XHP כבר נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקי המכון הלאומי להזדקנות (NIHK01AG024496) ו יוניס קנדי ​​שרייבר המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NIHR21HD056530).

1. הפתרון ומדיה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי פתרון לטין: 0.1% (w / v) ג&#39;לטין DDH 2 O, autoclaved ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Matrigel ציפוי פתרונות. פתרון במלאי: להפשיר Matrigel איטי (10 מ&quot;ל) ב 4 ° C למשך הלילה, להוסיף 10 מ&quot;ל קר כקרח DMEM או DMEM/F12, מערבבים היטב aliquot 1 מ&quot;ל / צינור מתחת למכסה המנוע מעוקרים בתרבית רקמה, חנות ב -20 ° C. פתרון עבודה: הפשרה איטית 1 מ&quot;ל aliquot Matrigel על 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2, שעה להעביר 14 מ&quot;ל צונן DMEM או DMEM/F12 ומערבבים היטב מתחת למכסה המנוע מעוקרים בתרבית רקמה מיד לפני הציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון האדם ציפוי laminin: למהול 1 מ&quot;ל האנושי פתרון laminin (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בופר טריס NaCl, לאחסן ב -80 ° C, הפשרה איטית על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1-2) עם קרים כקרח DMEM או DMEM/F12 ל 12.5 מ&quot;ל פתרון עובד (40 מיקרוגרם / מ&quot;ל) מתחת למכסה המנוע מעוקרים בתרבית רקמה מיד לפני הציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גורם צמיחה מניות פתרונות (500 1000x): להמיס גורם גדילה ב 10 מיקרוגרם/ Ml במאגר מעוקרות (0.5% BSA, 1.0 מ&quot;מ DTT, גליצרול 10%, 1XPBS) ולאחסן כמו 50-100 μl / צינור aliquots ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HESC התקשורת: DMEM/F12 או KO-DMEM (80%), ק.א. החלפת בסרום (20%), L-alanyl-L-L-gln או gln (2 מ&quot;מ), חומצות אמינו חיוניות ממ (MNAA, 1X), ו β-Mercaptoethanol (100 מיקרומטר), מסונן ולאחסן ב 4 ° C, בתוספת bFGF 20 ng / ml לפני השימוש. או החלפה &quot;KO החלפת בסרום&quot; עם רכיבים מוגדרים: DMEM/F12 או KO-DMEM (100%), L-alanyl-L-L-gln או gln (2 מ&quot;מ), MNAA (1X), חומצות אמינו חיוניות ממ (MEAA , 1X), ו-β Mercaptoethanol (100 מיקרומטר), מסונן ולאחסן ב 4 ° C, בתוספת bFGF (20 ng / ml), אינסולין אנושי (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל), חומצה אסקורבית (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל), האדם activin (50 ng / ml), Albumax אלבומין / האנושי (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל), האדם transferrin (8 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לב HESC בידול התקשורת: DMEM/F12 (90%), FBS מוגדר (10%), ו-L-alanyl-L-L-gln או gln (2 mM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה המכילה nicotinamide (NAM): להוסיף Nבבוקר התקשורת HESC או לב HESC התקשורת בידול לריכוז סופי של 10 מ&quot;מ, מסונן חנות ב 4 ° C ושימוש בתוך 2 שבועות של הכנות. </li></ol> 2. ציפוי פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל צלחות עם ג&#39;לטין: להוסיף 2.5 מ&quot;ל / היטב פתרון ג&#39;לטין על 6 צלחות היטב דגירה לילה 37 ° C חממה humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות עם סמל laminin: צמרמורת ג&#39;לטין מצופה צלחות להסיר ג&#39;לטין, להוסיף 2.5 מ&quot;ל / Matrigel טוב או אדם ציפוי laminin פתרון עובד מראש צונן gelatinized 6-גם צלחות דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 3. Passaging וזריעה hESCs מובחן תחת תנאים מוגדרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מושבות hESC לגדול ל 5-7 ימים ישנים, לקחת צלחת תרבות hESC מיקרוסקופ כדי לנתח (טרום חמים לנתח הבמה 37 ° C) מתחת למכסה המנוע לנתח מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מושבות