1。 ツメガエル卵の生成すべてのアフリカツメガエルトロピカカエルはNASCOから注文されています。当社のカエルは、循環水システムは27に保た水生生息地に収容されています℃のXのケアのための水システムのための多くのオプションがありますトロピカ。このカエルの種のいくつかの良い一般的な情報は、ハーランドとグレンジャーラボのWebサイト（で見つけることができます<a href="http://tropicalis.berkeley.edu/home/" target="_blank">http://tropicalis.berkeley.edu/home/</a> 、 <a href="http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis/" target="_blank">http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis /</a> ）。当社のカエルは、以下からなるtankwater（0.4グラムのCiclid湖塩、0.6グラムの海洋塩、水1リットル当たり0.625グラムのNaHCO 3、pH7.0）で20に保持されます。 X用高塩分です〜1800μSの導電率、このレシピ結果トロピカはいますが 、私たちはカエルはTHIで繁栄することを発見したの環境および卵母細胞の品質が向上する。代替tankwaterレシピは一般的なXの記載されたリソースで、上記記載されていますトロピカケア 。 <ol><li>カエルが産卵を刺激するために3つの連続した​​日にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）を注射されています：まず、hCGのソリューションの2つの濃度を準備します。 1,000 U / mlの最終濃度を10 mlの滅菌、脱イオンH 2 O中のhCGの凍結乾燥粉末を懸濁し10,000 U。その後、100 U / mlの最終濃度9ミリリットルH 2 Oで1,000 U / mlのhCGの溶液1mlを希釈。 4℃で両方のソリューションを保存する</li><li> 1日目に、2:00-3:00 PMの間でhCGを注射することによって産卵のために4-6カエルを準備します。 0.2ミリリットル100 U / mlのhCGの溶液を排出腔の近くに背のリンパ嚢の各カエルを注入。その後の2回の注射の間に速いカエルを持つことは、産卵時にカエルの廃棄物の量を最小限に抑えますが、オプションであるでしょう。 </li><li> 2日目に、同じカエルを注入2:00-3:00 PMの間に0.2ミリリットル100 U / mlのhCGの溶液を用いて。 </li><li> 3日目、午前7:00-10:00の間で、0.2ミリリットル1,000 U / mlのhCGの溶液と同じカエルを注入。卵を産むためにカエルを設定します。新鮮tankwater付き6クォートのプラスチックバケツを埋める、25℃、暗所でカエルと場所を追加℃にこの注入後、産卵は4時間後に開始され、7時間で完了します。カエルは25の最小値に維持される℃環境で卵を産むべき</li><li>解決策を抽出して、卵を収集する前にすぐに機材を用意してください。 </li></ol> 20X MMR：100ミリメートルHEPES、pHは7.8、2 mMのEDTA pHは7.8、2 MのNaCl、40mMのKClを、20のMgCl 2、40 mMのCaCl 2を。室温でオートクレーブや店舗。準備を抽出する直前1X MMRの1 Lを用意してください。 10X XB：100のHEPES、pH7.7、10mMのMgCl 2、1mMのCaCl 2を、1 MのKCl、500mMのスクロース。 4℃でオートクレーブや店舗1X XB jの1 Lを用意します製剤を抽出するために、従来UST。 Dejellyソリューション：10 N NaOHで7.8から8.0に脱イオンH 2 OとpHの250ミリリットル3％システイン溶液を準備します。準備を抽出する直前に準備します。 CSF-XB：1X XB 200mlのを取ると、2ミリリットル、0.5M EGTA pHは7.7と200μlの1 MのMgCl 2を追加します。準備を抽出する直前に準備します。 CSF-XB +：CSF-XB 50mlのを取るとLPC50μlのを（10 mg / mlの各ロイペプチン、ペプスタチンの株式、およびDMSOにおけるキモスタチン）を追加します。 50μlのサイトカラシンD（DMSO中10 mg / mlの）を追加します。準備を抽出する直前に準備します。 殺菌を溶解し、フィルタリングする脱イオンH 2 O、電子レンジで0.2％ゼラチン溶液を準備します。室温で保管してください。 リザーブ2ベックマン×2½インチ超遠心チューブ。 緩和する各H 2 O 0.5mlの2つの15ミリリットルの丸底ガラス遠心管を準備チューブを超遠心機にかける。 ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを作る。広い開口部を露出させるために5¾インチガラスピペットの先端を折り、新しい暴露ピペットチップを滑らかにするために炎にさらす。 <ol start="6"><li>コー​​トビーカーの壁を周りに0.2％ゼラチン溶液を渦巻くことで卵を保存するため、500mlのガラスビーカーを準備します。使用後のビーカーからゼラチン溶液を捨てる。 </li><li> 3日目の3回目の注射の後に6-7時間を敷設するために使用されるプラスチックのバケツから卵を収集します。必要であれば、静かに残りの卵を得るために一度、各カエルを絞る。新鮮tankwater、0.2％ゼラチン溶液でコーティングした500mlのガラス製ビーカーに転送に一度卵を洗ってください。 </li></ol> 2。 X.からの抽出物の調製トロピカの卵抽出物製剤のすべてのステップを約25℃で、室温で行うことができる洗浄を通じて、卵を維持することが重要である彼らは濡れたままになるようにsが液体の下に沈ん。空気に暴露すると、卵は細胞周期停止を逃れるか、溶解する恐れがあります。 <ol><li>卵が濡れ維持するのに十分液体確保しながら、できるだけ多くtankwaterとしてデカント。側に卵を入れたビーカーを傾けて、ビーカーの壁にゆっくり〜300ミリリットル1X MMRを追加、卵のように物理的な攪拌は最小化される。上清を含む破片オフデカントその後、卵が落ち着くしましょう。