הפרוטוקול משלב את הכוח של יצירת סוגי תאי לב וכלי דם אנושיים באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה וטכניקה רב-תכליתית ליצירת כדורי לב פועמים בפחות מ -72 שעות. כדורי לב אלה יכולים לשמש למידול מחלות ובדיקות סמים. אחד היתרונות העיקריים של טכניקה קלה זו היא שאפשר ליצור כמעט 1000 כדורי לב פועמים בלוח סטנדרטי של 12 בארות.
והכי חשוב, כל ספרואיד לב יכול להיבדק על תפקודו התכווצות באמצעות טכניקה מבוססת הדמיה. לאחר המסת agarose במיקרוגל, מניחים אותו בארון biosafety ולאפשר לו להתקרר במשך שלוש דקות. פיפטה 700 מיקרוליטרים של האגרוז המותך ומוסיפים אותו למיקרומולד הסיליקון של מערך תשע על תשע, תוך הקפדה על הימנעות מיצירת בועות.
בזהירות מניחים את התבנית על גוש הקרח הקר מראש כדי להאיץ את משך האגרוז. ברגע שהאגרוז הופך שקוף למחצה, כופף בזהירות את קצות המיקרומוד כדי לאבד את העתק האגרוז ולקלף בעדינות את העותק המשוכפל מכל הצדדים כדי לנתק אותו מהמיקרומוד הסיליקון. העבירו את מגש המיקרוטיסו האגרוז המכיל 81 שקעים עגולים לצלחת סטרילית של 12 בארות, ולאחר מכן הוסיפו שני מיליליטרים של PBS למגש המיקרוטיסו של האגרוז, ובדקו אותו מתחת למיקרוסקופ לאיתור בועות לכודות או בארות בצורת לא סדירה.
הטביעו את מגש האגרוז בשני מיליליטרים של 70% אתנול בן לילה, ואחריו טיפול UV בארון הבטיחות הביולוגית למשך שעה אחת. הסר את 70% אתנול ולשטוף פעמיים עם מים מזוקקים, ופעם עם שני מיליליטר של PBS. לאחר שתאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים שמקורם בקרדיומיוציטים, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל נספרים לאחר טריפסיניזציה ונטרול, מניחים את ההשעיות של התאים על הקרח.
בצינור חדש, ערבבו את תאי הגזע המושרים שמקורם בקרדיומיוציטים, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל. לאחר מכן, הסר את ה- PBS מהבאר ומחדר זריעת התא מבלי לגעת בשקעים, והוסף 200 מיקרוליטרים של השעיית התא כלפי טיפה. אפשר לתאים להתיישב ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור דו תחמוצת הפחמן למשך שעתיים.
הוסף מדיום ייצור רקמות מיקרו המקיף את עובש האגרוז כדי לכסות את פני השטח של החדר הפנימי. לאחר 24 שעות, שימו לב לספרואידים מורכבים וקומפקטיים בשקעים המעגליים. לשנות את המדיום כל יומיים כדי לשמור על הספרואידים.
בדרך כלל, לאחר 48 שעות, ניתן לראות מכות ספונטניות של הספרואידים. תרבית את סוגי התאים הבודדים בנפרד על מדיום מטריצת ממברנה במרתף, או שקופיות תא מצופה ג'לטין. לשטוף בעדינות את microtissues הלב מתוך השקועים המעגליים, ולאסוף אותם בצינור כרוניקה 15 מיליליטר.
לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים או microtissues, עם מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, לתקן את התאים או microtissues עם מאגר קיבוע המכיל 4.2%PFA ודגור בטמפרטורת החדר. לשאוף את PFA ולדגור את התאים או microtissues עם מיליליטר אחד של פתרון permeabilizing.
לאחר מכן, לשאוף את הפתרון ולשטוף עם שניים עד שלושה מיליליטר של PBS. הוסף 500 עד 1000 מיקרוליטרים של תמיסת חסימה לתאים ודגר לפחות שעה אחת עבור שקופיות התא, ולמשך שלוש עד ארבע שעות עבור microtissues. דגרו את הדגימות עם נוגדנים מצומדים בתמיסת החסימה למשך שעה אחת למגלשות התא, ובלילה בארבע מעלות צלזיוס למיקרוטיסו הלבבי.
