עבודה זו מומנה על ידי מכון המחקר לופוס (ניו יורק, ניו יורק), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 וNIH UL1-TR00165. אנו מודים לד&quot;ר רוברט פ &#39;קימברלי להמשך התמיכה שלו.

כל התורמים שגויסו למחקר זה נתנו הסכמה מדעת בכתב והמחקר אושר על ידי אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם מוסדית המועצה לביקורת. 1. HUVEC תרבות ותת ראשוניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות אנושיים טבור וריד אנדותל (HUVEC) במבחנה במדיום גידול שלם שמורכב ממדיום של תאים הבזליים אנדותל (ראו רשימה של חומרים) בתוספת גורמי גדילת תא האנדותל. הערה: גורמי הגדילה בשימוש במחקר זה כוללים: רקומביננטי אדם 5 ng / ml עוריות Growth Factor (hEGF), הידרוקורטיזון 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר, 50 מ&quot;ג / מיליליטר גנטמיצין ו50 ng / ml amphotericin-B (GA-1000), 2 % שור סרום עוברי (FBS), 0.5 ng / ml אנדותל כלי הדם Growth Factor (VEGF),, פקטור 10 ng / ml אנושי פיברובלסטים Growth Factor-Basic עם הפרין (hFGF-B) 20 ng / ml אנושי רקומביננטי גדילה דמוי אינסולין ( R 3-IGF-1), 1 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית, ו22.5 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין. הבינוני המלאההוא הוכן בתחילה על 37 מעלות צלזיוס ואז יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש בתוך החודש 1 של הכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין בקבוק לתאים, צמיחה בינונית מלאה מתווסף לבקבוק 75 2 סנטימטר בתרבית רקמה (1 מיליליטר / 5 סנטימטר 2) ולאחר מכן את הבקבוק מותר לאזן ל37 ° C / 5% CO 2 באינקובטור humidified עבור לפחות 30 דקות. HUVEC אדם יהיה זרע ישירות לתוך בקבוק תרבות equilibrated זה בצפיפות של 2,500-5,000 תאים / 2 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד התקשורת היא equilibrating, להפשיר במהירות cryovial HUVEC המניה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לפזר את התאים בבקבוקון האחסון המקורי על ידי vortexing ולאחר מכן להוסיף אותם ישירות לבקבוק התרבות המכיל מדיום גידול equilibrated מראש HUVEC השלם כדי להשיג צפיפות של 2,500-5,000 תאים / 2 סנטימטר. נער בעדינות את הבקבוק כדי לפזר באופן שווה את התאים ולאחר מכן להחזיר את הבקבוק לחממה. תאים אלה מהווים כיום את מעבר 1 st. </li> &lt;li&gt; בינוני צריכים להיות שונה בכל יומיים עד שהתאים הם מחוברות 70-80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת ניתן לקצור HUVECs מהבקבוק התרבות עם טריפסין / EDTA. התקשורת והתרבות היא להישאף מצלוחיות התרבות ואחרי שטיפת PBS להסיר כל חלבון וסידן שנותר בתאים. פתרון טריפסין-EDTA 0.25% נוסף ובתוך 2-6 ניתוק תא דקות צריכים להיות ברור כפי שהוערך על ידי מיקרוסקופ אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר 90% מהתאים מעוגלים כלפי מעלה מהצלחת, לעצור את trypsinization ידי הוספת נפח שווה של מעכבי טריפסין 2x. כדי להקל על הקציר של תאים, להוסיף עוד כמות שווה של מדיום גידול שלם. להעביר את התאים מנותקים לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים המנותק ב225 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant, ולאחר מכן resuspend התאים 2-3 מיליליטר של מדיום גידול שלם. קבע את ריכוז תא ואת הכדאיות באמצעות hemacytometer וTrypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנצל הדואר נקטף תאים למחקר, מחדש זרע 75 סנטימטר נוסף 2 צלוחיות עם תאים בצפיפות של 10,000 תאים / 2 סנטימטר והמשך לשלב 2.2. לחלופין, אפשר להקפיא תאים בשלב זה למחקרים עתידיים. להקפאת תאים, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב225 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב את supernatant ו resuspend התא גלולה ב FBS המכיל DMSO 10% בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. ההשעיה התא הוא הועבר לאחר מכן לcryovials ומאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס לאחר ההקפאה של התאים במכל הקפאת תאים. </li></ol> 2. הכנת שכבת HUVEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בHUVECs מעבר 2 nd הקפוא: תחייה ותרבות. אם אתם משתמשים בתאים גדלים באופן פעיל, המשך לשלב 2.