X.トロピカの卵は、この段階で糸なので、活性化卵の除去はdejellying後に行われます。 3 1X MMRの洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。 </li><li> Dejelly卵。 dejellyソリューションの可能性とアドオンが半分くらいMMRとしてオフデカント。約5分間連続渦巻。ゼリーのコートを溶解すると、数分後に上清中に表示されます。オフデカントし、残りdejellyソリューションを追加します。卵は非常にしっかりと梱包し、それらの植物極を持つすべての向き（極まで連続渦に進み皿の底に向かってと白色顔料）。迅速に、でき​​るだけ多くdejellyソリューションとしてオフデカント。卵がdejelliedされると彼らは機械的な操作に非常に敏感です。 </li><li>慎重に卵にXBを追加します。最初XBウォッシュで、溶解、ふくらんで、白、そしてpseudocleavage卵を除去することにより、CSFの逮捕を免れた卵を除去する。活性化X.トロピカの卵が上部中央に定住する傾向があるので、これらを引き出しにプラスチックピペットを使用しています。また、皮膚やカエル廃棄物の部分を削除します。優しく洗浄の間に卵を渦巻く、それらがビーカーの底に沈降させ、〜300ミリリットル1X XB液で卵を合計3回洗浄する。卵はウェット維持しながら、可能な限り各洗浄溶液のような以前のように、デカント。 </li><li> CSF-XBとデカントで二回卵を洗ってください。 </li><li> CSF-XBを追加+卵。電子メールを公開しないように注意しながら、CSF-XB +と超遠心管への転送卵、ゼラチン処理ファイア​​ーポリッシュパスツールピペットを用いて空気にGGS。水クッションで15ミリリットルのガラス製遠心管の内側に配置。 </li><li> 1分間200 xgで臨床遠心機で卵を回し、30秒間800 XGとスピンにスピードを上げる。 </li><li>卵からできるだけ多くのバッファを削除するには、吸引器を使用してください。彼らは、上に、ほぼ乾燥する必要があります。迅速HB-6ローター（または同等品）を搭載したソーバルRC-6遠心分離機に卵を移動し、20℃で15分間17,000 xgでスピン℃に</li><li> 1ミリリットルの注射器に接続されている18ゲージの針を使って色素と脂質層の間に黄色の細胞質の層を除去する。穿刺チューブの側面および細胞質抽出層を得るために、ゆっくりと注射筒を引く。色素顆粒できるだけ避けてください。 </li><li>新しい遠心チューブに細胞を移す。抽出物はこの段階で少し曇った表示されるのは正常です。水クッションで15ミリリットルのガラス製遠心管の内側に配置。 20℃で10分間再び17,000×gでのスピン内線を繰り返し18ゲージ針でraction。 </li><li> 1.5 mlのマイクロチューブに細胞を移す。抽出量を推定し、抽出液にサイトカラシンDおよびLPC 1:1,000に希釈。気泡を導入することなく、何度も上下にピペッティングし、1ミリリットルピペットチップとよく混ぜる。健全なカエルのコロニーからの典型的な収率は、抽出/カエルの約300-500μLです。最大活性を維持するためには、抽出物を保存し、室温（20-25℃）で実験操作を行う必要がある。 </li></ol> 3。 Xから精製タキソール安定化微小管トロピカエキス<ol><li> 10μMの最終濃度で抽出物100-200μlのアリコートにタキソール追加し、30分間室温でインキュベートする。コントロール反応の場合は、微小管destablilzing薬ノコダゾール（10μM）で抽出と同等のボリュームを扱う。分析のために未処理の抽出の準備を100μl。 </li><li>薬剤処理を希釈10ボリュームBRB-80（80 mMのパイプpHは6.8、1のMgCl 2、1mMのEGTA）+ 30％のグリセリンで抽出。 BRB-80 + 60％グリセロールクッション10mlのを含む14ミリリットル丸底ポリプロピレンチューブを組み立てます。ワイドボアピペットチップ、BRB-80 + 60％グリセロールクッションの上にそっと層薬剤処理抽出反応を用いた。 20℃で17,000×gで10分間遠心°HB-6ローター（または同等）、チューブ·アダプターを装備ソーバルRC-6遠心機でC。 </li><li>上清を含むunsedimented抽出物質を吸引し、脱イオンH 2 Oで二回洗浄するインタフェースを微小管、微小管関連タンパク質、およびタキソール処理サンプルにおける微小管関連RNAを含むゲル状の沈殿を乱さないように注意しながら、徐々に残りのクッションのボリュームを吸引。ノコダゾール処理サンプルは、目に見える物質が含まれていません。 1ミリリットルトリゾールでペレットを再懸濁し、RNAを単離するためのメーカーの指示に進みます。 Untreated抽出物（最大100μl）を、1mlのトリゾールで直接再懸することができます。 </li><li> RNA-seqのに適したトランスクリプトームライブラリを準備するための市販のキットが存在することになります。これらを通じて購入することが<a href="http://www.illumina.com/" target="_blank">http://www.illumina.com/</a>と<a href="http://www.454.com/" target="_blank">http://www.454.com/</a> 。 </li></ol>

<ol>
