1. דור של X. tropicalis ביצים כל צפרדעי tropicalis Xenopus מסודרות מNasco. הצפרדעים שלנו שוכנות בבתי גידול מימיים מערכת מים הסירקולציה המחודשת שמרה על 27 ° C. ישנן אפשרויות רבות למערכות מים לטיפול של X. tropicalis. ניתן למצוא קצת מידע כללי טוב על מיני צפרדעים זה באינטרנט באתרים של הרלנד וגריינג&#39;ר המעבדות <a href="http://tropicalis.berkeley.edu/home/" target="_blank">(http://tropicalis.berkeley.edu/home/,</a> <a href="http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis/" target="_blank">http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis /).</a> הצפרדעים שלנו נשמרות בtankwater בהיקף של (0.4 גר &#39;מלח Ciclid אגם, 0.6 גר&#39; מלח ים, 0.625 גרם NaHCO 3 לליטר מים, pH 7.0) 20. תוצאות המתכון הזה במוליכות של 1800 ~ μS, אשר היא מליחות גבוהה לX. tropicalis. עם זאת, מצאנו כי צפרדעינו לשגשג בthiהסביבה של ביצית והאיכות משופרת. ניתן למצוא מתכוני tankwater אלטרנטיביים לעיל במשאבים הרשומים לכללי X. טיפול tropicalis. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפרדעים מוזרקות עם גונדוטרופין כוריוני האנושי (hCG) בשלושה ימים רצופים כדי לעורר הנחת ביצה: ראשית, להכין שני ריכוזים של פתרון hCG. U resuspend 10,000 של אבקת hCG lyophilized ב10 מ&quot;ל סטרילי, H 2 O deionized לריכוז סופי של 1,000 U / מ&quot;ל. ואז, לדלל 1 מ&quot;ל של תמיסת 1,000 U / מיליליטר hCG ב9 מ&quot;ל H 2 O לריכוז סופי של 100 U / מ&quot;ל. לאחסן שני פתרונות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 ביום, להכין 4-6 צפרדעים להטלת ביצים על ידי הזרקה עם hCG בין 2:00-03:00. הזרק כל צפרדע בצק הלימפה הגבי ליד הביב עם פתרון 0.2 מ&quot;ל 100 U / ml hCG. לאחר הצפרדעים מהירה בשתי הזריקות הבאות יהיה למזער את כמות פסולת הווה צפרדע במהלך הטלת ביצים, אבל הוא אופציונלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, להזריק את אותם צפרדעיםעם פתרון 0.2 מ&quot;ל 100 U / ml hCG בין 2:00-03:00. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להזריק את אותם צפרדעים עם פתרון 0.2 מ&quot;ל 1,000 U / מיליליטר hCG, בין 7:00-10:00. הגדר את הצפרדעים להטיל ביצים: למלא דלי פלסטיק 6 ליטר עם tankwater הטרי, להוסיף צפרדעים ומקום בחושך ב 25 ° C. לאחר הזרקה זו, הנחת ביצה תתחיל אחרי 4 שעות ותהיה שלם של 7 שעות. צפרדעים צריכה להטיל ביצים בסביבה, כי הוא שמר על מינימום של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לחלץ פתרונות ויש לי ציוד מוכן מייד לפני איסוף ביצים. </li></ol> 20X MMR: 100 HEPES מ&quot;מ, pH 7.8 2 מ&quot;מ; EDTA pH 7.8, 2 M NaCl, 40 מ&quot;מ KCl, 20 מ&quot;מ MgCl 2; 40 מ&quot;מ CaCl 2. חיטוי ולאחסן בטמפרטורת חדר. הכן 1 ליטר של MMR 1X רק לפני לחלץ הכנה. XB 10X: 100 HEPES מ&quot;מ, pH7.7; 10 מ&quot;מ MgCl 2; 1 מ&quot;מ CaCl 2; 1 M KCl; סוכרוז מ&quot;מ 500. חיטוי ולאחסן ב 4 ° C. הכן 1 ליטר של 1X XB JUST לפני לחלץ הכנה. פתרון Dejelly: הכן פתרון ציסטאין 3% 250 מ&quot;ל בdeionized H 2 O ו-pH 7.8-8.0 עם 10 N NaOH. הכן רק לפני לחלץ הכנה. CSF-XB: לקחת 200 מ&quot;ל של 1X XB ולהוסיף 2 מ&quot;ל 0.5 M pH 7.7 EGTA ו200 μl 1 M MgCl 2. הכן רק לפני לחלץ הכנה. CSF-XB +: לקחת 50 מ&quot;ל של CSF-XB ולהוסיף 50 μl של LPC (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​כל מניה של leupeptin, Pepstatin, וChymostatin DMSO). הוסף 50 Cytochalasin D μl (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב DMSO). הכן רק לפני לחלץ הכנה. הכן פתרון ג&#39;לטין 0.2% בdeionized H 2 O, מיקרוגל כדי להמס ולסנן לעקר. לאחסן בטמפרטורת חדר. 2 2 x ½ צינורות ultracentrifuge מילואים Beckman אינץ. הכן שני 15 צינורות צנטריפוגה עגולים תחתיי מ&quot;ל זכוכית עם 0.5 מ&quot;ל של H 2 O בכל אחד כדי לרכךultracentrifuge צינור. הפוך את האש מלוטשת pipettes פסטר זכוכית. הצמד את הסוף של 5 ¾ pipettes זכוכית אינץ לחשוף פתיחה רחבה, ולחשוף ללהבה כדי להחליק את קצה פיפטה נחשף החדש. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כוס 500 מיליליטר זכוכית לאחסון ביצים על ידי מתערבל פתרון ג&#39;לטין 0.2% סביב למעייל הקירות של הכוס. בטל פתרון ג&#39;לטין מכוס לאחר שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ביצים מדלי הפלסטיק המשמש להנחת שעות 6-7 לאחר ההזרקה השלישית ביום 3. אם תרצה, בעדינות לסחוט כל צפרדע פעם אחת כדי לקבל את כל ביצים הנותרות. לשטוף ביצי פעם אחת עם tankwater והעברה לכוס זכוכית 500 מ&quot;ל מצופה בפתרון ג&#39;לטין 0.2% טריים. </li></ol> 2. הכנת תמצית מX. ביצי tropicalis כל השלבים של הכנת תמצית יכולים להתבצע בטמפרטורת חדר, כ 25 ° C. במהלך שוטף, חשוב לשמור על הביצהמתחת למים ים מתחת לנוזל, כך שהם יישארו רטובים. חשיפה לאוויר יכולה לגרום לביצים לברוח עצירת מחזור תא או lyse. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג כמה שיותר tankwater ככל האפשר, תוך הזמנת מספיק נוזלי כדי לשמור את הביצים רטובות. הטה את הכוס המכילה ביצים בצד ולהוסיף ~ 300 מ&quot;ל 1X MMR לאט לקיר של הכוס, כך שהתסיסה פיזית של הביצים היא מזערית. בוא ביצים להתיישב, ואז למזוג את הפסולת המכילה supernatant. X. ביצי tropicalis הן סיביים בשלב זה, ולכן הסרת ביצים הופעלה נעשה לאחר dejellying. חזור על פעולה עבור סכום כולל של שלוש שוטף 1X MMR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dejelly את הביצים. למזוג את כמו MMR כמחצית אפשרית ותוספת של פתרון dejelly. מערבולת ברציפות במשך כ 5 דקות. המסת שכבות ג&#39;לי תהיה גלויה בsupernatant לאחר כמה דקות. למזוג את ולהוסיף את פתרון dejelly הנותר. ממשיך לערבל ברציפות עד ביצים לארוז בחוזקה וכל האוריינט עם המוט הצמחי (המוטעם פיגמנט לבן) לכיוון החלק התחתון של המנה. למזוג את מהירות כפתרון הרבה dejelly ככל האפשר. ברגע שהביצים dejellied הם מאוד רגישים למניפולציות מכאניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף XB זהירות את הביצים. בכביסה XB הראשונה, להסיר ביצים שנמלטו CSF מעצר על ידי הסרת ביצי lysed, נפוחים, לבנים, וpseudocleavage. הופעל X. ביצי tropicalis נוטות להתיישב במרכז הראש, כך להשתמש פיפטה העברה פלסטיק כדי למשוך את אלה. גם להסיר את פיסות עור ופסולת צפרדע. לשטוף ביצים בסך הכל שלוש פעמים עם פתרון ~ 300 מ&quot;ל 1X XB, בעדינות מתערבל ביצים בין שוטף ומאפשר להם להתיישב בתחתית הכוס. כמו בעבר, למזוג כמה שיותר מכל פתרון לשטוף ככל האפשר, תוך שמירה על ביצים רטובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביצים פעמיים עם CSF-XB ולמזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף CSF-XB + לביצים. באמצעות אש המלוטשת ג&#39;לטין שטופל פיפטה פסטר, ביצים לצינורות Ultra-צנטריפוגות העברה עם CSF-XB +, נזהר שלא לחשוף את הדוארggs לאוויר. במקום בתוך 15 צנטריפוגות צינורות זכוכית מ&quot;ל עם כרית המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ביצים בצנטריפוגה קלינית ב XG 200 דקות 1, להגדיל את המהירות ל -800 XG וספין למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aspirator להסיר כמה שיותר חיץ ככל האפשר מהביצים. הם צריכים להיות כמעט יבשים על העליונה. מהר להעביר ביצים לצנטריפוגות Sorvall RC-6 מצוידות בHB-6 הרוטור (או שווה ערך) וספין 17,000 XG במשך 15 דקות ב 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שכבת cytoplasmic הצהובה בין פיגמנט ושכבות שומנים בדם באמצעות מחט מד 18 מצורפת מזרק 1 מ&quot;ל. לנקב את הצד של הצינור ולמשוך את חבית המזרק לאט כדי להשיג את שכבת תמצית cytoplasmic. הימנע מגרגירי פיגמנט ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הציטופלסמה לצינור ultracentrifugation החדש. זה נורמלי לתמצית להופיע מעט מעונן בשלב זה. מקום בתוך צינור צנטריפוגות זכוכית 15 מ&quot;ל עם כרית מים. ספין שוב 17,000 XG במשך 10 דקות ב 20 ° C. חזור על שלוחהraction עם מחט מד 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הציטופלסמה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge. לאמוד את היקף התמצית ולדלל Cytochalasin D וLPC 1:1,000 לתמצית. מערבבים היטב עם מיליליטר פיפטה קצה 1, pipetting למעלה ולמטה פעמים רבות ללא הכנסת בועות אוויר. תשואה אופיינית ממושבת צפרדע בריאה היא כ 300-500 μl של תמצית / צפרדע. כדי לשמר את הפעילות מקסימלית, יש צורך לאחסן את התמצית ולבצע מניפולציות ניסיוני בטמפרטורת חדר (20-25 ° C). </li></ol> 3. טיהור Microtubules טקסול התייצב מX. tropicalis חלץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לטקסול aliquot μl 100-200 של תמצית בריכוז סופי של 10 מיקרומטר ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. לתגובות בקרה, טיפול בהיקף שווה ערך של תמצית עם תרופת Nocodazole microtubule-destablilzing (10 מיקרומטר). μl המילואים 100 של תמצית מטופל לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הטיפול תרופתילחלץ עם 10 כרכים + 30% גליצרול BRB-80 (80 מ&quot;מ pH צינורות 6.8, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ EGTA). 14 להרכיב צינורות פוליפרופילן מסביב לתחתית מ&quot;ל המכילים 10 מ&quot;ל של BRB-80 + כרית גליצרול 60%. באמצעות משעמם פיפטה קצה רחב, שכבת תגובת המטופלים בתרופת התמצית בעדינות על גבי BRB-80 + 60% כרית גליצרול. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב -17,000 XG ב 20 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה Sorvall RC-6 מצוידות בHB-6 הרוטור (או שווה ערך) ומתאמי צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את חומר supernatant המכיל תמצית unsedimented, ולשטוף פעמיים עם ממשק deionized H 2 O. לשאוב את נפח הכרית שנותר לאט, נזהר שלא להפריע דמוית ג&#39;ל גלולה המכילה microtubules, חלבוני microtubule הקשורים, וRNAs microtubule הקשורים במדגם שטופל בטקסול. המדגם Nocodazole טופל אינו מכיל חומר גלוי. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר TRIzol ולהמשיך עם הוראות היצרן לבידוד RNA. Untrתמצית eated (μl עד 100) יכולה להיות resuspended ישירות בTRIzol 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיום יש ערכות זמינות מסחרי להכנת ספריות transcriptome מתאימה לRNA-אילך. אלה ניתן לרכוש דרך <a href="http://www.illumina.com/" target="_blank">http://www.illumina.com/</a> <a href="http://www.454.com/" target="_blank">וhttp://www.454.com/.</a> </li></ol>

<ol>
	<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+localization:+gene+expression+in+the+spatial+dimension.">mRNA localization: gene expression in the spatial dimension.</a> Cell. 136, 719-730 (2009).</li><li>Besse, F., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+localized+mRNAs:+restricting+protein+synthesis+in+space+and+time.">Translational control of localized mRNAs: restricting protein synthesis in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 971-980 (2008).</li><li>Lawrence, J. B., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+localization+of+messenger+RNAs+for+cytoskeletal+proteins.">Intracellular localization of messenger RNAs for cytoskeletal proteins.</a> Cell. 45, 407-415 (1986).</li><li>Mingle, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+all+seven+messenger+RNAs+for+the+actin-polymerization+nucleator+Arp2/3+complex+in+the+protrusions+of+fibroblasts.">Localization of all seven messenger RNAs for the actin-polymerization nucleator Arp2/3 complex in the protrusions of fibroblasts.</a> J. Cell Sci. 118, 2425-2433 (2005).</li><li>Blower, M. D., Feric, E., Weis, K., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+demonstrates+conserved+localization+of+messenger+RNAs+to+mitotic+microtubules.">Genome-wide analysis demonstrates conserved localization of messenger RNAs to mitotic microtubules.</a> J. Cell Biol. 179, 1365-1373 (2007).</li><li>Eliscovich, C., Peset, I., Vernos, I., Mendez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle-localized+CPE-mediated+translation+controls+meiotic+chromosome+segregation.">Spindle-localized CPE-mediated translation controls meiotic chromosome segregation.</a> Nat. Cell Biol. 10, 858-865 (2008).