ברצוננו להודות לקורט מזר מתרופות איזיס למתן ייעוץ הנוגע לניתוח בולוס ICV, כמו גם תרופות איזיס בכללותו לאספקת המעבדה שלנו עם Asos. יתר על כן, ברצוננו להודות לקארי Shaner לבחינת מאמר זה. תמ וSLD נתמכים על ידי NIH מענקי P50AG005681, K08NS074194, וR01NS078398.

<ol>
	<li>Crooke, S. T., Bennett, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+antisense+oligonucleotide+therapeutics.">Progress in antisense oligonucleotide therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 107-129 (1996).</li><li>Sazani, P., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+antisense+oligonucleotides+as+modulators+of+alternative+splicing.">Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991-1995 (2002).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Targeted+Therapies+for+the+Central+Nervous+System.">Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System.</a> Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).</li><li>Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Reduction+of+Target+RNAs+by+Small+Interfering+RNA+and+RNase+H-dependent+Antisense+Agents.">Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).</li><li>Smith, R. A., Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotide+therapy+for+neurodegenerative+disease.">Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).</li><li>Rosen, D. R., Siddique, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cu/Zn+superoxide+disumutase+gene+are+associated+with+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature. 362, 6415-62 (1993).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+from+familial+and+sporadic+ALS+patients+are+toxic+to+motor+neurons.">Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons.</a> Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).</li><li>Furukawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+roles+of+wild-type+Cu,Zn-superoxide+dismutase+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).</li><li>Hua, Y., Sahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Passini, M. A., Bu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotide+Delivered+to+the+Mouse+CNS+Ameliorate+Symptoms+of+Severe+Spinal+Muscular+Atrophy.">Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy.</a> Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).</li><li>Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Therapeutic+Reversal+of+Huntington's+Disease+by+Transient+Repression+of+Huntingtin+Synthesis.">Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis.</a> Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).</li><li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon.">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).</li><li>Planel, E., Richter, K. E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+Leads+to+Tau+Hyperphosphorylation+through+Inhibition+of+Phosphatase+Activity+by+Hypothermia.">Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).</li><li>Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotide+therapeutics+for+inherited+neurodegenerative+diseases.">Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).</li></ol>

המחברים לקבל אנטיסנס מתרופות איזיס.