לשטוף את שקופיות התא שלוש פעמים עם 500 microliters של 0.1% Tween 20, עם חמש דקות משכים בין כל לשטוף, ולאחר מכן לבצע שטיפה סופית עם PBS. לשטוף את רקמות מיקרו הלב חמש פעמים עם שני מיליליטר של 0.1% Tween 20, עם משך של 20 דקות בין כל לשטוף. לאחר מכן, בצע שטיפה סופית במשך 20 דקות נוספות.
לדגור על התאים או microtissues עם DAPI לפני מיקרוסקופיה קונפוקלי, ולאחר מכן להעביר בזהירות את microtissues הלב לצלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר, ולהוסיף PBS כדי להטביע את microtissue. לשטוף את microtissues מתוך שקעים עגולים עם בינוני אחד באמצעות קצה פיפטה רחב או מיליליטר אחד לתוך צינור כרוני 15 מיליליטר, ולאפשר להם להתיישב. לאחר מכן, לשאוף את המדיום ולשטוף עם PBS מיליליטר אחד.
הוסף 200 עד 300 מיקרוליטרים של מאגר עיכול האנזים ודגר במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מערבבים את microtissues בעדינות במשך דקה אחת, ולחזור על הדגירה. לאחר הדגירה, מערבבים את המיקרוטיסו במרץ עם טיפ פיפטה מיליליטר רגיל כדי לעכל אותו לתאים בודדים.
להשיג השעיית תא עכור, ומיד לנטרל את ההשעיה התא עם חמישה מיליליטר של בינוני המכיל 5%FBS. מסננים את ההשעיה של התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר, וסופרים את המספר הכולל של התאים. צנטריפוגה ההשעיה של תא יחיד ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שאפו את הסופר-נאנט והגדילו מחדש את התאים במאגר מחייב נספח עם FITC Annexin V ו-propidium iodide, או צבע הרחקת תאים מתים TO-PRO-3, ודגרו במשך 10 דקות על קרח. לאחר הדגירה, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מאגר איגוד הסיפוח למתלי התא והעבירו אותו לצינור FACS תחתון עגול לניתוח ציטומטריית זרימה. קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע, תאי אנדותל ופיברובלסטים לבביים נוצלו באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה.
הטוהר של סוגי תאים שונים נקבע באמצעות כתמי אימונו וציטומטריית זרימה. טרופונין T שימש כסמן עבור cardiomyocytes, מעל 90% טוהר הושג. מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות דם CD31 ו vimentin שימשו כסמנים עבור תאי אנדותל ופיברובלסטים לב, והצביעו על טוהר מעל 98 ו 96% בהתאמה.
כתמי אימונופלואורסצנטיות גילו כי הקרדיומיוציטים היו הכבדים ביותר וכבשו את מרכז המיקרוטיסו, בעוד שתאי האנדותל היו משולבים בכל המיקרו-טיסות, ופיברובלסטים לבביים כבשו בעיקר את הפריפריה. העיכול של microtissues באמצעות קצב זה אחד ו Liberase TL הביא פרופורציות תאים קיימא מאוד עם פחות תאים אפופטוטיים לאחר שבועיים בתרבית. החשיפה של שעה אחת של microtissues הלב לריכוז גבוה של doxorubicin המושרה במינון תלוי cardiotoxicity.
התכווצות רקמות המיקרו, ותנועת הווקטורים יצרו מפת חום מדומה שהמחישה את פרופיל ההתכווצות הממוצע על פני המיקרו-טיסו. תנועת ההתכווצות של מיקרוטיסות הלב יצרה פסגות חיוביות שנמדדו כמהירות ההתכווצות, מהירות ההרפיה וקצב הקצב, אשר חושב כזמן בין שני מחזורי התכווצות. ההתכווצות של מיקרוטיסויות הלב הייתה עקבית במשך ארבעה שבועות בתרבות.
חימום תאים הוא אחד השלבים החשובים ביותר בפרוטוקול המסוים הזה, שבו יש להקפיד לוותר בזהירות על השעיית התא לתוך מערך האגרוזים להפצה אפילו בתוך המיקרווולים, וכדי למנוע גלישה. באמצעות פרוטוקול הקרינה הממוטב של microtissues אלה, אפשר לחשוף אלה לטכנולוגיות ריצוף תפוקה גבוהה, כגון RNA-seq תא יחיד או אטאק-seq תא יחיד כדי להבין דפוסי ביטוי גנים ספציפיים לתא וכתוצאה מכך עקב תנאי טיפול שונים.