</li><li>Sharp, J. A., Plant, J. J., Ohsumi, T. K., Borowsky, M., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+microtubule-interacting+transcriptome.">Functional analysis of the microtubule-interacting transcriptome.</a> Mol. Biol Cell. 22, 4312-4323 (2011).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Mili, S., Moissoglu, K., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+reveals+APC-associated+RNAs+enriched+in+cell+protrusions.">Genome-wide screen reveals APC-associated RNAs enriched in cell protrusions.</a> Nature. 453, 115-119 (2008).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters.">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Desai, A., Murray, A., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro.">The use of Xenopus egg extracts to study mitotic spindle assembly and function in vitro.</a> Methods Cell Biol. 61, 385-412 (1999).</li><li>Gache, V., Waridel, P., Luche, S., Shevchenko, A., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+mass+spectrometry+identification+of+microtubule-binding+proteins+from+Xenopus+egg+extracts.">Purification and mass spectrometry identification of microtubule-binding proteins from Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol. Med. 137, 29-43 (2007).</li><li>Gache, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+meiotic+microtubule-associated+interactome.">Xenopus meiotic microtubule-associated interactome.</a> PLoS One. 5, e9248 (2010).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li><li>Cross, M., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+nuclear+assembly+using+fractionated+Xenopus+egg+extracts.">In vitro nuclear assembly using fractionated Xenopus egg extracts.</a> J. Vis. Exp. (19), e908 (2008).</li><li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+research:+metamorphosed+by+genetics+and+genomics.">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li><li>Hellsten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328, 633-636 (2010).</li><li>Brown, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle.">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li><li>Godfrey, E. W., Sanders, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+water+hardness+on+oocyte+quality+and+embryo+development+in+the+African+clawed+frog+(Xenopus+laevis).">Effect of water hardness on oocyte quality and embryo development in the African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp. Med. 54, 170-175 (2004).</li><li>Groisman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB,+maskin,+and+cyclin+B1+mRNA+at+the+mitotic+apparatus:+implications+for+local+translational+control+of+cell+division.">CPEB, maskin, and cyclin B1 mRNA at the mitotic apparatus: implications for local translational control of cell division.</a> Cell. 103, 435-447 (2000).</li><li>Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microtubule+polymerization+in+vitro+and+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts.">Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 38, 29-34 (2006).</li><li>Kalab, P., Pu, R. T., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ran+GTPase+regulates+mitotic+spindle+assembly.">The ran GTPase regulates mitotic spindle assembly.</a> Curr. Biol. 9, 481-484 (1999).</li><li>Gaglio, T., Saredi, A., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuMA+is+required+for+the+organization+of+microtubules+into+aster-like+mitotic+arrays.">NuMA is required for the organization of microtubules into aster-like mitotic arrays.</a> J. Cell Biol. 131, 693-708 (1995).</li><li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microtubule+interactome:+complexes+with+roles+in+cell+cycle+and+mitosis.">A microtubule interactome: complexes with roles in cell cycle and mitosis.