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את cryovial המכילה 2 HUVECs מעבר nd מצעד 1.8 במהירות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. העבר את התאים מcryovial לצינור צנטריפוגות סטרילי 15 מיליליטר ולהוסיף 10 מיליליטר Medi צמיחהאממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר ולשאוב supernatant כדי להסיר את DMSO שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה עם מדיום גידול שלם ולהעביר את התאים לתוך בקבוק 75 2 סנטימטר. הוסף בינוני צמיחה להיקף כולל על 20-25 מ&quot;ל ולדגור על 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון חזותי את תרבית התאים למפגש כל יום עם שינויים בתקשורת בכל יומיים. בדרך כלל בתוך 2-4 ימים, תאים יגיעו 80-90 מפגש% בו בזמן שהם יהיו מוכנים לשימוש בassay תא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את המנה התרבות שתשמש בחדר הזרימה (ראה סעיף 5), להוסיף 1 מיליליטר של 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין ו0.05% (w / v) ג&#39;לטין לצלחת 35 מ&quot;מ רקמת תרבות וטפטף מספר פעמים על מנת להפוך את בטוח שכל שטח הצלחת מצופה. הסר את פתרון פיברונקטין וג&#39;לטין מוגזם ואוויר יבש הצלחת לפחות 30 דקות כדי לייעל את היווצרות מטריצת החלבון. ופתרון ibronectin וג&#39;לטין עשוי להיות בשימוש חוזר עד 10x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאי HUVEC משלב 2.2 באמצעות טריפסין-EDTA כפי שמתואר ב1.5-1.7 צעדים. זרעי 500,000 תאים לכל צלחת תרבית רקמה מצופה. הוסף 2 מיליליטר בינוני צמיחה בכל מנה ולדגור על 37 ° C / 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתאים לגדול למפגש כמו בשלב 2.2. תאים יש לבדוק מדי יום מבחינה ויזואלית עם שינויים בינוניים כל יומיים. לפני assay תא זרימה, ראש HUVEC עם 20 TNF-α ng / ml אדם ל4-6 שעות לupregulate ולעורר ביטוי מולקולת הידבקות. </li></ol> 3. מטוהר ליגנד ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר מעגל של 0.5 קוטר סנטימטר עם סמן או עט במרכז צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 μl צלחת 20 חלבון מיקרוגרם / מיליליטר באזור המסומן. השתמש בקצה פיפטה כדי להפיץ את חלבון פתרון כדי לכסות את האזור כולו במעגל בקוטר 0.5 סנטימטר. חשוב שלא לגעת או לגרד את פני השטח של דאיש. לדגור על C ° 37 במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף-חלבון 3x צלחת מצופה עם 1 מיליליטר של PBS (pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 50 μl BSA 1% באזור המסומן לחסום הלא ספציפי מחייב את הצלחת. דגירה עבור שעה 2 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x הצלחת החסום עם 1 מיליליטר של PBS כמו בשלב 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות חלבון chimeric יגנד רצפטור FC-הידבקות לציפוי. בניסוי זה, פתרון ICAM-1/Fc הכימרה ב25 מיקרוגרם / מיליליטר והכימרה P-Selectin/Fc ב0.5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS (pH 8.0) היה בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל האזור המסומן ב50 μl של מצע. דגירה הלילה בשעה 4 ° C. יש להשתמש במנה בתוך יומיים והאזור המצופה לא צריך להיות מותר להתייבש. הוסף PBS במידת צורך כדי לשמור על פתרון 50 μl על הצלחת. </li></ol> 4. הפרדת נויטרופילים (כל השלבים מבוצע בטמפרטורת חדר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קבלת הסכמה מדעת, לאסוף דם משתתף ידי phlebotomy לתוךצינור n קרישת איסוף דם או Vacutainer (EDTA או הפרין). לאחר איסוף דם, לדלל את דם 1:01 עם PBS לפני ההפרדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שכבת Ficoll שתי להפרדה PBMC ונויטרופילים ב50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. להוסיף ראשון 15 מיליליטר Ficoll הכבד (ראה רשימה של חומרים, ρ = 1.118-1.120), ולאחר מכן שכבה בזהירות 10 מיליליטר להדליק Ficoll (ראה רשימה של חומרים, ρ = 1.077-1.080) על גבי Ficoll הכבד. לא צריך להיות גבול ברור בין Ficoll האור ושכבות Ficoll כבדים. לבסוף, שכבה בזהירות 25 מיליליטר של דגימת הדם המדולל על גבי Ficoll האור מבלי להפריע את שכבת Ficoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות הצינור ב250 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: בלם הרוטור צנטריפוגות צריך להיות מחוץ לספינים האלה כדי לצמצם את השיבוש אפשרי של הפרדת התאים במהלך האטת הרוטור בסוף צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, השכבות הבאות (מלמעלה למטה) נוכחים: השכבה העליונה היא follo הפלזמהנישא על ידי שכבת PBMC על גבי שכבת Ficoll אור, שכבת נויטרופילים עם מעט תאי דם אדומים (RBC) היא בין האור וFicoll הכבדה ואחריו השכבה הכבדה Ficoll וRBCs בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ולהעביר את שכבת נויטרופילים לתוך צינור חדש 50 מיליליטר עם טפטפת העברה, להוסיף PBS לנפח סופי של 50 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 225 ל10 דקות בטמפרטורת חדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, יש עדיין עשוי להיות תאי דם אדומים מעורבבים עם נויטרופילים. לשאוב supernatant אל 10 מיליליטר הסימן. Resuspend את כדור נויטרופילים-RBC על ידי תסיסה עדינה של הצינור (או vortexing מהירות נמוכה קצר) ולאחר מכן לשטוף שוב עם 50 מיליליטר של PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף את השני, לשאוב supernatant. כדי להסיר את תאי הדם האדומים לזהם, resuspend תאי pelleted בPBS שיורית על ידי תסיסה (או vortexing הקצר), להוסיף 25 מיליליטר H 2 O ועדינות מערבולת 10 שניות לlyse RBC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מיליליטר של .1.8% NaCl ומייד לערבבעל ידי צנטריפוגה ב225 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. עכשיו צריך להיות lysed RBC לזהם עוזב תא גלולה נויטרופילים לבנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את התא גלולה נויטרופילים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend נויטרופילים המבודדים במדיום RPMI עם FBS 10% ולקבוע את ריכוז התאים תחת מיקרוסקופ אור עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את צפיפות התאים ל -500,000 תאים / מיליליטר עם שלמים RPMI-10% בינוניים FBS. </li></ol> 5. תזרים לשכת הידבקות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את תא הזרימה. מניחים את צלחת 35 מ&quot;מ המכילה HUVECs המחוברות או ligands קולט הידבקות מטוהר על שולחן מיקרוסקופ. חבר את זרימת צלחת הקאמרית מקביל למשאבת מזרק, שואב אבק ולהשאיר קו אחד פתוח לקלט נויטרופילים. הכנס את תא הזרימה על גבי הצלחת ולהדק את תא זרימת ההרכבה 13. (ראה איור 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תכנית הקלטת וידאו על לא מחשב המחוברo למיקרוסקופ. התאם את השדה ואת המיקוד של מיקרוסקופ עד שדה ברור עם תאי HUVEC גדלו באופן מלא או שדה בתוך אזור ציפוי יגנד הוא גלוי לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות משאבת המזרק, יש לשטוף את תא הזרימה עם מדיום RPMI. ודא שאין בועות אוויר בתוך התא או שורת קלט נויטרופילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, נויטרופילים עשויים להיות דרוכים עם מינון נמוך fMLP (10 -8 M) למשך 10 דקות. זה יאפשר התאמה של הרמה הבסיסית של הפעלת נויטרופילים בין תורמים שונים 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשאבת המזרק כדי להזריק נויטרופילים לתא הזרימה במהירויות מוגדרות (מהירות של 350 μl / min, אשר שוות מאמץ גזירה של 1.5 dynes / 2 סנטימטר משמש במחקר זה). להקליט וידאו. בגלל הידבקות נויטרופילים יכולה להתרחש במהירות, וידאו באורך של 4-5 דקות בדרך כלל מספיק כדי לכמת אירועי הידבקות לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא חסיד מוגדר כתא שזז בקוטר תא פחות מאחדתוך 5 שניות על HUVEC או משטח יגנד המצופה 15,16. לספור את המספר הכולל של תאים חסיד בתחום קיים בוידאו שהוקלט באמצעות הכלל הזה. על ידי הקלטת קטעי וידאו באורך דומה עם נויטרופילים של תורמים שונים, אפשר לחשב את התאים / דקות חסיד להשוות את מאפייני ההדבקה בין תורמים שונים. </li></ol>

<ol>