hESC להיות מפוצל. מורפולוגית, מושבות אלה צריך hESCs מובחן&gt; 75% (SMכל התאים קומפקטית), בדרך כלל אטום מעט (לא לבן שנערמו תאים, לא ברור הבדיל תאים) עם קצה מוגדר מתחת למיקרוסקופ לנתח. בזהירות מתאר המושבות נבחרים להסיר שכבת פיברובלסטים הבדיל המקיפים את המושבה ואת כל חלקי הבדיל (אם בכלל) של המושבה עם הקצה של קצה P2 פיפטה סטרילית או משך נימי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה הישנה צף המכיל תאים מובחנים מנותקת על ידי aspirating. לשטוף עם התקשורת hESC (ללא bFGF) פעם אחת. הוסף 3 מ&quot;ל / מדיה hESC טרי היטב המכיל 20 ng / ml bFGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את מושבות hESC מובחן לחתיכות קטנות, ולנתק עם קצה פיפטה סטרילית או זכוכית משך נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת התקשורת המכיל חתיכות המושבה מנותקת יחד צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. לשטוף את הצלחת פעם אחת עם מ&quot;ל 1 / מדיה hESC היטב המכיל 20 ng / ml bFGF ובריכת יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב Matrigel או פתרון laminin אדם מהצלחות טרי מצופה. Aliquot 4 מ&quot;ל / h יפהESC מדיה המכילה חתיכות המושבה לצלחת 6 באר. להעביר בעדינות את הצלחת באינקובטור ללא רועד לאפשר חתיכות זרע המושבה לילה ללא מפריע ב humidified 37 ° C חממה עם אווירה של 5% CO 2. </li></ol> 4. אינדוקציה הלב של hESCs תחת מערכת התרבות מוגדר עם Nicotinamide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו יום 3 לאחר זריעה, להסיר את רוב התקשורת הישנה מבאר כל הצלחת ולהשאיר התקשורת מספיק כדי לאפשר מושבות hESC להיות מתחת למים (לא לאפשר hESCs להתייבש). החלף עם 4 מ&quot;ל / מדיה hESC טרי היטב המכיל 20 ng / ml bFGF ו nicotinamide 10 מ&quot;מ (NAM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף המדיה הישנה עם המדיה hESC טרי המכיל 20 ng / ml bFGF ו 10 mM NAM בכל יום אחר, ולאפשר לב הנגרמת מושבות hESC לגדול ל 80-10 יום. עם חשיפת ל NAM, כל התאים בתוך המושבה יעברו שינויים מורפולוגיה תאים מובחנים גדולים ימשיכו להתרבות. מושבות תגדיל את גודל, ועל ידי 8-10 יום,תאים ד יתחילו להצטבר באזורים מסוימים של המושבות. </li></ol> 5. בידול הלב המשך בתרבות השעיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תרבות hESC הצלחת לנתח מיקרוסקופ (טרום חמים לנתח הבמה 37 ° C) מתחת למכסה המנוע לנתח מעוקרים. בזהירות מתאר במושבות להסיר שכבת פיברובלסטים המקיפים את המושבה (תאים מובחנים היגרו אל מחוץ למושבה) עם הקצה של קצה P2 פיפטה סטרילית או משך נימי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה הישנה צף המכיל תאים פיברובלסטים מנותקת על ידי aspirating. לשטוף עם התקשורת hESC (ללא bFGF) פעם אחת. הוסף 3 מ&quot;ל / מדיה hESC טרי היטב (ללא bFGF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הלב הנגרמת מושבות hESC לחתיכות קטנות, ולנתק עם קצה פיפטה סטרילית או זכוכית משך נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת התקשורת המכיל חתיכות המושבה מנותקת יחד צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. לשטוף את הצלחת פעם אחת עם מ&quot;ל 1 / מדיה hESC היטב (ללא bFGF) ובריכת יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 מ &#39;Aliquotl / גם בסרום ללא מדיה hESC המכיל חתיכות המושבה אל צלחת 6-היטב ultralow התקשרות דגירה של 37 ° C humidified בחממה כדי לאפשר אשכולות הסלולר צף (cardioblasts) כדי ליצור במשך ימים 4-5. </li></ol> 6. מכות ההבשלה הפנוטיפ Cardiomyocyte בתרבות דבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת התקשורת המכיל cardioblasts צף יחד צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה בסל&quot;ד 1400 במשך 5 דקות. לשאוב את המדיה הישנה כמו שאתה יכול להוסיף כמות זהה של טרי לב hESC התקשורת בידול המכיל 10 mM NAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב cardioblasts צף aliquot 4 מ&quot;ל / 6 היטב גם הצלחות. מעבירים את הצלחות ל 37 ° C חממה humidified לאפשר cardioblasts לצרף לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף לב hESC בידול מדיה המכילה 10 mM NAM בכל יום אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו יום 8, להחליף עם לב hESC מדיה ללא הבחנה NAM, וממשיכים להחליף לב HESC בידול התקשורת הדואראחרים מאוד היום. Cardiomyocytes מכות יתחילו להופיע על 1-2 שבועות של גידול מתמשך לאחר הנסיגה של NAM ולהגדיל במספרים עם הזמן, יכול לשמור על התכווצויות חזקות קצבית במשך 3 חודשים. </li></ol> 7. נציג תוצאות: Nicotinamide (NAM) מוצג מספיק כדי לגרום hESCs נשמר במערכת התרבות מוגדר המעבר pluripotency בלעדי פנוטיפ cardiomesodermal (איור 2 ב). בחשיפה של hESCs מובחן כדי NAM, כל התאים בתוך המושבה יעברו שינויים במורפולוגיה לתאי הבדיל גדול למטה להסדיר את הביטוי של אוקטובר 4 ולהתחיל לבטא את גורם שעתוק לב ספציפיים (CSX) Nkx2.5 ו α- actinin, עולה בקנה אחד עם פנוטיפ cardiomesoderm (איור 2 ב). תאים אלו מובחנים ימשיכו להתרבות מושבות העלייה בגודל. עצימות מוגברת של Nkx2.5 יהיהלצפות בדרך כלל באזורים של מושבות תאים שבו מתחילים להצטבר (איור 2 ב). לאחר מנותקת, hESCs NAM שטופלו יהוו אשכולות הסלולר צף (cardioblasts) בתרבות ההשעיה להמשיך בתהליך התמיינות לב. לאחר התרת cardioblasts לצרף והמשך לטפל עם NAM שבוע 1, cardiomyocytes להכות יתחילו להופיע כ 1-2 שבועות של גידול מתמשך לאחר הנסיגה של NAM עם עלייה דרסטית יעילות לעומת בידול רב השושלת ספונטנית של hESCs ללא טיפול במשך אותה תקופה (איור 2C). תאים בתוך אשכולות cardiomyocyte להכות יביע סמנים אופייניים cardiomyocytes, כולל Nkx2.5 ו α-actinin (איור 2C). הצירים של cardiomyocytes להכות אושרו על ידי פרופילים חשמל להיות חזקה, קצבית, מתואמת היטב, היטב לרכבת, עם דחפים רגיל מזכיר את p-QRS-T-מתחמי לראות אלקטרודות משטח הגוף אק&quot;ג קליני (איור 2C, גם לראות את הווידאו). Cardiomyocytes יכול לשמור contractility חזק שלהם במשך 3 חודשים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> באיור 1. תוכניות בסך של הגישה הקונבנציונלית לעומת הגישה מולקולה קטנה-אינדוקציה עבור בידול של אדם בתאי גזע pluripotent כלפי תאים פונקציונלי מיוחדים. (א) סכימטי של הגישה המקובלת שימוש רב השושלת הנטייה של בתאי גזע pluripotent אנושי באמצעות בידול נבט ספונטנית השכבה. (ב) סכימטי של אינדוקציה מבוקר היטב יעיל בתאי גזע אנושיים pluripotent בלעדי שושלת קליני רלוונטי במיוחד על ידי הוראה פשוטה של מולקולות קטנות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> איור 2. Nicotinamide גורם מפרט לב השושלת הישירה של pluripotency בתנאים מוגדרים התקדמות לכיוון מכה cardiomyocytes. (א) סכמטי המתאר של קו הזמן פרוטוקול של בידול לב מכוונת של hESCs. (ב) עם חשיפה של hESCs מובחן כדי Nicotinamide (NAM) תחת מערכת התרבות מוגדר, גדול הבדיל אוקטובר-4 (אדום) בתאי שלילי בתוך המושבה החלו להופיע, לעומת ללעוג שטופלו (DMSO) hESCs כמו שליטה. NAM-Induced תאים אוקטובר-4-שלילי החלו להביע Nkx2.5 (ירוק) ו α-actinin (אדום), עולה בקנה אחד עם בידול לב מוקדם. עוצמת וגברה של Nkx2.5 נצפתה בדרך כלל באזורים של המושבה שבו התאים החלו להיערם. כל התאים מסומנים על ידי מכתים DAPI הגרעינים שלהם (כחול). (ג) NAM-Induced הלב, מחויב hESCs הניב cardiomyocytes מכות עם עלייה דרסטית יעילות, כפי שנבחנו על ידי clus הסלולרters כי מוצג התכווצויות קצובות (ראה פרופיל אלקטרו ואת קטעי וידאו), ואת immunopositive עבור Nkx2.5 (ירוק) ו α-actinin (אדום). תמונות שלב של נציג גדול cardiomyocyte אשכולות מכות ותמונות חשמל גבוה של כיווץ שרירי הלב נציג מוצגים (גם לראות קטעי וידאו המקביל). החצים מצביעים על מכות גדולות cardiomyocyte מצרר הקלטה אלקטרו. פרופיל אלקטרו של cardiomyocytes מכות מראה רגילה, נגרר, דחפים קצבי שמזכיר את p-QRS-T-מתחמי לראות אק&quot;ג קליניים. סולם ברים: 0.1 מ&quot;מ. וידאו: מתקשרת cardiomyocytes להבדיל בין NAM-Induced hESCs. סרטונים 1 ו -2 נציג להראות הכאת וידאו אשכולות cardiomyocyte בחודש על 1 ו -3 לאחר המצורף. וידאו 3 ו -4 נציג להראות התכווצות שרירי הלב בהספק גבוה יותר. גדולות 5 מראה typicaאני מקבץ קטן cardiomyocyte פועם הבדיל באופן ספונטני ללא טיפול NAM כביקורת מתוך hESCs. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">לחץ כאן כדי לצפות וידאו 1.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">לחץ כאן כדי לצפות וידאו 2.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">לחץ כאן כדי לצפות וידאו 3.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">לחץ כאן כדי לצפות 4 וידאו.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">לחץ כאן כדי לצפות וידאו 5.</a>

<ol>
	<li>Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+tissue+engineering:+a+review.">Myocardial tissue engineering: a review.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).</li><li>Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart.">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453, 322-329 (2008).</li><li>Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+repair.">Human embryonic stem cells and cardiac repair.</a> Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells.">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li><li>J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. , 282-1145 (1998).</li><li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson's+disease.">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li><li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature Methods. 2, 185-190 (2005).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells.">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li><li>Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+integration+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).</li><li>Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infracted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).</li><li>Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+improves+myocardial+performance+in+infarcted+rat+hearts.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).</li><li>Akazawa, H., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+transcription+factor+Csx/Nkx2-5:+Its+role+in+cardiac+development+and+diseases.">Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases.</a> Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).</li><li>Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li><li>Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+a+direct+reprogramming+strategy.">Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy.</a> Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).</li><li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li><li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li><li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence.">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem Cells. 28, 704-712 (2010).</li><li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres.">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים אינטרסים מתחרים. XHP הוא המייסד של Xcelthera. XHP ו EYS יש קניין רוחני הקשור hESCs.

אחד האתגרים הגדולים עבור המחקר הן התפתחותיות תרגום קליני כבר איך לתעל את פוטנציאל התמיינות רחב של pluripotent בתאי גזע אנושיים הפנוטיפ הרצוי ביעילות כצפוי. למרות תאים כאלה יכולים להבדיל באופן ספונטני במבחנה לתאים של כל שכבות הנבט ידי עובר שלב רב שושלת צבירה, ב hESC הנגזרות רב השושלת אגרגטים (גופים embryoid), רק חלק קטן מאוד של תאים (&lt;2%) באופן ספונטני להתמיין cardiomyocytes 13-15 (איור 1A). בעקבות immunoselection, האוכלוסיות מועשר של cardiomyocytes היו מסוגלים לתפקד כמו קוצבי לב ביולוגיים כדי להציל את תפקוד שריר הלב ניזוק מכנית אלקטרונית בעקבות הזרקה אל לב בבעלי חיים 13. במודלים של מכרסמים infarcted, engrafted hESC הנגזרות progenies לב הצליחו לשרוד ולהתפתח עד 12 שבועות, remuscular חלקיתize את הלב הפצוע ולשפר את תפקוד כויץ 14,15. עם זאת, יעילות ביצירת האדם הלב, מחויב תאים באמצעות בידול רב שושלת היוחסין של תאים pluripotent לבין סיכון גבוה השתלת tumorigenicity הבאים הפריע התרגום קליניים נוספים. פיתוח אסטרטגיות לערוץ פוטנציאל התמיינות רחב של hESCs pluripotent בלעדי כצפוי על הפנוטיפ לב חיונית רתימת העוצמה של הביולוגיה hESC בתחום הלב. על מנת להשיג אחיד ההמרה של אדם בתאי גזע pluripotent לשושלת מסוימת, אנחנו עובדים מערכת תרבות מוגדרת מסוגלים לבטח את הפצת hESCs מובחן לזהות תנאים לזירוז מבוקר היטב יעיל של hESCs pluripotent בלעדי מסוים בשושלת קליני רלוונטי על ידי הוראה פשוטה של מולקולות קטנות (איור 1B). מצאנו כי nicotinamide המושרה לב, שושלת מחויבות ישירה של phESCs luripotent תחת תרבות מוגדר כי עוד התקדם להכות cardiomyocytes עם יעילות גבוהה (איור 2). Nkx2.5 היא שעתוק נשמרת evolutionally homeobox גורם הכרחי להתפתחות מוטציות לב נורמלי של הגן הקשורים למחלות אנושיות לב מולדים (CHD), את הפגם הנפוץ ביותר הלידה האנושית 16. הביטוי של Nkx2.5 הוא הסמן המוקדם של תאים מבשר לב בכל החוליות שנבדקו עד כה חיונית septation לב ראויה היווצרות / הבשלה של מערכת הולכה חשמלית 16. ב החוליות, הופעת דפוס הביטוי Nkx2.5 מוקדם בערך בקנה אחד עם העיתוי ואת שטח של מפרט הלב של העובר מוקדם, Nkx2.5 גן ממשיכה לבוא לידי ביטוי באמצעות פיתוח בלב 16. במודל hESC שלנו, הופיע NAM כדי לעורר את הלב אינדוקציה ישירה hESCs pluripotent באמצעות קידום הביטוי של הלב ספציפי transcriגורם ption Nkx2.5 בתהליך שעשוי לחקות את המפרט של cardiomesoderm מ epiblast pluripotent ב cardiogenesis עובריים אנושיים. מחקרים עתידיים יגלה מולקולות בקרה גנטית epigenetic בהתפתחות הלב האנושי חלופות, אשר עשוי לסלול את הדרך לשלוט מולקולה בתיווך קטן אפנון ישיר של גורל pluripotent hESC כאשר הנובעות שושלות קליני רלוונטי עבור טיפולים רגנרטיבית. ללא טיפול NAM, &lt;hESCs 2% יעברו התמיינות ספונטנית תוך מכות cardiomyocytes 12-15. באמצעות טיפול NAM, הצלחנו לייצר&gt; 95% מבשרי לב עובריים cardiomyocytes מכות&gt; 50% מן hESCs שמרו תחת תרבות להגדיר בתהליך שעשוי לחקות הלב האנושי ההתפתחות העוברית 12. לאחרונה, ידוע לב, גורל גנים בקביעת שימשו transdifferentiate fibroblasts העכבר לתוך שלאחר הלידה cardiomyocytes מכות עם יעילות נמוכה של 0.5% &lt;17, 18 &lt;/ Sup&gt;. עם זאת, reprogrammed התאים הסומטיים יש היסטורית היה קשור ביטוי גנים חריגים להזדקנות מואצת עם התועלת הטיפולית לקויי 19-21. לבסוף, פרוטוקול הקמנו כאן מוגבל hESCs pluripotent נגזר מסת התאים הפנימית (ICM) או epiblast של הבלסטוציסט האנושי 4,5, אינן חלות pluripotent תאים אחרים, כולל בעלי חיים שמקורם ESCs, ESCs נגזר morula מוקדם יותר (שמונה תאים) בשלב עוברי 22, ותאי reprogrammed מלאכותי 23.