היכולת לספק תרופות ברחבי העולם במערכת העצבים המרכזית, כפי שמוצג בסרטון היא טכניקה חזקה מאוד כי הוא קל ללמוד ולהשתמש בשניהם. בעזרת תרגול, ניתן להשלים השתלת משאבה בודדת או בולוס ICV ב 10 דקות, מה שמאפשר לקבוצות גדולות של עכברים שיתייחסו אליו באותו הזמן. התכונה זו שימושית במיוחד עבור מחקרים עם readout התנהגותי, כמו מספרים גדולים יותר להתנהגות עכבר הם קריטיים כדי לעזור לראות הבדלים משמעותיים. בהתבסס על החוויות שלנו ומספקת Asos באמצעות משאבות וזריקות בולוס, ראו כמה יתרונות וחסרונות לכל שיטה. יש לציין כי אלה הם חוות הדעת במעבדה שלנו ולא יכול להיות נכון לכל דגמי העכבר וחולדה. אנחנו מוצאים את יתרון של שימוש במשאבות הוא היכולת שלהם לספק כמות גבוהה של ASO מאז ASO מופץ על פני תקופה ארוכה יותר של זמן. זה בדרך כלל משווה ל מציאה או שחבור מתמשך זמן רב יותר לאחר פעילASO עירוי, אם כי זה לא תמיד המקרה. המשאבות לאפשר גם למסגרת זמן מדויקת של לידת ASO (14 ימים, 28 ימים, או 42 ימים) וניתן לשנות את משאבות פעם אחת כדי לאפשר לעירוי ASO אפילו יותר פעיל. עם זאת, יש לנו לב שמשאבות שינוי יותר מפעם אחת מגדיל את ההשתנות עקב היווצרות של כיסים סיביים סביב המשאבה המונעת מספיגת נוזלים כמו שצריך משאבה. חסרון של המשאבות הוא שכמה עכברים לא לסבול כמו גם לאחרים את המשאבה. אם הקו המהונדס שאתה עובד איתו הוא שביר יותר, משאבה עשויה להיות מסורבלת מדי. את המשאבות גם צריכים להיות הוסרו לאחר העירוי הסופי, חשיפת העכברים לניתוח נוסף והרדמה נוסף. אם עושים את העבודה של התנהגות, זה חשוב במיוחד כדי להסיר את המשאבה ולאפשר לפחות 1-2 שבועות של התאוששות מאז הנוכחות של המשאבה תשפיע על חלק מההתנהגויות בעכברים. עם ICV בולוס זריקות, יתרון אחד הוא עלות. ישהשקעה מראש לרכוש את המזרקים ומחטים, אבל לאורך זמן, זריקות בולוס הן חסכוניים יותר מכיוון שאין משאבות / צינורות / צנתרים לרכישה. בסך הכל, יש פחות-up לשמור עם זריקות ICV בולוס בשל חוסר cannulas ומשאבות. כמו כן, אנו מוצאים שניתן להשתמש בו כדי לספק בולוס ICV Asos לעכברים צעירים שבירים ו / או יותר. חסרון של בולוס ICV הוא שזה זריקה אחת. לא באותה המידה יכול להיות מועבר ASO הכולל בדרך זו, ואם משך הפעולה של אסו בשימוש קצר, את השפעות מציאה / שחבור תהיה גם להיות קצרות מועד. שתי משאבות אוסמוטי, כמו גם את בולוס ICV יש לו את היכולת לספק Asos שיכול חלבוני מציאה או לשנות שחבור של גנים במערכת העצבים המרכזית מכרסם שלמות, טכניקה שיש לו יישומים רחבים בתחומים הקשורים למדעי המוח מרובים. אנו ממליצים הטסת שתי שיטות משלוח אם אתה לא בטוח שהתוואי של ממשל הוא מתאים ביותר עבורך שלמחקר pecific.

