&#39;ל עברה דרך החור בצינור הפנימי. במידת צורך, להשתמש בקצה פיפטה נקי לדחוף כמה שברי ג&#39;ל קרובים יותר לחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את צינור 0.5 מיליליטר הריק ולהוסיף 400 μl של חיץ טור גבוה מלח (HSCB 400 מ&quot;מ NaCl, 25 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.5, 0.1% SDS) לסלארי acrylamide. צינור רוק (ים) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התרחיף לטור ספין אצטט 0.22 מיקרון תאית באמצעות פיפטה קצה רחב נשא. צנטריפוגה במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר בXG ~ 15,000 כדי לאסוף את כל הנוזל ממטריצת ג&#39;ל acrylamide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הנוזל לשפל ההחזקה נקייה,, צינור 1.5 מיליליטר מכילing 1 μl של 20 מ&quot;ג / מיליליטר גליקוגן. הוסף נפח שווה של isopropanol ו1/10 נתרן אצטט נפח ה. מערבבים פתרון על ידי היפוך כמה פעמים צינור ולזרז במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות מלאה על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עד גלולה חומצות הגרעין. הסר supernatant ולשטוף באתנול 70%. גלולה האוויר יבשה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ולהמשיך ישירות 5 צעד קשירה &quot;. </li></ol></li></ol> 3. מקשר קשירת 5 &#39;סוף-3 מירנה&#39; היברידי לינקר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחומצות גרעין pelleted, להוסיף את המרכיבים הבאים: 2 μl PEG 8000 (50% w / v), 0.5 μl 10x RNA אנזים מאגר, ATP 0.5 μl (10 מ&quot;מ), 0.5 μl NN-RNA אוליגו (100 מיקרומטר), ו- H 2 O לנפח סופי של 4 μl. הערה: ההרכב &quot;אוליגו NN-רנ&quot;א &#39;הוא כדלקמן 5&#39;ההפוך dideoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3&#39; והיה מטוהר באמצעות HPLC על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבביםמדגם זה על ידי pipetting למעלה ולמטה שוב ושוב. לעשות את זה במשך זמן מה (עד 5 דקות) כדי להבטיח שהגלולה כבר לגמרי מחדש solubilized. אם מחדש solubilization הוא בעייתי, לחמם בקצרה המדגם (3-5 דקות) עד 37 מעלות צלזיוס ולחדש pipetting לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהכדור הוא חזרה בפתרון, להעביר את התוכן לצינור נקי PCR המכיל 1 μl של 1: 1 תערובת של מעכב RNase ו- T4 RNA אנזים 1 (5 יחידות). שוב מערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה בCycler תרמית על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. פנה מייד לסינתזת cDNA. </li></ol> 4. שעתוק לאחור / cDNA סינתזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הרכיבים הבאים ל5 &#39;תגובת קשירת: 2 μl חיץ 5x RT, 0.75 μl 100 מ&quot;מ DTT, μl 1 Illumina RT פריימר 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3 &quot;(1 מיקרומטר), ו -0.5 dNTPs μl (10 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי pipetting וחום עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר מכן לקרר לאט בt הספסלop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתגובה מתקררת לטמפרטורת חדר, צינור מקום על קרח ולהוסיף 0.5 μl כל אחד מאנזים טרנסקריפטאז ההפוך ומעכב RNase. מערבבים על ידי pipetting והמקום בCycler תרמית לצעד הסיומת מצויינים בהוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתוספת שלמה 5 μl של H nuclease ללא 2 O להביא את הנפח הסופי של ספריית cDNA עד 15 μl. </li></ol> 5. ספריית הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאינדקס PCR, להרכיב את התגובה על קרח הבא: 6 μl 5x Phusion מאגר, dNTPs 1 μl (10 מ&quot;מ), 0.9 μl DMSO, 0.75 μl 5 &#39;פריימר (25 מיקרומטר), 0.75 μl 3&#39; פריימר (25 מיקרומטר), ספריית 3 μl cDNA (ריכוז משתנה בהתאם לכמות של הקלט), 0.5 μl Phusion פולימראז (יחידת 1), H-nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 30 μl. בחר רצפי פריימר כדי להבטיח תאימות עם התבנית ואת פלטפורמת הרצף שלבחירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תגובת PCR עם ההגדרות הבאות: denaturation הראשוני על 98 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, במשך 4 המחזורים הראשונים, לפגל 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, לחשל על 50 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, להאריך ב 72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות . הערה: בהתאם לכמות חומר ההזנה, להשתנות כולל מספרי מחזור PCR. בדרך כלל, לקלט של 1-2 מיקרוגרם של רנ&quot;א הכל, 13 מחזורי PCR כולל מספיקים כדי ליצור את ספריית miR-Seq. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מחזורים שלאחר מכן, לדוגמא, מחזורי 5-12, באופן דו-שלבים שבו מחזורי חישול וסיומת משולבים ויבוצעו על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות וdenaturation הוא שוב 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות. הערה: נפח התגובה היא 30 μl להתיר השהיית תכנית ה- PCR ולהסיר aliquot 10 μl במספרי מחזור שנקבע מראש כדי לפקח על מראה של מוצר רצוי. בדרך כלל, מחזורי 10, 13, ו -16 נבחרו לבדיקה מסך מדגם RNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן8% ג&#39;ל acrylamide שאינו denaturing על ידי ערבוב 2 מיליליטר של acrylamide 40%, 1 מיליליטר של 10x TBE, ו- H 2 O ל 10 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף 10% APS 100 μl ו -10 μl של TEMED. יוצקים ג&#39;ל ולתת סט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להפעיל את הג&#39;ל על 12 V / סנטימטר של רוחב ג&#39;ל למשך 30 דקות. בארות סומק. הוסף 1 μl של חיץ טעינת 10x (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 טריס-HCl pH 8.0 מ&quot;מ, 0.1% (w / v) SDS, 0.01% (w / v) bromophenol הכחול), להוסיף 10 μl של מדגם היטב בכל ממדים 5 מ&quot;מ x 1 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ. בדרך כלל, כל אחד גם יכול לטעון עד 30 μl של דגימות. הרץ את הג&#39;ל המדגם ב 10 V / סנטימטר של רוחב ג&#39;ל במאגר 1x TBE עד הצבע הכחול bromophenol רק נגמר תחתית הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ולדמיין ג&#39;ל כמתואר בשלב 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו להקת זוג 146 הבסיס וelute לילה ב0.25 מיליליטר של HSCB באופן דומה למה שתואר בסעיף 2.4. משקע DNA בנפח שווה של isopropanol ו1/10 נתרן אצטט נפח ה. גלולה לשטוף בדואר 70%thanol וגלול במאגר TE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הספרייה באמצעות PicoGreen פי המלצות יצרן. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).</li><li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ENCODE+(ENCyclopedia+Of+DNA+Elements)+Project.">The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project.</a> Science. 306 (5696), 636-640 (2004).</li><li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Linsen, S. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+and+possibilities+of+small+RNA+digital+gene+expression+profiling.">Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling.</a> Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).</li><li>McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Acceptor+Oligoribonucleotide+Sequence+on+the+T4+RNA+Ligase+Reaction.">The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3&#8242;-adapter+ligation.">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3&#8242;-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).</li><li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stimulated+ligation:+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions.">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).</li><li>Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Archaeal+RNA+ligase+is+a+homodimeric+protein+that+catalyzes+intramolecular+ligation+of+single-stranded+RNA+and+DNA.">Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Abundant+Class+of+Tiny+RNAs+with+Probable+Regulatory+Roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Yi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8-dependent+microRNA+biogenesis+is+essential+for+skin+development.">DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).</li><li>Leung, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs.">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