	<li>Harley, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+in+women+with+systemic+lupus+erythematosus+identifies+susceptibility+variants.">Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants.</a> in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+ICAM1-ICAM4-ICAM5+Locus+Is+Associated+with+Systemic+Lupus+Erythematosus+Susceptibility+in+Multiple+Ancestry+Populations.">Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations.</a> Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+leukocyte+recruitment+in+the+inflammatory+process.">Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process.</a> Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).</li><li>Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neutrophil-endothelial+cell+adhesion+in+inflammatory+disorders.">Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders.</a> J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).</li><li>Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+inflammatory+injury.">Adhesion molecules and inflammatory injury.</a> FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).</li><li>Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+of+LFA-1+and+Mac-1+with+intercellular+adhesion+molecule-1+in+facilitating+adherence+and+transendothelial+migration+of+human+neutrophils+in+vitro.">Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro.</a> J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).</li><li>Marlin, S. D., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+intercellular+adhesion+molecule-1+(ICAM-1)+is+a+ligand+for+lymphocyte+function-associated+antigen.">Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen.</a> Cell. 51 (5), 813-819 (1987).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+Distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65 (5), 859-873 (1991).</li><li>Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+steps+involved+in+the+transition+to+stationary+adhesion+of+rolling+neutrophils:+A+brief+review.">Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review.</a> Microcirculation. 7, 385-394 (2000).</li><li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber.">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).</li><li>van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+a+parallel-plate+flow+chamber+for+studying+cellular+adhesion+to+solid+surfaces.">Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).</li><li>Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+flow+in+the+parallel+plate+flow+chamber:+Implications+for+cell+capture+studies.">Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies.</a> Biophys. J. 67, 889-895 (1994).</li><li>Kucik, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Adhesion+Under+Flow+Conditions.">Measurement of Adhesion Under Flow Conditions.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Lupus+Associated+ITGAM+Variants+Alter+Mac-1+Function+on+Neutrophils.">Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils.</a> Arthritis. Rheum. , (2013).</li><li>Bacabac, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shear+stress+in+parallel-plate+flow+chambers.">Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers.</a> J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).</li><li>Kucik, D. F., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, ., Goosmann, U., C, A., Zychlinsky, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. 36 (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J Vis Exp. (17), 745 (2008).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+variations+in+absolute+wall+shear+stress+levels+within+one+species+and+between+species.">Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species.</a> Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).</li><li>Nagaoka, T., Yoshida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+evaluation+of+wall+shear+stress+on+retinal+microcirculation+in+humans.">Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מנחה את ההפרדה ובידוד של נויטרופילים הופעלו מינימאלי לכימות זהירות של הידבקות נויטרופילים בתנאי לחץ העצום. הידבקות נויטרופילים היא תהליך קריטי בדלקת. מאחר וריאנטים גנטיים במולקולות רבות בתהליך הזה כבר הוכיחו לנטייה להתפתחות של מחלה אוטואימונית 1,2, נדרשת מערכת assay מסוגלת כמותית הערכת הידבקות משרד נויטרופילים אנושית. השיטה שתוארה בפרוטוקול זה מאפשרת הקביעה זהירה וכמותי של פוטנציאל הדבק האיתן של הנויטרופילים בסביבה מבוקרת במבחנה תחת לחץ העצום. שיטה זו ובכך מאפשרת ההשוואה הישירה של הידבקות נויטרופילים הכמותי בין אנשים genotyped כדי לקבוע את החשיבות של שונות גנטיות במולקולות הדבקת 14. כמה שלבים בשיטה זו ראויות לשיקול דעת לשם השגהתוצאות כמותיות דואר מאוד לשחזור. בהכנת HUVEC, זה קריטי להשגה 100% מפגש תא לפני השימוש בהם בתא הזרימה. לשימוש במשטחים מצופים יגנד מטוהר, אזור ציפוי מצע לא צריך להיות מותר להתייבש כדי למנוע denaturing יגנד. בנוסף, ההכנה של נויטרופילים האנושיים היא קריטית להצלחה של הניסוי. נושאים מרכזיים בבידוד נויטרופילים מהדם כוללים בעדינות טיפול על ידי מזעור vortexing כדי להימנע מהפעלה, שמירה על התאים בטמפרטורת חדר (כלומר הדם לא צריך להיות מאוחסן בצעדים קרח וצנטריפוגה צריכה להתבצע בטמפרטורת חדר) והשלמת את הבידוד והניסוי בסכום של לפחות זמן אפשרי. ישנן שיטות בידוד נויטרופילים נוספות שיכול גם להיות מנוצל כדי להכין את התאים למבחנים אלה 17,18. ממבחני פרספקטיבה, הידבקות מעשית באמצעות נויטרופילים אנושיים מבודדים טרי<html> צריך להיות יזם בתוך 3-6 שעות לאחר phlebotomy המשתתף. כנויטרופילים רגישים במיוחד לטיפול, פעמים ממושכות בין תיקו הדם והשימוש עלולות להשפיע על תוצאות assay. קביעה זהירה של ריכוז תאי נויטרופילים לפני assay תא הזרימה היא גם הכרחית כדי להשיג תוצאות מדויקות ושחזור. במהלך assay תא זרימה, חשוב לפקח על קלטת וידאו בקפידה כדי להבטיח שמהירות הזרימה עולה בקנה אחד, ואין מערבולת לכל אורך הניסוי. שינויים בזרימה במהירויות או הנוכחות של מערבולת יחייב שהניסוי יחזור על עצמו. לאחר הניסוי, חשוב גם להעריך את הנויטרופילים שנותרו מיקרוסקופי כדי להבטיח שהנויטרופילים אינם מקפצים. התקבצות בשלב זה היה מציין כי נויטרופילים הפכו הופעלו שיכולה לשנות באופן משמעותי את צפיפות נויטרופילים במהלך הניסוי. תוכן &quot;&gt; תא הזרימה יוצר מתח ליד הומוגנית העצום בתוך החדר (τ = 6Qμ / (WH 2), שבו Q = קצב זרימה, μ = צמיגות דינמית, ו= רוחב w של תא הזרימה, H = גובה של תא זרימה 15). במחקרים שלנו, השתמשנו בקצב זרימה של 350 μl / min להידבקות נויטרופילים, דבר שיוצר לחץ העצום של 1.5 dynes / 2 סנטימטר (w = 0.25 סנטימטר, h = 0.01 פנימה, את הצמיגות של מים על 37 מעלות צלזיוס (0.007 יציבות) שימשה כקירוב לצמיגות של תקשורת RMPI). לתא זרימה ספציפי, ניתן לשנות את קצב הזרימה על מנת להשיג רמות של מתח צרוף שונות לחקות את התנאים פיסיולוגיים שונים. מאמץ גזירה פיסיולוגי אופייני בכלי דם אנושיים יכולים טווחים בין .5-5.0 dynes / סנטימטר 13,16. גזירת לחץ בכלי דם אחרים ובעלי חיים אחרים היו רשומים בטבלה 1 113,16,19 20. בעוד שהשיטה שלנו התמקדה במחקר של ההידבקות של neutrophi אדםls, שיטה זו אינה מוגבלת לנויטרופילים והוא יכול בקלות להיות מיושם על הידבקות או לימודים מתגלגלים של סוגי תאים אחרים עם שינויים פשוטים. כמו כן, מצעים בשיטה זו ניתן לשנות למטרות שונות. למרות שפרוטוקול זה הוא להתאמה בקלות למחקרים שונים, יש כמה מגבלות. הפרוטוקול כפי שמיושם כאן דורש מספר גדול של תאים ראשוניים לניתוח. זה עלול למנוע ניתוח של תאים ראשוניים מבעלי חיים קטנים. בנוסף, הצורך לשתק ligands הידבקות מטוהר בקונפורמציה פעילה / ה עלול להגביל את הטווח של ligands. השימוש בחלבוני Fc היתוך משפר באופן משמעותי את הסיכויים להשגת קונפורמציה יגנד הנכון על פני השטח הצלחת. יחד עם זאת, יש השיטה שלנו גמישות משמעותית לאפשר לניתוח כמותי של אירועי הידבקות. מחקרים אלה ישפרו את ההבנה שלנו של זוגות הקולטן ליגנד הידבקות, ואת חשיבות פונקצית הפוטנציאל של וריאנטים גנטיים באופן משמעותיבחלבונים אלה, בפתוגנזה של מחלות בבני אדם.

וריאנטים גנטיים בשני β 2 integrins ובligands ICAM כעת מוכרים להיות קשורים להתפתחות של 1,2 מחלה אוטואימונית. קביעת ההשלכות התפקודית של וריאנטים אלה בתאים שמקורם אנשים עם גרסאות אלה היא הכרחית להבנה של אופן שהגרסות אלה תורמות להיווצרות מחלה אוטואימונית שלנו. מחקרים פונקציונליים, כגון לאפשר לקביעת המנגנונים שבאמצעותם וריאנטים גנטיים מתרחשים באופן טבעי לעצב את התגובה החיסונית בשתי בריאות ומחלה. בדוגמא הספציפית של SLE, עכשיו אנחנו יודעים שגרסות בITGAM (CD11b) ויגנד, ICAM-1, חזק לקשר עם התפתחות מחלת 1,2. בגלל נויטרופילים הם קריטיים בתגובות דלקתיות, המחקר הכמותי של הידבקות נויטרופילים עשוי לספק תובנות מכניסטית לתוך כמה וריאנטים גנטיים בITGAM / ICAM לשנות את דלקת. NeutropHIL הידבקות משרד לתאי אנדותל (EC) הוא תהליך מוסדר מאוד וממלא תפקיד חיוני בתגובות דלקתיות 3,4. הידבקות החברה של נויטרופילים כדלקמן מתגלגלת ראשוניים נויטרופילים ולכידה על EC וסופו של דבר יכולה לגרום לגלגול in vivo. תהליכים אלה כרוכים בסוגים רבים של מולקולות הדבקות, כולל ICAM-1, ICAM-2, P-selectin, E-selectin בתאי האנדותל וβ 2 integrins על נויטרופילים 5-9. לפיכך, כימות זהיר של הידבקות נויטרופילים מתורמים עם גרסאות allelic שונות של מולקולות הדבקות יהיה חשוב להבין את ההשלכות תפקודיות ופתולוגית של ווריאנטים גנטיים אלה. שימוש ניסיוני של תא זרימה יכול ליצור סביבה במבחנה עם לחץ הגזירה נוזל דומה לזה שנצפה בסביבת כלי דם בvivo 10-12. ואכן, assay תא זרימה בשילוב עם umbili אדםתא קאל אנדותל הווריד (HUVEC) יכול לחקות את סביבת vivo של כלי דם. באמצעות שיטה זו, ניתן ללמוד את מאפייני דבק סלולריים כוללים כלפי תא האנדותל. בנוסף, הסביבה מבוקרת מאוד של תא הזרימה מאפשרת גם הערכה של תא מחייבת לליגנד הידבקות מטוהר כגון ICAM-1 כדי להקל על המחקר של אינטראקציות רצפטור ליגנד ספציפיות. אנו מציגים כאן שיטת ניצול מערכת assay תא זרימת הידבקות ללמוד את מאפייני ההדבקה של הנויטרופילים בדם היקפיים אדם לHUVEC ומצעים ליגנד מטוהרים. שימוש בשיטה זו בתאים מתורמים להביע גרסאות allelic מולקולת הידבקות שונות מאפשרת לנו להעריך כיצד וריאנטים הגנטיים אלה יכולים לשנות את הידבקות משרד נויטרופילים אנושית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="677">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:677px;">Table of Reagents Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Name of reagent</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:268px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">25200-056</td>
			<td style="width:268px;">with Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">2X Trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">R-002-100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">35mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430165</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:192px;">75cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430641</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Dage-MTI</td>
			<td style="width:111px;">Model 300T-RC</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Cell freezing container&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Biocision</td>
			<td style="width:111px;">BCS-045</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-3156</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EGM-2 Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc</td>
			<td style="width:111px;">CC-4176</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth factors for basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">FBS</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">10082-147</td>
			<td style="width:268px;">Certified, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Gelatin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G9391</td>
			<td style="width:268px;">from bovine skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:107px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-671-51B&#160;</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F2006</td>
			<td style="width:268px;">from human plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:107px;">Glyco Tech</td>
			<td style="width:111px;">31-001</td>
			<td style="width:268px;">Circular flow chamber for 35mm dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">47729</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Histopaque-11191</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">11191</td>
			<td style="width:268px;">Heavy ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">HUVEC</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-2517A</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">ICAM-1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">720-IC</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Lymphocyte separation medium</td>
			<td style="width:107px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:111px;">25072CV</td>
			<td style="width:268px;">Light ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:111px;">Axiovert 100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875</td>
			<td style="width:268px;">with L-Glutamine and Phenol Red&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Protein A</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6031</td>
			<td style="width:268px;">resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">P-Selectin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">137-PS</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:107px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:111px;">KDS270</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">TNF-a</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">PHC3015</td>
			<td style="width:268px;">Recombinant Human Protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neutrophil flow chamber adhesion assay

הידבקות משרד נויטרופילים לתאי האנדותל ממלאת תפקיד קריטי בדלקת בשתי בריאות ומחלה. התהליך של הידבקות משרד נויטרופילים כרוך מולקולות הדבקה שונות, כולל בני משפחת integrin β 2 ונגד הקולטנים שלהם של משפחת ICAM. לאחרונה, וריאנטים גנטיים מתרחשים באופן טבעי בשני β 2 integrins וICAMs מדווחים להיות קשורים למחלה אוטואימונית. לפיכך, קיבולת הדבק כמותית של נויטרופילים מאנשים עם צורות allelic משתנות של מולקולות הדבקות אלה חשוב ללמוד ביחס למנגנוני התפתחות של אוטואימוניות. מחקרי הידבקות במערכות תא זרימה יכולים ליצור סביבה עם לחץ הגזירה נוזל דומה לזה שנצפה בסביבת כלי דם בגוף חי. כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות מערכת תא זרימת assay כדי ללמוד את מאפייני הדבקה כמותית של נויטרופילים דם ההיקפיים אדםים לתא האנדותל וריד טבור אנושי (HUVEC) ומצעים ליגנד מטוהרים. בשיטה זו, ניתן להעריך את יכולות דבק נויטרופילים מתורמים עם גרסאות allelic שונות בקולטנים הידבקות והשוואה. שיטה זו יכולה גם להיות שונה כדי להעריך את ההידבקות של סוגי תאים עיקריים אחרים או שורות תאים.

דוגמאות של נויטרופילים מחייבות ליגנד מטוהר (ICAM-1/P-Selectin) תא זרימה מצופה (איור 2) או של נויטרופילים מחייבים HUVEC assay תא זרימה מצופה (איור 3) מוצגים. כפי שניתן לראות בדמויות, נויטרופילים ימשיכו לצבור / לדבוק משטח המצופה או HUVEC בתנאים של זרימה רציפה. בתנאי הניסוי הטיפוסיים שלנו, אנו יכולים לצפות 50-70 נויטרופילים אנושיים בתקיפות שמירה על המשטח המצופה או HUVEC במהלך תקופת הקלטה ארבע דקות. עם זאת, גרסאות allelic של מולקולות נויטרופילים הידבקות, או גרסאות allelic במצע (ליגנד מטוהר או HUVEC), יכולה לשנות באופן משמעותי הידבקות נויטרופילים כמותיים 14. יש לנו גם להעריך את התלות של אירועי הידבקות נויטרופילים שנצפו במחקרים שלנו הזמן. בעוד אנו שמירה על תנאי זרימה מתמיד, זה אפשרי, כי מאפייני ההדבקה של התאים להשתנות עם הזמן. However, על קורסי זמן קצרים יחסית במחקרים שלנו, אנחנו לא שומרים שום הבדלים עקביים בשיעור ההידבקות לאורך זמן. לדוגמא, הערכת הידבקות ב1-2 נקודות הזמן דק בהשוואה להידבקות נצפתה בין נקודות הזמן דק &#39;3-4 אינה שונה באופן עקבי. כמובן, אם תאים להיות מגורה במהלך ניסוי ההידבקות, אז שינויים במאפיינים דבקים לאורך זמן ניתן היו לצפות. במחקרים שלנו, אנחנו בשליטה על הפעלת נויטרופילים מושרה בידוד במכוון תחול תאים עם המינון נמוך fMLP (10 -8 M) עבור 10 דקות לפני המחקר. תאי אנדותל (HUVEC במחקרים שלנו) גם דורשים הפעלה לפני upregulate ביטוי מולקולת הידבקות להידבקות משרד יקוציט אופטימלי. בהעדר הטיפול מראש, תאי אנדותל (HUVECs) יתמכו הידבקות נויטרופילים מעט מאוד. במחקרים שלנו, השתמשנו 10 ng / ml טיפול TNFα ל4-6 שעות לפני השימוש. IL-1β (10 ng / ml) ו<html> גם LPS (0.5-1 מיקרוגרם / מיליליטר) יכול לשמש מראש להפעיל את תאי האנדותל. חשוב לציין, שלא טופל HUVEC יכול לשמש כביקורת שלילית על מנת להבטיח כי הידבקות תא נגרמת על ידי ספציפי אינטראקציות תא (בתיווך הקולטן) נויטרופילים-אנדותל. לחלופין, ניתן להשתמש בנוגדנים נגד הקולטן לחסימת קולטנים ספציפיים כדי להעריך את הספציפיות של הידבקות. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> איור 1. תצורת תא זרימה על הבמה מיקרוסקופ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; יריות איור 2 מסך מוידאו מדגם של נויטרופילים דבקות ICAM-1/P-Selectin משטח מצופה בנקודות זמן שונות (:. 0 נקודת זמן, ב &#39;: נקודת זמן 1 דקות, C: 2 נקודת זמן דק&#39;, ו-D: נקודת זמן 4 דק &#39;). הריכוז של ICAM-1 הוא 25 מיקרוגרם / מיליליטר ו-P-selectin הוא 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר. זרימת נויטרופילים מהירות היא 350 μl / min עם צפיפות נויטרופילים ב500,000 תאים / מיליליטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> יריות איור 3 מסך מוידאו מדגם של נויטרופילים הקפדה על משטח HUVEC מצופה בנקודות זמן שונות (: 0 נקודת זמן, ב &#39;: נקודת זמן 1 דקות, C: 2 נקודת זמן דק&#39;, ו-D: נקודת זמן 4 דק &#39;)..זרימת נויטרופילים מהירות היא 350 μl / מיליליטר עם צפיפות נויטרופילים ב500,000 תאים / מיליליטר. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr ><td> מין </td><td > מקום </td><td > מאמץ גזירה (dynes / 2 סנטימטר) </td></tr><tr ><td> אנושי </td><td> עורק caroid נפוץ </td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td> אנושי </td><td> עורק branchial </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> אנושי </td><td> עורק הירך נפוץ </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> אנושי </td><td> אב העורקים suprarenal </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> אנושי </td><td> אב העורקים Supraceliac </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> אנושי </td><td> עורק fermoral שטחי </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> אנושי </td><td> Venules </td><td> .5-5.0 </td></tr><tr ><td> אנושי </td><td> arterioles הראשונה רשתית </td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td> אנושי </td><td> arterioles השנייה רשתית </td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td> אנושי </td><td> venules הראשונה רשתית </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> אנושי </td><td> venules השנייה רשתית </td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td> כלב </td><td> עורק caroid נפוץ </td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td> ארנב </td><td> עורק caroid נפוץ </td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td> עכברוש </td><td> עורק caroid נפוץ </td><td> 46.6 </td></tr><tr ><td> עכבר </td><td> עורק caroid נפוץ </td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td> כלב </td><td> עורק הירך נפוץ </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> ארנב </td><td> עורק הירך נפוץ </td><td> 156.8 </td></tr><tr ><td> עכברוש </td><td> עורק הירך נפוץ </td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. מאמץ גזירה לדוגמא באיברים שונים ומינים שונים. * סיכם מאזכור 13, 16, 19, ו20.

Watch this Scientific Journal Video about Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay at JoVE.com

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

שיטה של ​​quantitating הידבקות נויטרופילים היא מדווחת. שיטה זו יוצרת זרימת סביבה דינמית דומה לזו שנתקלה בה בכלי דם. זה מאפשר החקירה של הידבקות נויטרופילים לשתי מולקולות מטוהרים הידבקות (ליגנד) או מצע תא אנדותל (HUVEC) בהקשר דומה לסביבת in vivo עם לחץ העצום.

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.7K Views.  University of Alabama at Birmingham.  שיטה של ​​quantitating הידבקות נויטרופילים היא מדווחת. שיטה זו יוצרת זרימת סביבה דינמית דומה לזו שנתקלה בה בכלי דם. זה מאפשר החקירה של הידבקות נויטרופילים לשתי מולקולות מטוהרים הידבקות (ליגנד) או מצע תא אנדותל (HUVEC) בהקשר דומה לסביבת in vivo עם ...

Video: Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...