</a> PLoS Biol. 6, e98 (2008).</li><li>Suprenant, K. A., Tempero, L. B., Hammer, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+ribosomes+with+in+vitro+assembled+microtubules.">Association of ribosomes with in vitro assembled microtubules.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 14, 401-415 (1002).</li><li>Rebagliati, M. R., Weeks, D. L., Harvey, R. P., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+cloning+of+localized+maternal+RNAs+from+Xenopus+eggs.">Identification and cloning of localized maternal RNAs from Xenopus eggs.</a> Cell. 42, 769-777 (1985).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בדוח זה שתארנו שיטה פשוטה לייצור תמציות ביצת CSF-נעצר מX. tropicalis 19 ולהשתמש בתמצית זו כדי ללמוד RNAs microtubule הקשורים 7. ההליך הבסיסי לייצור תמציות ביצת CSF-נעצרו מX. tropicalis זהה המשמש לX. laevis עם כמה הבדלים מרכזיים. אחד ההיבטים המאתגרים ביותר לעבודה עם X. צפרדעי tropicalis היא השגת ביצים באיכות גבוהות מספיק כדי להפוך את תמצית עם נוקלאציה microtubule או פעילות דומה להרכבת ציר X. laevis ביצת תמציות. כדי להשיג תנאי הטלה אופטימליים תוך מניעת זליגה ממעצר המיוזה השנייה במחזור תא, המרווח בין זריקות הורמונים לX. tropicalis הוא קצר יותר מזה המשמש לX. laevis, והעיתוי מהזרקת hCG השלישי לתחילת הנחת ביצה הוא גם הרבה יותר קצר. עם X. laevis עיתוי מהזרקת hCG כדי לאהוא תחילת הנחת ביצה היא כזה שהוא נוח ויעיל לביצים שהונחו בין לילה לחיץ. עם זאת, בשל הזמן הקצר יותר בין ההזרקה וביצת hCG הנחת עם X. tropicalis זה הוא לעתים קרובות הכרחי כדי לבטא באופן ידני את הביצים מצפרדעים. עוד הבדל משמעותי בין מה שהופך את תמצית ביצה משתי הצפרדעים השונות הוא צעד dejellying. עם X. laevis את הביצים כל כך גדול שזה קל לקבוע מתי מעיל הריבה נמס על ידי התבוננות כיצד מקרוב את הביצים הם מרווחים בכוס. כתגובת dejellying מתחילה, את הביצים להתחיל לארוז יותר בצפיפות. עם זאת, X. ביצי tropicalis הן הרבה יותר קטנים וזה יכול להיות די קשה לקבוע מתי מעיל הריבה נמס בביצת אריזת צפיפות לבד. מצאנו כי השיטה אמינה ביותר לקבוע מתי מעיל הריבה נמס היא לפקח על נטייתו של בעל החיים (שחור) וצמחיים (לבן) הקטבים. כאשר כל קטבי אורי צמחייםאף אוזן גרון לכיוון החלק התחתון של כוס ריבת מעיל הוסר מספיק כדי להמשיך עם התמצית. לבסוף, ואילו X. ניתן לאחסן תמצית ביצת laevis בטמפרטורות קרירות (4-12 מעלות צלזיוס) שראינו שזה הוא קריטי כדי לשמור על X. תמצית ביצת tropicalis בטמפרטורת חדר (20-25 ° C) במהלך הכנה ומניפולציות ניסיוני כדי לשמר את הפעילות ביוכימית. בגלל ההבדלים בנוחות שימוש שאנו מעדיפים להשתמש X. צפרדעי laevis לייצור של תמצית ביצים. עם זאת, בניסויים שדורשים או בהנחייתם של האורגניזם עם רצף הגנום, X. tropicalis הוא מערכת אלטרנטיבית מצוינת. השיטה שתארנו בדוח זה משתמש בטקסול כסוכן microtubule-מייצב כדי לגרום פילמור microtubule. אנחנו בחרנו בשיטה זו משום שטקסול הוא סוכן microtubule-מייצב חזק המאפשר בידוד בקנה מידה גדולה של מטוהרים microtubules. ה השיטהשבתארנו סביר יכול להיות שיפור באמצעות השוואת בין החלבונים RNAs קשורים microtubules בשיטות פילמור microtubule חלופיות. חלופות יכולים לכלול פילמור באמצעות GTP-Induced פילמור (טכניקה קלאסי), 22 או שימוש ברן-GTP כpolymerizer microtubule לחקות את microtubules הנגרמת על ידי הרכבה ציר הכרומטין מונחה 23. לבסוף, שימוש מטוהר גרעיני זרע כדי לגרום פילמור microtubule יהיה לחקות הקרוב ביותר לסוגי microtubules הnucleated במהלך מיטוזה (centrosome, הכרומטין, ותיווך kinetochore). חסרונות למקורות חלופיים אלה של נוקלאציה microtubule הם כי סוכני nucleating הם לא ברצון כטקסול והם לא nucleate או לייצב microtubules בצורה יעילה ככל טקסול. לכן, כל אחת מהשיטות הללו, יהיה קשה יותר לשימוש עבור purifications בקנה מידה גדולה. היתרון של השוואה בין סוגים שונים מרובים של nucleators microtubuleהוא שזה יכול להיות אפשרי לזהות חלבונים ו / או RNAs שהם ספציפיים לכל מסלול של נוקלאציה microtubule. השיטה