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> לטין </td><td> סיגמא </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> במדעי החיים BD </td><td> 356231 </td><td> גורם צמיחה מופחת </td></tr><tr><td> האדם laminin </td><td> סיגמא </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> סיגמא </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-החוצה בסרום תחליף </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> ממ פתרון חומצת אמינו חיונית (MNAA, 100x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> ממ פתרון חומצות אמינו (MEAA, 100x) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אסקורבית </td><td> סיגמא </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> האדם transferrin </td><td> סיגמא </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> האדם bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18 ב </td><td></td></tr><tr><td> האדם אינסולין </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> האדם activin </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> מוגדר FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6 טוב מצורף ultralow צלחת </td><td> קורנינג </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6 גם צלחת </td><td> קורנינג </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

עד כה, היעדר מקור התא האנושי מתאים לב כבר עיכוב משמעותי התחדשות שריר הלב האנושי, או על ידי השתלת תאים מבוססי לב או על ידי הנדסת רקמות 1-3. Cardiomyocytes להיות סופני הבדיל מיד אחרי הלידה מאבדים את יכולתם להתרבות. אין כל עדות כי גזע / ובתאים ממקורות אחרים, כגון מח העצם או דם טבורי, מסוגלים להצמיח לתאי השריר התכווצות הלב לאחר השתלת ללב 1-3. הצורך לחדש או לתקן את שריר הלב ניזוק לא מולאו על ידי טיפול בתאי גזע בוגרים, או אנדוגני או באמצעות משלוח תא 1-3. תאים יציבים גנטית גזע עובריים אנושיים (hESCs) יש יכולת הרחבה בלתי מוגבלת גמישות בלתי מוגבלת, מושיטה מאגר pluripotent שכן הגזירה במבחנה של אספקה ​​גדולה של האדם התאים הסומטיים כי מוגבלים השושלת זקוקיםתיקון והתחדשות 4,5. בשל השכיחות של מחלות לב וכלי דם ברחבי העולם, מחסור חמור של איברים מתורם, יש עניין רב hESC טיפולים מבוססי פיתוח כגישה חלופית. עם זאת, איך לתעל את פוטנציאל התמיינות רחב של hESCs pluripotent ביעילות כצפוי על הפנוטיפ הרצוי כבר אתגר גדול עבור המחקר הן התפתחותיות תרגום קליניים. הגישות המקובלות להסתמך על הנטייה רב שושלת היוחסין של תאים pluripotent באמצעות בידול נבט ספונטנית שכבה, וכתוצאה מכך מחויבות-השושלת יעיל ובלתי נשלט זה מלווה לעתים קרובות ההטרוגניות יציבות פנוטיפי, ולכן, סיכון גבוה tumorigenicity 6-8 (ראה סכמטית ב איור. 1A). בנוסף, מוגדר תוספי ביולוגיים זרים / חיה ו / או ניזונים, כי יש בדרך כלל נעשה שימוש בבידוד, הרחבה, בידול של hESCs רשאי לעשות שימוש ישיר כזה התא specialiשתלי zed בחולים בעייתי 9-11. כדי להתגבר על המכשולים הללו, אנחנו צריכים לפתור את האלמנטים של מערכת התרבות מוגדר הכרחי ומספיק לקיום pluripotence epiblast של hESCs, משמש כפלטפורמה הגזירה דה נובו של hESCs קלינית מתאימה ויעילה בימוי hESCs כזה אחיד כלפי שושלות קליני רלוונטי על ידי מולקולות קטנות 12 (ראה סכמטית באיור. 1B). לאחר הקרנת מגוון רחב של מולקולות קטנות, ובדרך גורמי גדילה, מצאנו כי התנאים המוגדרים כאלה שניתנו nicotinamide (NAM) מספיק כדי לעורר את המפרט של cardiomesoderm ישירה hESCs pluripotent כי עוד התקדם cardioblasts שהפיק cardiomyocytes להכות אדם עם יעילות גבוהה (איור 2 ). הגדרנו תנאים אינדוקציה של cardioblasts ישירה hESCs pluripotent ללא שלב להתערב רב השושלת הגוף embryoid, המאפשר מבוקר היטב הגזירה יעיל שלהיצע גדול של תאים הלב האנושי על פני ספקטרום של שלבי ההתפתחות של התא מבוסס הרפוי.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

הקמנו פרוטוקול לזירוז של cardioblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות לב האדם תפקודי הלב וכלי הדם cardiomyocytes עבור התיקון.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K Views.  San Diego Regenerative Medicine Institute. הקמנו פרוטוקול לזירוז של cardioblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות לב האדם תפקודי הלב וכלי הדם cardiomyocytes עבור התיקון.

Video: Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...