חלק מהתרופות אינן מסוגלות לחצות את מחסום דם המוח (BBB), הדורשות מערכת עצבים ישירה מרכזית (CNS) מסירה. כדי לעקוף את BBB, יכולות להיות מועברות תרופות ישירות לתוך המוח תוך שימוש בשיטות שתוארו. בעוד המעבדה שלנו וההתמקדות במסמך מפורטת על נייר אנטיסנס (Asos), תרופות אחרות, כגון מולקולות קטנות, נוגדנים, וקטורי ריפוי גנטיים, וכו &#39;., יכולים גם להיות מועברים דרך מדויקת באותה הגישה. חלבונים מסוימים לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מחלות ניווניות. חלבונים כאלה לעתים קרובות בצורת מינים רעילים ומצטברים לאגרגטים, מה שמוביל למוות עצבי וסופו של דבר מחלה נוירולוגית לאחר 3-4. במאמץ להאט או אפילו לעצור את ההתקדמות של מחלות אלו, אופציה טיפולית אחד יכולה להיות ישירות היעד להקטין את החלבון סיבתי. עם זאת, חלבונים אלו נמצאים לעתים קרובות כל מקום בגוף דרך מערכת העצבים המרכזית, ולכן קשה לדואר<html> ffectively למקד אותם בקנה מידה עולמית. על מנת למקד את הגנים לאורך כל מערכת העצבים המרכזית, שננהל Asos לעכבר בנוזל המוח והשדרה (CSF) דרך החדר לרוחב כדי לעקוף את BBB. השיטה ספציפית זו מנצלת את מערכת חדרית העכבר שרוחצת את כולו המוח וחוט השדרה, המאפשרת הפצה נרחבת של Asos. אנו משתמשים בAsos כי הם 18-20 כמו מולקולות רנ&quot;א mer שקושרים ישירות את רצף ה-mRNA והיעד, בהתאם לשינויים הכימיים אסו, שני) לגייס RNase-H כדי לבזות את ה-mRNA שמוביל למציאה או B) לעבור שחבור חלופי 1 , 2,16,17. יצוין, כי קיימות מספר מולקולות לדריסת חלבון מסוים in vivo, כולל shRNA. מאז מולקולות אלה אינן במוקד מאמר זה, אנו מכוונים את הקורא לעיין במאמרים שמנגנונים טובים יותר פירוט מציאה של פעולה ואת יתרונות / חסרונות של כל אחד 5-6. &gt; &quot;Jove_content בעבודה לפני, יש לנו להשתמש Asos למקד סופראוקסיד החלבון 1 סופראוקסיד (SOD1) במודל עכברים מהונדס של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) 7 (איור 4). מוטציות בSOD1 להתרחש בכ -2% מכל ALS 8 מקרים, למרות שזה כבר שערנו לאחרונה כי SOD1 עשוי לשחק תפקיד חשוב בALS ספוראדי גם 9-10. ידי SOD1 רמות הכולל בעכברים המהונדס ALS, ההישרדות יורד לאחר ההופעה הייתה גדלה באופן משמעותי 7. נתונים חשובים אלה היו ראשון כדי להראות שטיפול ASO של מערכת העצבים המרכזית יכול להיות השפעה חיובית עמוקה על מודל מחלה נוירולוגית. מאז, Asos ממוקד לSOD1 אדם נכנס והושלם בהצלחה שלב I בניסוי קליני בבני אדם עם תופעות לוואי מינימאליות (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , כפי שהוצג באקדמיה 2012 64 th השנתית האמריקנית לנוירולוגיה. מתכנן להעביר את Asos קדימה לשלב II של ניסויים כרגע בעיצומו. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; בעוד מיקוד SOD1 היה ההפגנה הראשונה של שימוש Asos לטיפול במחל נוירולוגית, כמה מחקרים אחרים שכן בוצעו מסתכלים על מחלות שונות ומטרות החלבון שלהם. בשנתי 2010 ו -2011, Asos כי שחבור המשמרת של הישרדות החלבון של הנוירון מוטורי 2 (SMN2) היה בשימוש במודלי עכבר מהונדס של ניוון שרירים השדרה (SMA) והביא לשיפור משמעותי בפנוטיפים המחלה 11,12. Asos השחבור אלה נמצאים כעת בשלב הראשון של הניסויים קליניים בילדים עם SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). בנוסף, הוכיח לאחרונה כי ממשל זמני של Asos ממוקד נגד גן huntingtin הצליחו להציל את מודל העכבר של הנטינגטון באופן דרמטי, גם לאחר שרמות חלבון huntingtin חזרו לבסיס 13. בכל המחקרים הללו, Asos הועברו לחדר לרוחב לירידה ברמות גנים כלל או לשנות שחבור גן דרךאת כל מערכת העצבים המרכזית. שני משאבות האוסמוטי וזריקה בולוס בודדת יכולים לשמש כדי לספק לAsos CSF. משאבות מאפשרות משלוח איטי, מתמשך, ואילו intracerebroventricular בולוס (ICV) הוא, הזרקה חד פעמית מהירה. יש לנו להשתמש בשתי השיטות הללו עם הצלחה, למרות שיש לנו לא דיווחו על ההשוואה הישירה בין המשאבה ובולוס בקו מהונדס אחת. שימוש Asos של מערכת העצבים המרכזית הוא דרך רב עוצמה לירידה ברמות סך חלבון ו / או שינוי שחבור של כמה חלבונים. בעוד אנו משתמשים באופן בלעדי Asos כטיפול בהפרעות נוירולוגיות, אנו מכירים בכך שגם בתחומים אחרים עשויים להפיק תועלת מהטכניקה הזו. כל עוד החלבון של העניין באו לידי ביטוי במערכת העצבים המרכזיים, והמטרה הסופית היא להגיע למערכת העצבים המרכזית שינויים רחבים בביטוי גנים, תוך שימוש בטכניקות Asos הפגינו עשויה להיות מאוד שימושי.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 14 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 28 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 42 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5 mm Catheters</td>
 <td>PlasticsOne</td>
 <td>3280PM/SPC</td>
 <td>Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vinyl Catheter Tubing</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>7760</td>
 <td>ID: 0.027", OD: 0.045"</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>2F7124</td>
 <td>NOT to be used in pumps or tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Injection, USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p60 Petri Dish (Sterilized)</td>
 <td>TRP</td>
 <td>93060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surgical Blades (Sterile)</td>
 <td>Butler Schein</td>
 <td>#007319</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Latex Surgical Gloves (Sterile)</td>
 <td>Micro-Touch</td>
 <td></td>
 <td>CatNo will depend on size of the gloves needed</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Towel Drape</td>
 <td>Dynarex</td>
 <td>4410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>.2um Syringe Filters</td>
 <td>PALL</td>
 <td>4192</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe (Sterile)</td>
 <td>BD</td>
 <td>309625</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Conical Tubes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PUMP &amp; BOLUS SURGERY PROTOCOLS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>13009-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Sharp Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14060-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Blunt Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14029-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bone Cutter</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>16104-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Straight Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l gas-tight with removable needles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needles</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7758-04</td>
 <td>26 gauge, Point Style: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-0 Nylon Suture Thread</td>
 <td>Covidient</td>
 <td>SN-871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Pads</td>
 <td>Select</td>
 <td>#521</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton Swabs (sterile)</td>
 <td>Puritan</td>
 <td>REF 806-WC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Loctite</td>
 <td></td>
 <td>Longneck Bottles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAUTION: FastGreen Dye</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F7252-5G</td>
 <td>Wear Eyeshields and Gloves when handling this product</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic Cream</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eye Ointment</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electric Shaver</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Provadone Iodine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3% Hydogen Peroxide</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warming Pad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead Sterilizer</td>
 <td>SouthPointe Surgical</td>
 <td>GRM5-1450</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 940</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nose Cone</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 923-B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ear Bars</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 921</td>
 <td>This model is optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cannula Driver</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1966</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe Holder</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1972</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature Control System</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model TCAT-2LV</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oxygen/Isoflurane System</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system

בשל חוסר יכולת לחצות את מחסום הדם במוח, תרופות מסוימות צריכים להיות מועברות ישירות למערכת העצבים המרכזית (CNS). המעבדה שלנו מתמקדת במיוחד באנטיסנס (Asos), אם כי ניתן להשתמש גם בטכניקות שמוצגות בסרטון כאן כדי לספק שפע של תרופות אחרות למערכת העצבים המרכזית. אנטיסנס (Asos) יש לו את היכולת למציאת מטרות רצף ספציפית 1, כמו גם יחסי איזופורם מעבר של גנים ספציפיים 2. כדי להשיג מציאה גן נרחבת או שחבור במערכת העצבים המרכזית של עכברים, Asos יכול להיות מועבר למוח באמצעות שני מסלולים נפרדים של ממשל, אשר שניהם אנו מדגימים בוידאו. השימושים הראשונים Alzet משאבות אוסמוטי, מחוברות לקטטר שמושתל בניתוח לתוך החדר לרוחב. זה מאפשר את Asos להיות חדור ברציפות לתוך מערכת העצבים המרכזית לתקופה מוגדרת של זמן. השנייה כרוך בהזרקת בולוס יחידה של ההייריכוז של GH ASO לתוך החדר לרוחב הנכון. שתי השיטות להשתמש במערכת חדרית מוחין העכבר כדי לספק ASO לכל המוח וחוט השדרה, אם כי בהתאם לצרכים של המחקר, שיטה אחת עשויה להיות מועדפות על פני אחרים.