שתארנו כאן מנצלת תמציות cytoplasmic של דו חיים. עם זאת, גישה זו ניתן תהיה להרחיב את השימוש במערכת לחלץ מאורגניזמים אחרים. תמציות mitotic כבר תאר ממסונכרן תאי תרבית רקמה אנושיים 24 שנאמנו לסכם היבטים רבים של ההרכבה microtubule. אנחנו השתמשנו בהצלחה תמציות אלה כדי לזהות RNAs microtubule הקשורים מהלה תאים 5. תוכניות טיהור microtubule דומות תוארו לאורגניזמים רבים ושונים 25,26, אם כי כאמור לא נבדק בRNAs קשורים microtubule. הגישה שתוארה כאן יכולה לשמש עם כל אורגניזם שיכול לייצר תמצית מרוכזת cytoplasmic מסוגלת nucleating microtubules. לבסוף, למרות שהגישה שאנו דהסופר דן כאן טיהור microtubules וחלבוני RNAs נלווים, גישה זו יכולה להיות מוכללת למבני subcellular אחרים. בעוד mRNAs המקומיות ביותר לא זוהתה באמצעות שיטות ביוכימיות את ההתקדמות בטכנולוגיות ה-DNA ורצף RNA להפוך גישה זו שיטה אטרקטיבית לזהות RNAs מקומי. בגישה זו כל מבנה subcellular או תת עובר של עניין יכול להיות מבודד או מטוהרים. ואז את החלבונים RNAs הנלווים יכולים להיות מזוהים בקנה מידה רחב הגנום. לאחר מכן ניתן להשוות RNAs לתוכן RNA של התא המוחלט או העובר לזהות RNAs מקומי מועשר. גישה זו יכולה להיות בשימוש עם ביצים שלמות (של בעלי חיים וצמחי הפרדה, בדומה לגישה שזיהתה את RNAs המקומיים הראשון בXenopus 27), RNAs קשורים אקטין, RNAs ER-RNAs נלווים, הקשורים למיטוכונדריה, או לכל מבנה שיכול subcellular להיות מטוהר עם RNAs הנלווים ללא פגע. בהתבסס עלהעבודה שלנו על microtubule הקשורים RNA אנו צופים שזו תהיה שיטה מצוינת לגלות חלבונים חדשים שפועלים במיקום נתון. יתר על כן, זיהוי של המיקום וההיקף של כל RNAs המקומיים יספק תובנה כיצד תאים ועוברים להשתמש בלוקליזציה mRNA לשלוט על ביטוי גנים.

שליטה במרחב ובזמן של ביטוי גנים הוא חשובה לכל התאים, וחשוב במיוחד לשליטה על עוברית מוקדמות מטופף 1. שליטה במרחב של ביטוי גנים מושגת באמצעות הלוקליזציה הפעילה של mRNAs ליעדים ספציפיים בתוך תאים או בעוברים. בסוגי תאים רבים גדולים מאוד, (למשל ביציות, עובר, ועל נוירונים) משמשת לוקליזציה mRNA כדי להגביל ביטוי חלבון לאתר פעולה של החלבון המקודד. מאז ה-mRNA מקומית יכולה לזרז סיבובים רבים של ייצור חלבון הוא יעיל יותר בתרגום ה-mRNA מלמקם מולקולות חלבון בודדות. mRNAs מקומית בדרך כלל מודחקת translationally עד שהם מגיעים ליעדם, המשמש להגבלת הלוקליזציה של החלבון המקודד 2 נוספת. בנוסף למקרים המתועדים היטב הרבים של RNA לוקליזציה לשלוט דפוסים עובריים, מספר מחקרים תעדו mRNAs שהן נקודותלאתר פעולה של החלבון המקודד. דוגמאות בולטות כוללות לוקליזציה של β-אקטין 3 וArp2 / 3 4 mRNAs לקצה המוביל של fibroblasts הנעים ובלוקליזציה של mRNAs לרגולטורי mitotic רבים לmeiotic וmitotic צירים 5-7. רבים מדוגמאות קלאסי של mRNAs המקומיות זוהו באמצעות מסכי גנטיים למוטציות השפעה אימהיות ולאחר מכן נקבעו לקידוד RNAs מקומי. עם זאת, מחקרי הגנום האחרונים החלו לספק תובנה רחבה יותר בהיקף של RNAs מקומי. אחרונים במסך הכלאה באתר בעוברים תסיסנית הוכיח כי ~ 70% מכל mRNAs יש לוקליזציה ספציפית, כולל יעדים רבים רומן 8. טיהור pseudopodia מfibroblasts העכבר זיהתה קבוצה מגוונת של מקומי mRNAs 9. עובד מהקבוצה שלנו באמצעות טיהור ביוכימי של microtubules מmeiotic קסנומוגלה ביצה מחלצת מאות מזוהים של mRNAs כי copurify עם ציר 5,7. העבודה שלנו הראתה כי הרוב המכריע של mRNAs microtubule ההמקומית לקודד חלבונים המתפקדים בשליטה של ​​מיטוזה, תומך ברעיון שmRNAs מותאמת לשפה מקומית לאתר פעולה של החלבון המקודד. יתר על כן, היכולת לזהות העשרת mRNA בשבריר subcellular על ידי טיהור ביוכימי מדגישה את כוחה של גישה זו לזיהוי mRNAs מקומית. RNAs מקומי ביותר להשתמש בתחבורה פעילה בשלד התא, או אקטין או microtubules, כדי להשיג את ההובלה ליעד הסופי שלהם 10. כדי להשיג הבנה טובה יותר של ההיקף והסוגים של RNAs המקומיים ליעדים ספציפיים באמצעות גישה ביוכימית זה יש צורך יש במערכת במבחנה שיכול לסכם תהליכי cytoskeletal. אחת מהמערכות המובילות ללימוד הביולוגיה cytoskeletal הוא תמציות ביצים יוצרמהביצים מופרות מצפרדע Xenopus laevis. X. תמציות ביצת laevis שמשו במשך עשרות שנים כדי ללמוד מגוון רחב של תהליכי cytoskeletal ותרמו הרבה להבנתנו את המנגנונים והמולקולות השולטים הרכבה cytoskeletal ו11 דינמיקה שלנו. יתר על כן, X. תמציות ביצת laevis ניתנות לpurifications בקנה מידה גדולה של microtubules וחלבונים הקשורים 12,13 ויש שיטות מעוצבות היטב לייצור סוגים שונים של תמציות ביצים 14-16. עם זאת, למחקרים גנומיים יש כמה חסרונות לשימוש בX. laevis כמערכת מודל. במשך עשרות שנים צפרדעי laevis Xenopus היו מערכת רב עוצמה לחקר ביולוגיה התפתחותית ותא, בשל גודל הביצית הגדול ופיתוח חיצוני 17 חזק. יתר על כן, הפיתוח של מערכות תמצית ביצים שיכולים לסכם רבים processe הסלולריים במבחנה הפך צפרדע זה מודל ניסיוני רב עוצמה. עם זאת, Xenopus laevis כבר הקשו על ידי חוסר רצף הגנום מלא, שהואט על ידי טבע allotetraploid של ניגוד genome.In, מין הקשורות באופן הדוק, Xenopus tropicalis, יש גנום דיפלואידי שהיה רצף בשינה 2010 18. בעוד X. tropicalis לא כצייתן באופן ניסיוני כX. laevis 17 הזמינות של הגנום רצף הופך אותו למערכת אטרקטיבית מודל לבצע ניתוחים רחבים הגנום. בדו&quot;ח זה אנו מתארים שיטה לעשות תמציות גורם-II-נעצרו, cytostatic מיוזה (CSF) מX. tropicalis 19. לאחר מכן, אנו מתארים שיטה פשוטה לטהר microtubules וRNAs הנלווים מתמצית זו. את RNAs לאחר מכן ניתן להמיר את ספריות המתאימים לשימוש בטכנולוגיות רצף רצף פותחו לאחרונה תפוקה גבוהה. ברגע שהספריותהם רצף שהם יכולים להיות מיושרים לגנום של הצפרדע לזהות mRNAs ספציפית שמועשרות במדגם microtubule בהשוואה לתמצית מוחלטת. זה מספק שיטה רב עוצמה לאיתור לוקליזציה mRNA microtubule ממוקדת בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף להיותו מסוגל לזהות mRNAs מקומית, השימוש ברצף תפוקה גבוהה ורצף הגנום מציע את האפשרות של גילוי תמלילי רומן שאינם נמצאים כרגע בהווה בביאורי מסדי נתונים ציבוריים.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus tropicalis </td>
			<td>NASCO</td>
			<td>LM00823MX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, free base</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>14030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cichlid Lake Salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>47894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>SC7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbermaid Plastic bucket</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Polyallomer 2 x &frac12; inch Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>326819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45500-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>45550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &frac34; inch glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall HB-6 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of xenopus tropicalis egg extracts to identify microtubule-associated rnas

אורגניזמים רבים למקם mRNAs ליעדי subcellular ספציפיים לביטוי גני שליטת מרחב ובזמן. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי הרוב המכריע של transcriptome הוא מקומי למיקום אקראי בתאים ועובר. גישה אחת לזהות mRNAs מקומית היא לטהר יוכימית מבנה תאי של עניין וכדי לזהות את כל התמלילים הקשורים. תוך שימוש בטכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה שפותחו לאחרונה עכשיו זה פשוט לזהות את כל RNAs הקשורים למבנה subcellular. כדי להקל על זיהוי תמליל יש צורך לעבוד עם האורגניזם עם הגנום רצף במלואו. מערכת אחת אטרקטיבית לטיהור הביוכימי של מבני subcellular הן תמציות המופקות מביציות הצפרדע Xenopus laevis. עם זאת, X. laevis אין כרגע הגנום רצף באופן מלא, מה שפוגע בזיהוי תמליל. במאמר זה אנו מתארים שיטהכדי להפיק תמציות מביצת צפרדע קשורה, X. tropicalis, שיש לו רצף הגנום מלא. אנו מספקים פרטים לפילמור microtubule, טיהור ובידוד תמליל. בעוד מאמר זה מתאר שיטה לזיהוי ספציפית של תמלילי microtubule הקשורים, אנו מאמינים שזה ייושם בקלות למבני subcellular אחרים ויספק שיטה רב עוצמה לזיהוי של RNAs מקומי.

לזהות X. תעתיקי tropicalis קשורים microtubules, אנו מכינים תמצית cytosolic מהביצים מופרות שנעצרו בmetaphase של המיוזה השנייה (CSF). טיפול בתמצית זו עם טקסול מאפשר היווצרות של microtubules יציבה שיכול להיות מטוהרות על ידי שקיעה באמצעות כרית גליצרול (איור 1 א). ניתוח ג&#39;ל Coomassie מאשר שמשקעי α / β-טובולין באופן טקסול תלוי, ומייצג את מיני חלבון הגדולים התאוששו בהכנות אלה (איור 1). רמות נמוכות יותר של חלבונים אחרים הן גם בהווה בגלולת טקסול, אבל לא בהכנות שטופלו בתרופת microtubule depolymerizing nocodazole, המציין כי חלבונים בשבריר טקסול המקורב במיוחד עם microtubules (מפות). Bioanalyzer Agilent משמש לבחינת הרכב RNA כללי בכל X. ברי תמצית tropicalis (איור 1 ג </חזק&gt;). שניהם rRNA tRNA ומינים שנמצאים בתמצית CSF וטקסול גלולה המכילה microtubule, עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים שהתרגום מתרחש על microtubules וצירים בX. laevis ביצה לחלץ 5,21. עקבות שורה של הקרנת ג&#39;ל מגלה את אות ה-mRNA היא נמוכה במידה ניכרת בmicrotubule המכיל טקסול גלולה, בעיקר באזור הנודדות מעל 28S rRNA, המציין כי קבוצת משנה של cosediment mRNAs עם microtubules בX. tropicalis. רנ&quot;א מבודד באופן זה הוא מתאים לניסוי RNA-Seq באמצעות חומרים כימיים מסחרי זמינים. <img src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg" /> איור 1. טיהור של MT-RNA לRNA-אילך. () ערכת טיהור לבודד MT-RNA. ביצים נקצרים מן הנקבה X. טרוצפרדעי picalis. לאחר הכנת תמצית cytoplasmic, טקסול מתווסף לגרום פילמור microtubule. Microtubules וMT-RNA הם מטוהרים על ידי שקיעה באמצעות כרית גליצרול. (ב &#39;) ניתוח ג&#39;ל Coomassie של חלבונים המבודדים באמצעות ערכה שמתוארת ב(). סה&quot;כ CSF לחלץ בהשוואה לחלבוני משקעים בנוכחות טקסול או nocodazole. (ג) ניתוח Bioanalyzer ג&#39;ל של רנ&quot;א מבודד באמצעות ערכה שמתוארת ב(). רנ&quot;א מבודד מCSF לחלץ לעומת RNA משקעים בנוכחות טקסול או nocodazole. גם הקרנת ג&#39;ל ואת עקבות הקו מוצגות. התפרסם באישור שארפ, et al., (2011). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs at JoVE.com

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

אנו מתארים את האוסף של מופרה<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצים וייצור של תמצית ביצה השנייה, נעצר מיוזה. תמצית ביצה זה יכול לשמש כדי לטהר microtubules וRNAs microtubule הקשורים.

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

production-xenopus-tropicalis-egg-extracts-to-identify-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

13.6K Views.  Massachusetts General Hospital. אנו מתארים את האוסף של מופרה Xenopus tropicalis ביצים וייצור של תמצית ביצה השנייה, נעצר מיוזה. תמצית ביצה זה יכול לשמש כדי לטהר microtubules וRNAs microtubule הקשורים.

Video: Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

חקר מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות<em&gt; Xenopus</em&gt; תמציות ביצה

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

כימות Orofacial פנוטיפים ב<em&gt; צפרדעים</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

ייצור של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video