אנו אסירי תודה לדיונים, ההדרכה ותמיכה מבני הזוג. מיכאל Andreeff MD, PhD., וג&#39;ארד Burks דוקטורט. מMD Anderson cytometry הזרימה והמתקן נייד Core הדמיה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים מהמכון הלאומי לסרטן (RC1-CA146381, CA-083,639, R01NS06994, CA116199 וCA109451 לFCM. ELS נתמך גם על ידי מחלקת צבא הגנה (BC083397).

Syngeneic Murine להשתלת מח עצם (BMT) כפי שאושרה על ידי פרוטוקולי IACUC מוסדיים (הערה: הצלחה של פרוטוקול זה דורשת ניצול מכל סוג שכותרתו תא (ים) כיעד לניתוח multispectral, וכדי להקל על הניתוח במורד הזרם, אפשר לנצל כל גנטית או תיוג סלולארי יציב. אנו מציעים כי כל תא, רקמה, או יכול להיות מיושם איבר לעתיד למודל השתלה וכי ההשתלה יכולה להכיל אוכלוסיות שכותרתו ייחודיות רבות כמו המחקר ימצא שימושי. בנוסף, שכותרתו רבת מערכות סלולריות , כמו אלה שנמצאו בעכברים מהונדסים המכילים מספר רב של שושלת מוגבלת-fluorescently שכותרת אוכלוסיות יכולות להיות מתוכננות כדי למנוע סיבוכי השתלה לחקר מצבים פתולוגיים מסוימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטלני להקרין עכברי נמען BMT עם מנה אחת של ארבע שעות 9.5 Gy לפני הכינון מחדש עם תורם מח עצם. (מקבלי BMT GFP צריכים להיות 6-10 שבועות של גיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את פרוות העכבר עם אתנול 70% לפני גזיר ולקלף אותו כדי לחשוף את הגפיים האחורי עם מספריים כירורגיות סטריליות. הסר את כל הרגל, כולל רכס הכסל במפרק הע&quot;כ. מחק את הרגל על ​​ידי חיתוך שמעל הקרסול, ולאחר מכן ביסודיות להסיר את כל השרירים, רצועות ורקמות עודפות מעצם. מח סומק מפסגת השוקה, fibia וכסל עם מחט 23 G באמצעות FBS סטרילי 2% ב-PBS (PBS-2). (יש להקריב תורמי RFP BMT על פי סטנדרטים מוסדיים.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים בעדינות ולרסק את העצמות שנותרו לרסיסים באמצעות אזמל ומלקחיים ולאחר מכן מקום לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר עם 3 מיקרוגרם / מיליליטר collagenase אני עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס ב300 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעלה את הצינור עם PBS-2 ולאסוף supernatant לתוך צינור טרי ולשלב עם תאים סמוקים. ספין למטה ב250rpm במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב-PBS-2 ולסנן דרך 40 מסנן תא ננומטר. בשלב זה, יכול להיות מתויג התאים לfluorescenלא הופעל מיון תא (FACS) אם רוצה לתפעל אוכלוסיות ספציפיות לBMT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 2 x 10 6 תאים לכל 100 μl PBS, לכל עכבר. השתמש 29 מחט G להזריק מערכתית לעכברים נמען GFP מוקרנים על ידי זנב או וריד-פוע בצד למעלה רטרו מסלולית. הזרק עכבר אחד עם 100 μl PBS רק כשליטת engraftment. השתמש במנורת חום להרחבת כולים לפני הזריקה ולהשתמש איפוק הזרקה לוריד זנב על זריקה. יש לי גזה סטרילית זמינה להפעיל לחץ אור לתפקיד זנב הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה שבועות לפרסם BMT, לאסוף רטרו orbitally דם ולנתח ידי cytometry זרימה כדי לאשר את קיומם של תאים במחזור ה-GFP והיעדר תאי RFP במחזור. עכבר השליטה מת בשלב זה. </li></ol> 2. Engraftment גידול פי הנחיות IACUC המוסדיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ID8 תאי השחלות עכבריים סרטניים במבחנה לפני in vivo הזרקה (1 x 10 6 גאמות לכל עכבר). יום של הזרקה, trypsinize תאים, לשטוף עם PBS ו resuspend ב PBS ב 1 x 10 6 תאים לכל 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק תאים סרטניים לתוך חלל intaperitoneal של העכבר, מחט צריכה להיות פוע בצד למעלה. לעקר ראיית הזרקה עם 70% אתנול. הזרק לפינה השמאלית התחתונה או ברבע ימני תחתון של הבטן (גולגולת ומעט המדיאלי לקבוצה הנחותה של פטמות בטן של עכבר נקבה), להימנע מפגיעה באיברים. לרסן את העכבר על ידי גרירה בעורף ומחזיק את הזנב עם הזרת או טבעת. יכולים להיות מורדמים עכברים עם isoflurane להליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכברים כאשר סימנים של engraftment גידול, כגון נפיחות בבטן קלות, הם נראים לעין. זה יתרחש מעל 4-12 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידולי בלו מחלל ה-IP. גידולים בתוך החלל ייראו כמו גושים לבנים על ומסביב את פני השטח של האיברים. עם אזמל, להסיר את הגידולים ואת המקום בצינור / צנצנת פורמלין 10% ל24 קיבעון שעה. p היסטולוגיתפיצוי יכול להיות שמקורו מחוץ לליבת פתולוגיה / היסטולוגיה אם חומרים כימיים וחומרים אינם זמינים להטבעת פרפין והכנת שקופיות. רקמות סעיף ל5-8 מיקרומטר פרוסות בשקופיות זכוכית לנהלים מכתים שלאחר מכן. </li></ol> 3. Multi-פרמטר Immunofluorescent מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שקופיות בקרת צבע יחידה עבור כל בדיקה ניאון נוצלה בניסוי. בתרחיש זה, בארבעה צבעים נמצאים בשימוש. לכן, ארבע מגלשות לכל צבע בודד, כמו גם שקופית אחת לבקרת רעשי רקע ולבסוף שקופית אחת לצביעת שילוב המלאה. (סה&quot;כ שקופיות = 6) כל השקופיות תעובד לצד זו באופן זהה כדי למזער וריאציה ניסיונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים סעיפי פרפין ב56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות לשטוף 3x 10 דקות בקסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2x 5 דקות 100% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1x 3 דקות 95% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1x אתנול 2 min90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1x אתנול 2 min70%. </li><l1x 2 דקות i&gt; לשטוף במים. לאט לטבול את המתלה הצביעה פנימה וחוצה של 10x המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הסדרה לשטוף האחרונה, חיץ ציטרט הנתרן מראש רתיחה במשך 2 דקות (במיקרוגל על ​​גבוה). (ניתן להחליף עם חיץ טריס-EDTA בהתאם לנוגדנים בשימוש) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים את השקופיות עבור 20 דקות בחיץ ציטרט הנתרן (מיקרוגל ב10% כוח או בסיר לחץ). אם חיץ שחין, לכבות את המיקרוגל ולתת לשבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ממקור חום ולתת את השקופיות לנוח 30 דקות בחיץ ציטרט הנתרן כדי להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות במים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק סביב סעיפי גידול עם פאפ עט ולשים 2% BSA / 1% חומצת maleic FBS חסימת חיץ במשך שעה 1. הכן את השקופיות בנפרד כדי לא לתת להם להתייבש בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נוגדנים עיקריים בדילול אופטימלי בחסימת מאגר. (אם הנוגדנים בשימוש בכל מינים שונים (או וריאציה לשעבר שרשרת IgG הם: IgG1 לעומת IgG2a של אותו מין) הם עשויים להיות בשימוש בשילוב במהלך כתקופת הדגירה ingle. אם מיני נוגדנים חופפים, אז incubations חייב להתבצע ברצף כדי למזער את נוגדן תגובה צולבת.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, ישאיר את שתי שקופיות עם חסימת מאגר בלבד. שתי שקופיות אלה ישמשו שליטה בלא כתם ושליטה כתם גרעיני. פקדי צבע אחד האחרים יהיו הודגרו עם נוגדנים ראשוניים בודדים. רק את שקופית הניתוח תהיה שילוב של נוגדנים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות עם נוגדן ראשוני בתיבת תא לחות על שייקר מסתובב באיטיות על 4 מעלות למשך הלילה (~ 16-20 שעה) (הערה: כשעובדים עם 4 fluorophores +, מכתים רציף או נטיה ישירה עשוי להיות נחוץ כדי למזער את נוגדן תגובה צולבת . בנסיבות אלה לחזור על שלבים 1.16-1.21 עד שכל הנוגדנים מוחלים על השקופיות.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות עבור 10 דקות בPBST (2x) בעדינות על שייקר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הוא הולך לשטוף, להכין 488 AlexaFluor, 594 ו647 נוגדנים משני לדילול סופישל 1:1,000 בחסימת מאגר. (ודא נוגדנים ודילולים אלה נשמרים על 4 מעלות צלזיוס ובחושך בכל העת לשמר את הקרינה על פני קבוצות ובמשך זמן.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשקופיות שליטת צבע אחד, מקום אחד דילולים AlexaFluor המינים של הנוגדן הראשוני משמש התאמה. כל הנוגדנים משני ימוקמו בשקופית הניתוח. שקופיות השליטה המוכתמות בלא כתם והגרעיניים יישארו עם חסימת חיץ לאורך כל שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתיבת תא לחות (מכוסה בנייר אלומיניום, כדי להימנע מחשיפה לאור) על שייקר איטיים מסתובב ב RT במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות עבור 5 דקות בPBST (2x) בעדינות על שייקר. מכסה בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף DAPI (1:10,000) עבור 1 דקות לשקופית-DAPI בלבד ושקופיות הניתוח. מכסה בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. שקופיות האחרות ניתן להשאיר מכוסים במכל השטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף שני מודגרות-DAPIשקופיות במכל נפרד לשטיפת 5 דקות הראשונות שלא לזהם את השקופיות האחרות עם כתם DAPI. לשטיפת דקות השנייה 5, ניתן לשלב את השקופיות בPBST (כל שטיפות צריכה להתנהל על שייקר). מכסה בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות טבילה קצרה במים לפני (עובי 1.5 עם תקשורת הרכבה מימית לשמר הקרינה) מחליק כיסוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו 3 שעות יבשות בחושך ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצוות של הכיסוי להחליק עם מסמר מקשה. (אין להשתמש בלק כמו אצטון יכול להרוות את אות הניאון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את השקופיות באופן מיידי או לאחסן ב 4 ° C לניתוח בעתיד. </li></ol> 4. הדמיה multispectral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות multispectral ניצול מצלמה Nuance EX (המכילה מסנן מתכונן גביש נוזלי) על ה-X 63 מיקרוסקופ הזקוף אולימפוס עם תוכנת Nuance לאיסוף נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות באמצעות אובייקטיבי שמן כדי להגדיל את הרזולוציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Initial ההגדרה כוללת הגדרת טווח הספקטרום עבור כל fluorophore בשימוש. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל4 צבע: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAPI: 420-480nm </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AF488: 490-580nm </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AF594: 590-640nm </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AF647: 650-720nm </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את תמונה ראשונית של שקופית הניתוח כדי להשיג זמני חשיפה הנכונים עבור כל אחד מטווחי הרפאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירה &quot;ספריית רפאים&quot; שהתוכנה תהיה להשתמש בו כדי לזהות ולהפריד את יחס אות לרעש של fluorophores אחד מהשני ואות רקע. (הערה: כל fluorochrome חייב להיות שקופית אחת משלה שליטה בצבע כדי להרכיב ספריית רפאים עם עקומות אורך גל מתאימות כדי להבטיח ניתוח נכון של ערכת נתוני דוגמא: 3 fluorophores = 4 מגלשות שליטה; 5 fluorophores = 6 שקופיות שליטה.). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת השקופיות בלא כתם ראשון. שקופית זו תהיה מיועדת בתוך librar הרפאיםy כרקע.&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה להחליק DAPI בלבד שנייה. שקף זה ישמש לייעד גרעינים צבעוניים DAPI עם האפשרות &quot;לצייר&quot; ויישמר בתוך הספרייה ספקטרלית כDAPI.&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה להחליק שלישי. AF488 בלבד שקף זה ישמש לייעד את האזורים המוכתמים-AF488 עם האפשרות &quot;לצייר&quot; ויישמר בתוך הספרייה ספקטרלית כAF488.&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה להחליק AF594 רק רבע. שקף זה ישמש לייעד את האזורים המוכתמים-AF594 עם האפשרות &quot;לצייר&quot; ויישמר בתוך הספרייה ספקטרלית כAF594.&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה להחליק AF647 רק חמישית. שקף זה ישמש לייעד את האזורים המוכתמים-AF647 עם האפשרות &quot;לצייר&quot; ויישמר בתוך הספרייה ספקטרלית כAF647.&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות האוסף של כל רכיב ספקטרלי בודד,להציל את ספריית הרפאים והפרוטוקול.&gt; </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שספריית הרפאים היא מוחלטת, למצוא אזורים של עניין בשקופית הניתוח במיקרוסקופ ולאסוף / לשמור תמונות.&gt; </li></ol> 5. ניתוח כמותי של תמונות Multispectral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא מגוון מייצג של תמונות Nuance רכשו באמצעות להודיע ​​תוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את ספריית רפאים נשמרה כבבימויו של התכנית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות אזורי רקמות של עניין כדי להיות מנותחים. (רקמה למשל גידול לעומת רקמת שומן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות תאים בודדים המבוססים על DAPI-כתם. ציטופלסמה תוגדר באופן אוטומטי המבוססת על הצורה של הגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחור את עוצמת קריאה החוצה ניאון של בחירה עבור כל פרמטר ניאון (למשל אומר סטייה, סטנדרטית) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אצווה רכש תמונות ולתת לתהליך התוכנה באמצעות האלגוריתם המוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עיבוד התמונה הוא סיים, למזגקבצי התוצאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוצאות באקסל (או כל חבילת תוכנת אנליטיות אחרת) ואת העלילה שתי עוצמות ניאון אחד נגד השני על XY ציר. כל עוצמת ניאון היא נתון לכל תא. התאים החיוביים כפולים יופיעו ברבע הימני העליון. משתמש צריך להגדיר את עוצמות ניאון תחילת המחקר. </li></ol>

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

FCM, קרינת הרקע הקוסמית, וELS אין קונפליקטים ואין לחשוף.

במסמך זה אנו מתארים את היישום של ההדמיה multispectral אנו מתארים כחקירת MIMicc-multispectral של יצירות סלולריות Multiplexed, לנתח את רכיבי סטרומה שמקורם במח העצם של microenvironment הגידול, לעומת זאת מתודולוגיה זו ורעיון יכולים להיות מיושמים לפענוח מרכיבים תאיים אחרים המרכיבים את מתחם רקמות כמו...

הבנת התפתחות ותיקון רקמות היא משמעותית להבהרת מרכיבים תאיים משתתפים בריפוי פצעים, 2,3 רפואת רגנרטיבית, ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של גידול. בנסיבות של תיקון, סוגים רבים של תאים לחדור microenvironment שמסביב כדי לסייע בכלי דם, בתצהיר ECM, שגשוג ובנייה מחדש של רקמות. ניתן לזהות גורמים ופנוטיפים סלולריים המבוססים על פרמטרים מרובים, סמנים מרובבים שיכול לזהות את הלוקליזציה, מצב בידול ויחסי גומלין בין מרכיבים תאיים בתוך microenvironment נחקר. במסמך זה, אנו מתארים את התפתחות גידול כדוגמא טיפוסית למודל השתלה זו ססגוניות-תאית ואחרי ההדמיה multispectral ומתודולוגיה unmixing רפאים. התקדמות גידול היא תהליך רב שלבי שהתאפיין במספר יכולות שנרכשו הכוללות משופרת התפשטות,מאפייני ntiapoptotic, פולשנית ואנגיוגנזה. התפתחות גידול 4 הוא הקלה על ידי תאים שאינם neoplastic כי הם גויסו לסביבה כדי לספק גורמי גדילה, מטריצות מבניות, רשתות כלי דם ואפנון חיסוניים. 1,5,6 microhabitat זה מורכב מהתאים שמקורם רקמות מקומיות, שכנות כמו שומן, וכלי דם ומקורות רחוקים, כמו תאים שמקורם במח עצם 1. התאגדות מסוג התאים לא neoplastic מידת ההשפעה תלויה בביקוש מהגידול, אשר לעתים קרובות תואם את השלב / הכיתה של הגידול. כדי להבין את תפקידו של המיקרו תומך הגידול, יש להבין את מקורו ואת פוטנציאל ההתמיינות של אוכלוסיות תאים שאינם neoplastic. פרוטוקול זה תוכנן כדי לסייע בפרשנות של התקדמות גידול באמצעות ההדמיה של שני מרכיבים התאיים שמקורם במח העצם, וderiv הרקמות המקומיתed תאים. ניצול עכברים להביע גן כתב ניאון מהונדסים, אנחנו מושתלים GFP מח עצם (חלבון ירוק ניאון) לRFP קטלני מוקרן עכבר (חלבון אדום ניאון). בעקבות קליטתם מח עצם מוצלחת, שורת תאים הסרטני syngeneic מוזרקת orthotopically ואפשרה לנקלטת ל4-8 שבועות. הגידול וכתוצאה מכך הוא נכרת מהעכבר ומעובד לimmunofluorescent (IF) מכתים לדמיין את רכיבי סטרומה. ריבוב אם סמנים הוא טכניקה הנפוצה שכרוכה באופטימיזציה משמעותית 7-9, זאת תוך שימוש בפלטפורמת ההדמיה / unmixing multispectral משפר את הפוטנציאל לשילובי סמן פלואורסצנטי שיש להם חפיפה ספקטרלית. במסמך זה אנו מציגים טכניקה שאנחנו מכנים חקירת MIMicc-multispectral של יצירות סלולריות Multiplexed להכתים ולנתח עד שמונה סמנים בתוך קטע גידול בשקופית אחת על מנת לנתח את המקורות התאיים, התמיינות תאית status ותאי תאי אינטראקציות של רכיבים בתוך microenvironment הגידול. יש דוגמא פשוטה זו יש הפוטנציאל להיות מורחב על מנת לנתח חמש, שש, או יותר סמני ניצול נוגדנים או ביטוי תאיים מונע אמרגן ניאון. לוח רשימות 1 שילובי מכתים נוגדן ניאון פוטנציאליים עם מינים מתאימים נלקחו בחשבון.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

עם הרצון להבין את תרומתם של מרכיבים תאיים רבים להתפתחות של רקמות מורכבות, כגון סוגי תאים רבים המשתתפים בהתחדשות רקמות, היווצרות גידול, או vasculogenesis, אנחנו המצאתי מודל השתלה סלולרית צבעונית של התפתחות גידול ב שאוכלוסיות תאים שמקורם מעכברים שונים fluorescently צבע כתב גן והם מושתלים, engrafted או מוזרק ובסביבת גידול מתפתחת. לאחר מכן תאים צבעוניים אלה גויסו ושולבו בstroma הגידול. על מנת להעריך כמותית תאי סטרומה מח עצם נגזרים גידול, אנו מושתלים GFP להביע מח עצם כולו מהונדס לתוך RFP קטלני מוקרן להביע עכברים כפי שאושר על ידי IACUC. גידולי 0ovarian שהוזרקו orthotopically לעכברים המושתלים היו נכרת לאחר 6-8 שבועות engraftment וניתחו עבור סמן מח עצם ממקור (GFP), כמו גם סמני נוגדנים לזהות גידול קשורstroma תוך שימוש בטכניקות הדמיה multispectral. לאחר מכן, אנו הותאמו המתודולוגיה שאנו מכנים MIMicc-Multispectral חקירה של יצירות סלולריות Multiplexed, באמצעות unmixing multispectral של fluoroprobes להעריך כמותית שכותרתו התא בא ממנה האוכלוסיות מתחילות (המבוססות על תוויות גן כתב מקוריות), וכמו היכולת שלנו unmix 4, 5 , 6 או יותר ספקטרום לעליות שקופיות, הוספנו אימונוהיסטוכימיה נוספת הקשורות לשושלות תאים או בידול כדי להגדיל את הדיוק. ניצול תוכנה כדי לזהות אותות מרובבים-ניאון מקומי משותף, ניתן לייחס אוכלוסיות סטרומה גידול, מנויות ומאופיינות מבוססות על כתמי סמן. 1

שימוש בטכניקת הדמיה multispectral לנתח גידולי engrafted במודל העכבר המהונדס שלנו BMT, אנו מסוגלים להבחין במרכיבי גידול סטרומה שהם ממוצא מח עצם. BMT הראשוני אושר שלושה שבועות לאחר השתלה על ידי cytometry זרימה (איור 1). Orthotopically הזריק גידולי השחלות ללא תווית הבאה אישורי engraftment BMT ה...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני תא המבוססים על ביטוי חלבון.

כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

quantitative-multispectral-analysis-following-fluorescent-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.3K Views.  MD Anderson Cancer Center.  המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני ת?...

Video: Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

ויזואליזציה כמותי וזיהוי של סרטן העור באמצעות הדמיה תרמית Dynamic

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

טכניקת השתלות Murine Heterotopic לב

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

הקלטות מערך רב-אלקטרודה של רקמה האנושית אפילפטיים לאחר הניתוח בקליפת המוח

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique using the donor aorta to form the arterial anastomosis instead of the renal artery was developed and reported in 1993 by Kalina and Mottram 2 with a further advancement coming from the same laboratory in 1999 3. While one can become proficient in this model, a search of the literature reveals that many labs still experience a high proportion of graft loss due to arterial thrombosis. We describe here a technique that was devised in our laboratory that vastly reduces the arterial thrombus reported by others 4,5. This is achieved by forming a heel-and-toe cuff of the donor infra-renal aorta that facilitates a larger anastomosis and straighter blood flow into the kidney.

The goal of this manuscript is to describe the steps required to perform a kidney transplant in a mouse, paying particular attention to the details of the arterial anastomosis.

טכניקת השתלת כליה בעכברים

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

וריד ביון דגם: מודל מתאים ללמוד patency מעקף

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine balloon denudation model, which is comparable with established vessel injury models in large animals. The aorta denudation model with balloon catheters mimics the clinical setting and leads to comparable pathobiological and physiological changes. Briefly, after performing a horizontal incision in the aorta abdominalis, a balloon catheter will be inserted into the vessel, inflated, and introduced retrogradely. Inflation of the balloon will lead to intima injury and overdistension of the vessel. After removing the catheter, the aortic incision will be closed with single stiches. The model shown in this article is reproducible, easy to perform, and can be established quickly and reliably. It is especially suitable for evaluating expensive experimental therapeutic agents, which can be applied in an economical fashion. By using different knockout-mouse strains, the impact of different genes on MH development can be assessed.

This article demonstrates a murine model to study the development of myointimal hyperplasia (MH) after aortic balloon injury.

מבוסס על בלון פציעה לזירוז היפרפלזיה Myointimal באבי העורקים בטן העכבר

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...