המתודולוגיה שתוארה במסמך זה עושה שימוש במספר משתנה מפתח למקסם את יעילות קשירה, כלומר ריכוז גבוה של PEG, השימוש בlinkers אקראי, וריכוז גבוה של linkers 2,6,9. גישה זו מאפשרת ספריות רצף אמין כמותי מדגימות RNA הכולל 2. ערכנו titrations מרובה של RNA הקלט והגעתי למסקנה כי המתודולוג?...

מתודולוגיות מבוססות רצף תפוקה גבוהה כבר מיושמות באופן נרחב הרבה דגימות ביולוגיות בשנים האחרונות מאוד להרחיב את ההבנה של המורכבות המולקולרית של מערכות ביולוגיות 3,4. עם זאת, הכנת דגימות RNA לרצף תפוקה גבוהה לעתים קרובות מקנה הטיות ספציפיות הגלומות למתודולוגיה המועסקות, המגבילות את התועלת הפוטנציאלית של טכניקות רבות עוצמה אלה. הטיות שיטה ספציפית הללו תועדו היטב להכנות ספרייה מבוססת-קשירה, הקטן-RNA 1,2,5,6. הטיות אלה מובילים לוריאצית 1,000 פי בקוראים מספרים לmiRNAs הסינתטי equimolar, מה שהופך את ההיסק של שפע מירנה מנתוני רצף נוטים בפראות משתנה וטעייה. מחקרים המתמקדים במאפיינים של ligases RNA T4-נגזר הפאג תעדו כי האנזימים להציג את העדפות המבוסס על נוקלאוטיד 7, שבאו לידי ספריות מוטות כמו בניסויי רצף תפוקה גבוהה <sעד&gt; 1,2,8. על מנת למזער את ההטיות הנחילה ידי ligases RNA, אסטרטגיות מרובות להיות מועסקת; macromolecular צפיפות 9, באופן אקראי, רצף נוקליאוטידים של מתאם החשמל, הוא הפרוקסימלי לאתר קשירת 6, ומעסיק ריכוזים גבוהים של קשירת מתאם 2. באמצעות שילוב של שלוש הגישות הללו פיתחנו עבודת זרימה להכנה משוחדת של ספריות RNA קטנות תואמות לרצף תפוקה גבוהה (איור 1). להשוואה ישירה בין פרוטוקולים הנוכחיים והשיטה מותאמת שלנו, אנא פנה אל הדו&quot;ח האחרון שלנו 2. שיטה מותאמת זה מניב יעילות קשירה של יותר מ 95% בשני 3 &#39;ו 5&#39; צעדים ומאפשרת קשירה משוחדת של מולקולות RNA קטנות מדגימות סינתטיות וביולוגיות 2.

<table><tbody><tr><td>3&#039; Linker (5&#039; phosphorylated, 3&#039; blocked)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>5&#039; Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>5&#039; blocked, HPLC purified</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters</td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (without ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (with ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina index primer(s)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denaturing RNA loading buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon tubes</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Low retention microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenylation kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing

שיבוט מירנה ורצף תפוקה גבוהה, המכונים miR-Seq, עומד לבד כגישת transcriptome רחבה לכמת miRNAs עם רזולוציה נוקלאוטיד יחידה. טכניקה זו לוכדת miRNAs על ידי הצמדת מתאמי 3 &#39;ו 5&#39; oligonucleotide למולקולות מירנה ומאפשרת גילוי דה נובו מירנה. צימוד עם פלטפורמות רצף של הדור הבא חזקות, miR-Seq כבר סייע בחקר ביולוגיה מירנה. עם זאת, הטיות משמעותיות שהוצגו על ידי צעדי קשירת oligonucleotide מנעו miR-Seq להיות מועסק ככלי quantitation מדויק. מחקרים קודמים מראים כי הטיות בשיטות miR-Seq הנוכחיים לעתים קרובות להוביל לכימות מדויק מירנה עם שגיאות עד 1,000 פי כמה miRNAs 1,2. כדי לפתור הטיות אלה הנחילה ידי קשירת RNA, שפיתחנו שיטת קשירת RNA קטנה שגורמת ליעילות קשירה של מעל 95% עבור שני 3 &#39;ו 5&#39; צעדי קשירה. בהשוואות im זההוכיח שיטת בניית ספרייה באמצעות miRNAs הסינתטי equimolar או באופן דיפרנציאלי המעורב, באופן עקבי תשואות קוראים מספרים עם סטייה של פחות מכפולה מהערך הצפוי. יתר על כן, שיטת miR-Seq יעילות גבוהה זו מאפשרת יצירת פרופילי מירנה מדויקת הגנום מדגימות רנ&quot;א הכל in vivo 2.

התוצאות הצפויות לשיטה הקודמת צריכים להיות בתחילת תצפית של משמרת אחת נוקלאוטיד (גידול) בגודל של oligonucleotide DNA שהיה כפוף לadenylation על ידי האנזים MTH RNA (איור 2). בעקבות קשירה &#39;3, להדמיה של ג&#39;ל acrylamide מציינת (ראה איור 3) להקות חדות משקל מולקולרי גבוהות באו ...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing at JoVE.com

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

highly-efficient-ligation-small-rna-molecules-for-microrna

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K Views.  University of Colorado, Boulder. MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs. 

Video: Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Bioengineering

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Genetics

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

<meta charset="utf8"></head><body>זיהוי RNA המעורבים באינטראקציה ישירה של RNA-RNA עם RNA ארוך שאינו מקודד

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

זיהוי RNA המעורבים באינטראקציה ישירה של RNA-RNA עם RNA ארוך שאינו מקודד

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Biochemistry

ניתוח דינמיקת tRNA באמצעות AQRNA-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

מחבר זרקור: תפקיד AQRNA-seq במיפוי רנ"א קטן וחשיפת מנגנוני תרגום חלבונים

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

זיהוי RNA המעורבים באינטראקציה ישירה של RNA-RNA עם RNA ארוך שאינו מקודד

זיהוי RNA המעורבים באינטראקציה ישירה של RNA-RNA עם RNA ארוך שאינו מקודד

ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם