המחברים מבקשים להודות לננסי מורה לקבלת הסיוע הטכני שלה. עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר 48573-M ו168098 מConsejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, מקסיקו, ועל ידי מענקי IN212308 וIN205311-2 מDireccion הגנרל דה Asuntos דל האישי Academico, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו, מקסיקו.

1. בידוד של נויטרופילים (PMN) מדם אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש כ 20 מיליליטר דם אדם בפרין (10 U / ml) כנוגד קרישה. דם נאסף ממתנדבים בריאים במבוגרי venopuncture. כל הניסויים נעשו במסגרת אישור ועדת ביואתיקה במכון Biomédicas Investigaciones דה - UNAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 2 מ&quot;ל של 6% dextran T500 ב PBS לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ&quot;ל ולהוסיף 10 מ&quot;ל של דם. מערבב על ידי היפוך הצינורית פעמים או שלוש ולתת לו לשבת במשך 45 דקות על מנת לאפשר לשקיעת דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור טרי 15 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה לשים 5 מ&quot;ל Ficoll-Paque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח פלזמה יקוציט העשירה שנוצרה מעל אריתרוציטים משקעים, ופיפטה אותה בזהירות על גבי Ficoll-Paque יצירת שכבה שנייה. ודא שיש שני שלבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 516 עבור 20 דקות ב 4 ° C. לאחר צנטריפוגה, בשלבי ביניים של פלזמה וFicoll-Paque יש שכבה של תאי mononuclear. Neutrophils נמצא בתחתית של התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, לשבור את תא גלולה על ידי קשה על הצינור כנגד מדפים, וresuspend התאים על ידי הוספת 10 מ&quot;ל של קר (4 ° C) PBS הערה:. Resuspending תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה אינו מומלצת, מאחר שזו גם ניזק לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את השעית התא לצינור 50 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה וצנטריפוגה XG ב 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את התא הגלול כמו קודם ולהוסיף 10 מ&quot;ל של קר (4 ° C) פתרון hypotonic (0.2% NaCl, 1% BSA, 20 Hepes מ&quot;מ, pH = 7.4) לlyse אריתרוציטים. מערבב בעדינות מתערבל צינור ביד דקה אחת בדיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של קר (4 ° C) פתרון hypertonic (1.6% NaCl, 1% BSA, 20 HEPES מ&quot;מ, pH = 7.4), לערבב וספירת התאים באמצעות hemocytometer (בדרך כלל&gt; 95% הם PMN). שים לב: שמור על הצינור עם השעית התא על קרח בעת לספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כמו קודם וresuspend PMN בשעת 107 תאים / מ&quot;ל בקר (4 ° C) PBS. שמור על קרח. הערה: נויטרופילים להישאר קיימא ותפקודי ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ 6-8 שעות. </li></ol> 2. הפעלת PMN <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים 100 μl של השעית PMN (1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל) לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל אפנדורף. הערה: דוגמיות צריכים להיעשות לפחות בכפילויות. פקדים שליליים רגילים צריכים לכלול נוגדן ראשון בלבד, ונוגדן משני בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הנוגדן אנטי המקביל integrin או נגד Fc רצפטור חד השבטי (MAB) בשעת 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ולדגור על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף PMN ידי הוספת 1 מ&quot;ל של קר (4 ° C) PBS, צנטריפוגה XG ב 1743 (4500 סל&quot;ד) בmicrocentrifuge, וaspirating supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את תא הגלולה על ידי קשה על התחתית של התחתית כנגד מדפים, להוסיף 1 המ&quot;ל PBS הקר, ולשטוף עוד שתי פעמים כמו בשלב קודם. הערה: אלה שוטפים להסיר נוגדן מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PMN resuspend באותה (ב) הנפח של itial חם (37 מעלות צלזיוס) PBS המכיל 60 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של F (ab &#39;) 2 עיזים אנטי עכבר IgG. הערה: נוגדן IgG המשני אנטי העכבר יהיה לאגד את הנוגדן אנטי-1 רצפטור ויגרום crosslinking של הקולטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס 1 עד 20 דקות, תלויות בגורם הגרעיני של עניין. לNF-κB בדרך כלל 15 דקות, ולאלק-1 בדרך כלל 5 דקות. הערה: דגירת התאים ב 37 ° C crosslinking גורם קולט, שלא יכול לקחת את המקום ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 המ&quot;ל PBS הקר וסרכזת 3 דקות ב1743 XG בmicrocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפא PMN מייד באמבטית dry-ice/ethanol ולהשאיר אותם שם למשך 10 דקות. </li></ol> 3. בידוד וקיבוע של גרעינים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הקפוא PMN גלול ב קר μl 100 (4 מעלות צלזיוס) חיץ hypotonic (10 HEPES מ&quot;מ, 10 המ&quot;מימ KCl, 1.5 המ&quot;מ MgCl 2, ו 1 mM הטרי מוסף DL-dithiothreitol [DTT], PH = 7.9). מומלץ לקחת את הצינורות שיצאו מאמבטית dry-ice/ethanol אחד אחד, ולנגב לנקות את התחתית של תחתית לפני ההוספה למאגר hypotonic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח על קרח, ולבדוק את שלמות גרעינים ע&quot;י השאיר aliquot ההשעיה של גרעינים עם trypan כחול. גרעינים נראים עגולים וכחולים. PMN השלם לא מקבל מוכתם, ופסולת תא מופיעה כחלקיקים כחולים של צורה לא סדירה. הערה: אם השעית גרעינים מכילה תאים שלמים או פסולת רבים, עדיף למחוק ההכנה ולחזור על התהליך עם דוגמה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה גרעינים ב775 XG (3,000 סל&quot;ד) בmicrocentrifuge למשך 10 דקות בתוך חדר קר. בגרעיני נקודה זו טיפול מאוד שביר ונוסף יש לנקוט בשמירה על הדגימות קרות ולא צנטריפוגה בכוחות מוגזמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת supernatant ידי pipetting זהיר מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של paraformaldehyde 4% הקרים ב PBS לתקן גרעינים. הערה: הגלולה מאוד רופפתד הוסיף למאגר הוא מספיק כדי resuspend הגרעינים. Pipetting למעלה ולמטה יש להימנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על קרח למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרעיני Immunolabel עבור cytometry זרימה או לשמור אותם לתקופה של עד 24 שעות ב 4 ° C. </li></ol> 4. Immunolabeling גרעינים לניתוח cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה גרעינים ב1743 XG (4500 סל&quot;ד) בmicrocentrifuge ל1 דקות, ולהסיר supernatant ידי pipetting עדין מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של קר (4 ° C) 0.1% Triton X-100, paraformaldehyde 4% ב PBS לpermeabilize גרעינים. דגירה בקרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה permeabilized גרעינים ב1743 XG בmicrocentrifuge ולהסיר את supernatant בזהירות. בשלב זה כדורי גרעינים לא מייחסים גם בתחתית של התחתית. מומלץ סרכזת שוב אם הגלולה מתרופפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרעיני resuspend ב 500 μl של סרום קר 4% עוברי שור (FBS) ב PBS לחסום אתרי קישור לא ספציפיים, ולדגור על קרח למשך 20 דקות. סרכזתגרעינים ב1743 XG ל3 דקות בmicrocentrifuge ולהסיר את supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גרעינים ב100 μl של PBS הקר המכיל 4% FBS ו 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של MAB נגד הגורם הגרעיני של עניין. לדגור על קרח למשך 20 דקות. הערה: פקדים שליליים רגילים צריכה לכלול נוגדן גורם אנטי גרעיני בלבד, וFITC שכותרתו נוגדן משני בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמים עם 500 μl של PBS הקר עם 4% FBS וצנטריפוגה XG ב 1743 עבור 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מאוד בזהירות, גרעיני resuspend ב 100 μl של הקור PBS המכיל 4% FBS ו 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של הנוגדן המשני המקביל FITC כותרתו, ולדגור על קרח למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמים עם גרעינים 500 μl של הקור PBS עם 4% FBS כמו בשלב קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גרעינים ב400 μl של paraformaldehyde 4% הקרים ב PBS. הערה: גרעינים ממוקמים בparaformaldehyde כדי לאפשר את המדגם כדי להיות מאוחסן במשך מספר ימים ללא זיהוםבעיות שיכולות להתרחש בנוכחות הסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח באופן מיידי על ידי cytometry זרימה או בחנות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים. </li></ol> 5. ניתוח זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח גרעיני immunolabeled בcytometer זרימה כגון FACScan (הקיטון דיקינסון; פרנקלין לייקס, ניו ג&#39;רזי) או מכשיר דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את גדרות רכישה ל: FSC ביומן בקנה מידה 10-1, SSC ביומן בקנה מידה 196, וגרעינים בשער הדוט עלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרכוש 10,000 גרעינים למדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הקרינה של גרעינים FITC מוכתמים דרך ערוץ FL-1 (506 ננומטר) המוגדר ביומן בקנה מידה ב 400. </li></ol>

<ol>
	<li>Sendo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neutrophil+apoptosis:+its+biological+significance+in+inflammation+and+the+immune+response.">Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response.</a> Human Cell. 9, 215-222 (1996).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33, 657-670 (2010).</li><li>Naussef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+human+neutrophils+kill+and+degrade+microbes.+An+integrated+view.">How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view.</a> Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).</li><li>Scapini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil+as+a+cellular+source+of+chemokines.">The neutrophil as a cellular source of chemokines.</a> Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).</li><li>Hamilton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-+and+stimulus-specific+mechanisms+for+post-transcriptional+control+of+neutrophil+chemokine+gene+expression.">Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression.</a> J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).</li><li>Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+apoptosis+pathways+and+their+modifications+in+inflammation.">Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation.</a> Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).</li><li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neutrophil+apoptosis.">Molecular control of neutrophil apoptosis.</a> FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).</li><li>Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+neutrophil+apoptosis:+new+players+enter+the+game.">Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game.</a> Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).</li><li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+and+NF-&#954;B+in+T+cell+activation:+life+at+the+edge.">Death and NF-&#954;B in T cell activation: life at the edge.</a> Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).</li><li>Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+JNK+signaling+to+NF-&#954;B:+a+key+to+survival.">Linking JNK signaling to NF-&#954;B: a key to survival.</a> J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).</li><li>Valente, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+increases+camptothecin-induced+apoptosis+by+inhibition+of+NF-&#954;B.">TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-&#954;B.</a> Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).</li><li>Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NF-&#954;B+by+a+TAT-NEMO-binding+domain+peptide+accelerates+constitutive+apoptosis+and+abrogates+LPS-delayed+neutrophil+apoptosis.">Inhibition of NF-&#954;B by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis.</a> Blood. 102, 2259-2267 (2003).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+neutrophil+apoptosis+by+type+1+IFN+depends+on+cross-talk+between+phosphoinositol+3-kinase,+protein+kinase+C-d,+and+NF-&#954;B+signaling+pathways.">Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-&#954;B signaling pathways.</a> J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).</li><li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells.">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).</li><li>Garcia-Garcia, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+activation+by+Fc&#947;R+in+human+peripheral+blood+neutrophils+detected+by+a+novel+flow+cytometry-based+method.">Nuclear factor activation by Fc&#947;R in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method.</a> J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).</li><li>Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc&#947;RIIA+and+Fc&#947;RIIIB+mediate+nuclear+factor+activation+through+separate+signaling+pathways+in+human+neuthophils.">Fc&#947;RIIA and Fc&#947;RIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils.</a> J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שיטת הטיהור המתוארת כאן מאפשרת בידוד של נויטרופילים unstimulated (PMN) עם טוהר יותר מ 95% (הערכה על ידי תצפית מיקרוסקופית), בזמן קצר. לפעמים הנויטרופילים יכולים להיות מזוהמים על ידי אריתרוציטים אם האחרון לא lysed לחלוטין. זה בדרך כלל אינו משפיע על הטכניקה, שכן בקלות ניתן להבחין אר...

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם היקפי 1. במהלך נויטרופילים דלקת והזיהום הם התאים הראשונים שמופיעים באתר המושפע שם הם משמשים כקו ההגנה הראשון 2. נויטרופילים יש מספר מנגנונים מיקרוביאלית 3 כולל phagocytosis, ייצור של מיני חמצן תגובתי, שחרורו של אנזימי ממוסס ידי degranulation, וייצור של ציטוקינים מעודדים דלקת 4.5. הנויטרופילים הם תאים קצרי חיים שמקבלים מופעלים במהירות דרך איתות מהקולטנים בתא שטח שונים. למרות נויטרופילים כבר נחשבים תאים סופניים עקב חייו הקצרים שלהם ובגלל שהם עוברים אפופטוזיס אלא אם הופעל במהלך התהליך הדלקתי 6, עכשיו זה ברור שהם יכולים גם לשנות פנוטיפ שלהם על ידי שינוי ברמה של שעתוק של גנים מסוימים. הייצור של ציטוקינים 5 והעיכוב של אפופטוזיס 7,8 הם שתיים אניפונקציות תא הפעלה תלויה mportant מוסדרות ברמה של שעתוק בנויטרופילים. הגורם הגרעיני κB (NF-κB) משתתף בשליטת התעתיק של 4 ייצור ציטוקינים וברגולציה של הישרדות תא ואפופטוזיס 9-11 בסוגי תאים שונים. את מסלולי האיתות שיובילו להפעלת פקטור גרעינית בדרך כלל נחקרו על ידי מבחני גן כתב או על ידי מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA). עם זאת, משום שהנויטרופילים הם תאים קצרי חיים, המחקר של תגובות מוסדרות תעתיק בתאים אלה לא ניתן לבצע עם מבחני גן כתב, שכן יש לא טכניקות יעילות לtransfection נויטרופילים. מבחני EMSA כבר בשימוש בנויטרופילים לחקור הפעלת פקטור גרעינית 12,13, עם זאת, במתודולוגיה זו היא מסובכת ויקרה משום שהיא כרוכה בשימוש בחומר רדיואקטיבי. Nucleofection היא טכניקה נוספת ששמשה successfully לtransfect מונוציטים 14. לפיכך, לפחות בתאוריה, הפעלת פקטור גרעינית יכולה להיות מזוהית בנויטרופילים ידי transfection (למרות יעילות נמוכה). עם זאת, טכניקה זו תהיה יקרה יותר, זמן רב וכנראה פחות כמותית. ניתוח מיקרוסקופי של תאי immunostained גם יכול לשמש כדי לזהות גורמים גרעיניים בגרעין. ואכן, יש לנו זוהיתי טרנסלוקציה NF-κB לתוך הגרעין זו דרך 15. למרבה הצער, טכניקה זו היא גם גוזלת זמן, פחות כמותית, ובכפוף להטיה של הצופה. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים בגרעינים מבודדים וimmunolabeled ידי cytometry זרימה. אנו מתארים טכניקות לבודד הנויטרופילים מדם היקפי אנושי, לעורר התאים האלה באמצעות integrins או קולטנים FC עם נוגדנים כנגד הקולטן, לבודד וגרעיני immunolabel, גרעינים ולנתח ידי cytometry זרימה (F1 igure). השיטה כבר משמש בהצלחה לאיתור 15 NF-κB וElk-1 16 גורמים גרעיניים בגרעיני נויטרופילים. הרגישות של שיטה זו מאפשרת זיהוי של שינויים קטנים ברמות פקטור גרעיניים בגרעין. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לנתח את הרמה של גורמי שעתוק בגרעינים מסוגי תאים אחרים.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Heparin </td>
 <td >PiSA (Mexico)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Dextran T500</td>
 <td >Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) </td>
 <td>T1-Dextran T500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Ficoll-Paque</td>
 <td >Pharmacia</td>
 <td>17-0320-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium chloride </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S7653 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium phosphate monobasic</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S9638</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium phosphate dibasic</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S9390</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>A2153</td>
 <td>Cohn Fraction V</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >HEPES</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>H3375 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Potassium chloride</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>P9541 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Magnesium chloride anhydrous </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>M8266 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >DL-dithiothreitol (DTT) </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>D9163</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Trypan Blue (0.4 % solution)</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>T8154</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Paraformaldehyde</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>P6148 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Triton X-100 </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>X100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Fetal bovine serum (FBS)</td>
 <td >GIBCO</td>
 <td>10437-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody IV.3</td>
 <td >Medarex (Annandale, NJ) </td>
 <td>025-1 </td>
 <td>Human-specific anti-FcRII (CD32) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody 3G8</td>
 <td >Medarex (Annandale, NJ) </td>
 <td>028-2 </td>
 <td>Human-specific anti-FcRIII (CD16) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody TS2/16</td>
 <td >Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) </td>
 <td>Donated by Dr. Martin Hemler </td>
 <td>Human-specific anti-&beta;1 integrin (CD29)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody IB4</td>
 <td >University of California, San Francisco </td>
 <td>Donated by Dr. Eric J. Brown </td>
 <td>Human-specific anti-&beta;2 integrin (CD18)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >F(ab')2 goat anti-mouse IgG </td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55468</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG</td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55522</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG</td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55665</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-NF-&kappa;B p50</td>
 <td >Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td>
 <td>sc-114</td>
 <td>Rabbit polyclonal antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-NF-&kappa;B p65</td>
 <td >Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td>
 <td>sc-109</td>
 <td>Rabbit polyclonal antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15-ml centrifuge tube</td>
 <td >Corning</td>
 <td>430791</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50-ml centrifuge tube</td>
 <td >Corning</td>
 <td>430291</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge, Sorvall Tabletop</td>
 <td >Dupont Instruments</td>
 <td>RT 6000D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH-meter</td>
 <td >Corning</td>
 <td>340</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-20</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-200</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123601</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-1000</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123602</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hemocytometer</td>
 <td >Fisher Scientific</td>
 <td>0267110</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope</td>
 <td >Nikon </td>
 <td>Eclipse E600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope</td>
 <td >Nikon </td>
 <td>TMS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Bath Incubator</td>
 <td >Fisher Scientific </td>
 <td>2IS-M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td >Eppendorf</td>
 <td>5414C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td >Eppendorf</td>
 <td>5418</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flow Cytometer</td>
 <td >Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) </td>
 <td>FACScalibur </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם היקפי. תאים אלה הם ראשונים שמופיעים באתרים של דלקת וזיהום, ובכך להפוך את קו ההגנה הראשון נגד פולשי מיקרואורגניזמים. נויטרופילים בעלי פונקציות מיקרוביאלית חשובות כגון phagocytosis, שחרורו של אנזימי ממוסס, וייצור של מיני חמצן תגובתי. בנוסף לפונקציות בטחוניות החשובות אלה, נויטרופילים לבצע משימות אחרות בתגובה לזיהום, כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. ציטוקינים לגייס לויקוציטים האחר המסייעים לנקות את הזיהום, ועיכוב של אפופטוזיס מאפשר נויטרופילים לחיות זמן רב יותר באתר של זיהום. פונקציות אלה מוסדרות ברמה של שעתוק. עם זאת, משום שהנויטרופילים הם תאים קצרי חיים, המחקר של תגובות תעתיק מוסדר בתאים אלו לא ניתנים לביצוע בשיטות קונבנציונליות גן כתב מאז אין אפיםטכניקות cient עבור transfection נויטרופילים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים בגרעינים מבודדים וimmunolabeled ידי cytometry זרימה. אנו מתארים טכניקות לבודד נויטרופילים טהורים מדם היקפי אנושי, לעורר תאים אלו עם נוגדנים כנגד הקולטן, לבודד וגרעיני immunolabel, גרעינים ולנתח ידי cytometry זרימה. השיטה כבר משמש בהצלחה לאיתור NF-κB וElk 1-גורמים גרעיניים בגרעינים מנויטרופילים וסוגי תאים אחרים. לכן, שיטה זו מייצגת אפשרות לניתוח הפעלה של גורמי שעתוק בגרעינים בודדים מתוך מגוון של סוגי תאים.

שיטת הטיהור המתוארת כאן בדרך כלל מספק נויטרופילים unstimulated (PMN) עם טוהר יותר מ 95% (איור 1 א). PMN מבודד אז יכול להיות מגורה על ידי קולטנים מסוימים crosslinking עם נוגדנים חד שבטיים ספציפיים. יש לנו מגורה PMN דרך קולטנים וintegrins FC (1B איור). ברגע מגורה, PMN הם lysed וגרעינים...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry at JoVE.com

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם. נויטרופילים בעלי פונקציות מוסדרות תעתיק כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. פונקציות אלה יכולות להיות למדו בשיטה שהוצגה כאן, המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים על ידי cytometry זרימה בגרעינים בודדים

פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

a-simple-efficient-method-to-detect-nuclear-factor-activation-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Views.  University of Alberta. הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם. נויטרופילים בעלי פונקציות מוסדרות תעתיק כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. פונקציות אלה יכולות להיות למדו בשיטה שהוצגה כאן, המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים על ידי cytometry זרימה בגרעיני?...

Video: A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

הערכה כמותית של תאים חיסוניים רקמות חוט השדרה נפגע על ידי זרימת cytometry: השתמש חדשנית שיטת טיהור Cell

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...