לאחר משאבת עירוי או זמן מיועד לאחר הזרקת בולוס ICV (אנו משתמשים באופן שגרתי ארבעה שבועות), חשוב לבחון את היעילות של Asos. אנו ממליצים לקחת באזורים שונים של המוח וחוט השדרה כדי למדוד את הרמות / isoforms של גן המטרה, הן ברמת ה-mRNA באמצעות כמותי בזמן אמת PCR כמו גם את רמת החלבון או באמצעות כתם מערבי או ELISA (איור 4 לדוגמה שפורסמה ). זה יעזור לקבוע את יעילות ASO בכל אזורים במערכת העצבים המרכזית השונים. אם זמן מחצית החיים של החלבון ממוקד הוא ארוכים, אנו ממליצים לחכות עוד לאחר עירוי ASO על מנת להעריך מציאה חלבון מקסימום או שחבור. כמו כן, חשוב לבדוק את חלוקת אוליגו. חליטות משאבה לגרום להפצה באמצעות ההמיספרות גם ipsilateral ונגדיים, אם כי ריכוז גבוה יותר ASO נתפס לעתים קרובות באזורים קרוב יותר למערכת חדרית 16. ICV בולוס זריקות להניב unifo יותרהפצת RM של אוליגו דרך מערכת העצבים המרכזית 16, אם כי ההשפעות לא יכולים להימשך כל עוד. אנחנו מפנים את הקורא לSouthwell et al. לראות השוואה ישירה של משאבה לעומת בולוס הפצת אוליגו 16. כמו כן, אנו ממליצים על בדיקת מינונים שונים וכן את משך זמן פעולה של Asos שכן כל ASO יתנהג באופן שונה במקצת in vivo. Asos יש בדרך כלל משך זמן ארוך יחסית של פעולה, עם מציאה היעד או שחבור שנמשכת כמה חודשים לאחר לידת ASO. בנוסף, כמה Asos יעבוד טוב יותר מאחרים ועוד כמה מטרות גן תהיה קלה יותר למציאה מאשר לאחרים. מסיבה זו, כאשר הקרנת Asos כדי לקבוע את המועמד המוביל, מומלץ לבדוק לפחות 3-5 Asos in vivo עם n = 4-6 מבוגרים עכברים לאסו כניסיונו ראשון. אם אתם משתמשים בתרופה אחרת מאשר Asos, זה יהיה גם להיות חשוב לטייס ריכוז התרופה האידיאלי, משך פעולה של תרופה, ותרופת מערכת העצבים המרכזיתהחלוקה שלתרכובת מסוימת. <img alt="טבלת 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> טבלת מס &#39;1. ניתוח קואורדינטות. מרכז נהג להכות את החדר לרוחב הנכון בשני עכברים וחולדות בעת השתלת משאבות אוסמוטי, כמו גם ביצוע בולוס intracerebroventricular (ICV). שתי הקואורדינטות, למשאבות ובולוס ICV, למקד חדר לרוחב הנכון. אנו משתמשים בשתי מערכות שונות, כי אלה הם מה שיש לנו את החוויה ביותר עם ויודעים לספק הפצה מצוינת של אסו. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> איור 1. התקנת Stereotaxic. (א) הציוד הדרוש למשאבת stereotaxic Alzet וניתוחים הזרקת בולוס.) זכוכית ביד לעקרr. II) צג דיגיטלי. III) בסיס Stereotaxic עם זרועות נעות. IV) כרית חימום בטמפרטורה מבוקרת. V) Isoflurane / מערכת חמצן. VI) לשכת Isoflurane. (ב) תקריב של החרטום וסורגי אוזן. (C) שני קבצים נדרשים. משמאל: מזרק / בעל מחט לזריקות בולוס ICV. מימין: מנהל התקן של קנייה להשתלת משאבת אוסמוטי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> איור 2. Alzet השרשה משאבת אוסמוטי. (A) Alzet אפשרויות משאבה האוסמוטי לעכברים. משאבות. של 14 יום (0.25 μl / שעה), משאבות 28 יום (0.25 μl / שעה), משאבות יום 42 (0.15 μl / שעה) (ב) להשתלת משאבת קואורדינטות מגבחת: -0.5 מ&quot;מ אחורי, -1.1 מ&quot;מ לרוחב ( מימין), ו-2.5 מ&quot;מ הגחון (אורכו של צנתר). (ג) לאחר הנסיעה דרך קטטרגולגולת והדבקת הצינורית, לצבוע הוא הסמיק דרך קטטר להעריך מיקום נכון של קטטר בחדר לרוחב. (ד &#39;) במוח perfused מייד לאחר הצבע מנוהל כמו ב( C). אם הצנתר ממוקם בהצלחה בחדר, לצבוע יופץ בכל מערכת חדרית העכבר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> איור 3. הזרקת בולוס Intracerebroventricular. () קואורדינטות להזרקה בולוס מגבחת: 0.3 מ&quot;מ קדמי, -1.0 מ&quot;מ לרוחב (מימין), ו-3.0 מ&quot;מ גחון (ב &#39;) לאחר הנסיעה של המחט דרך גולגולת מ&quot;מ -3.0 הגחון, הצבע נדחף דרך המזרק. כדי להעריך את המיקום נכון של המחט ב( ג) מוח perfused מאוחר יותר החדר. זמן קצר לאחר לצבוע מנוהל כמו ב( ב &#39;). אם מחט ממוקמת בהצלחה בחדר,צבע יופץ בכל מערכת חדרית העכבר. <img alt="איור 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> איור 4. אנטיסנס להפחית SOD1 עכברוש in vivo (דמות שנלקחה ישירות מסמית ואח&#39;. 7). (AD) אנטיסנס SOD1 תעוף r146192 או SOD מקושקשת היו חדור במשך 28 ימים לתוך החדר לרוחב ימין של חולדות נורמליות ב 100 מיקרוגרם / יום. (רמות ה-mRNA) SOD1 אנדוגני מהמוח וחוט השדרה כפי שהיא נמדדת על ידי qRT-PCR. ( B) SOD1 ו- טובולין רמות חלבון בעקבות עירוי ASO. (C ו-D) רמות חלבון לטובולין ולכמת SOD1 לאזורים של העירוי הבא המוח שונים. (ה) Asos נגד presenilin 1 או GSK-3 ובטאו, היו חדור עבור 2 שבועות לתוך החדר לרוחב ימין של עכברי nontransgenic ורמות ה-mRNA שהוערכו בקליפת המוח הקדמית / זמני הנכונה. לשכפל באישור האגודה האמריקנית לחקירה קלינית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> איור 5. פועל תפר מזרן אופקי. 5-0 חוט תפר ניילון הוא פילס ובמתוך העור, החל קדמי ואחורי עובד, מתרכז יותר על הצינורית. ברגע שהגיע לנקודה האחורית ביותר, חוט התפירה אז הוא הביא את קדימה והשחיל על צינורית פעם נוספת. הדבר מבטיח סגירת פצע תקינה ומונע את הצינורית / צינורות מהעבודה דרך העור.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System at JoVE.com

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

אנו מתארים שיטה למקד תרופות למערכת העצבים המרכזית או על ידי השתלת קטטר או ביצוע הזרקת בולוס לתוך החדר לרוחב הנכון בעכברים. אנו מתמקדים באופן ספציפי על המשלוח של אנטיסנס. טכניקה זו היא להתאמה בקלות לתרופות אחרות ולחולדות.

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

direct-intraventricular-delivery-drugs-to-rodent-central-nervous

Google

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of Psychosis and Mania

SCIENTISTS IN ACTION

59.7K Views.  Washington University in St. Louis School of Medicine. אנו מתארים שיטה למקד תרופות למערכת העצבים המרכזית או על ידי השתלת קטטר או ביצוע הזרקת בולוס לתוך החדר לרוחב הנכון בעכברים. אנו מתמקדים באופן ספציפי על המשלוח של אנטיסנס. טכניקה זו היא להתאמה בקלות לתרופות אחרות ולחולדות.

Video: Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

תרופות משלוח מערכתית מקומי לטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית מודלים מכרסמים

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

סוללה בחינה ממוחשבת ללמוד Pharmacodynamic השפעות על מערכת העצבים המרכזית של שימוש בסמים בפיתוח התרופה בשלב מוקדם

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...