	<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+localization:+gene+expression+in+the+spatial+dimension.">mRNA localization: gene expression in the spatial dimension.</a> Cell. 136, 719-730 (2009).</li><li>Besse, F., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+localized+mRNAs:+restricting+protein+synthesis+in+space+and+time.">Translational control of localized mRNAs: restricting protein synthesis in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 971-980 (2008).</li><li>Lawrence, J. B., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+localization+of+messenger+RNAs+for+cytoskeletal+proteins.">Intracellular localization of messenger RNAs for cytoskeletal proteins.</a> Cell. 45, 407-415 (1986).</li><li>Mingle, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+all+seven+messenger+RNAs+for+the+actin-polymerization+nucleator+Arp2/3+complex+in+the+protrusions+of+fibroblasts.">Localization of all seven messenger RNAs for the actin-polymerization nucleator Arp2/3 complex in the protrusions of fibroblasts.</a> J. Cell Sci. 118, 2425-2433 (2005).</li><li>Blower, M. D., Feric, E., Weis, K., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+demonstrates+conserved+localization+of+messenger+RNAs+to+mitotic+microtubules.">Genome-wide analysis demonstrates conserved localization of messenger RNAs to mitotic microtubules.</a> J. Cell Biol. 179, 1365-1373 (2007).</li><li>Eliscovich, C., Peset, I., Vernos, I., Mendez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle-localized+CPE-mediated+translation+controls+meiotic+chromosome+segregation.">Spindle-localized CPE-mediated translation controls meiotic chromosome segregation.</a> Nat. Cell Biol. 10, 858-865 (2008).</li><li>Sharp, J. A., Plant, J. J., Ohsumi, T. K., Borowsky, M., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+microtubule-interacting+transcriptome.">Functional analysis of the microtubule-interacting transcriptome.</a> Mol. Biol Cell. 22, 4312-4323 (2011).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Mili, S., Moissoglu, K., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+reveals+APC-associated+RNAs+enriched+in+cell+protrusions.">Genome-wide screen reveals APC-associated RNAs enriched in cell protrusions.</a> Nature. 453, 115-119 (2008).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters.">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Desai, A., Murray, A., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro.">The use of Xenopus egg extracts to study mitotic spindle assembly and function in vitro.</a> Methods Cell Biol. 61, 385-412 (1999).</li><li>Gache, V., Waridel, P., Luche, S., Shevchenko, A., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+mass+spectrometry+identification+of+microtubule-binding+proteins+from+Xenopus+egg+extracts.">Purification and mass spectrometry identification of microtubule-binding proteins from Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol. Med. 137, 29-43 (2007).</li><li>Gache, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+meiotic+microtubule-associated+interactome.">Xenopus meiotic microtubule-associated interactome.</a> PLoS One. 5, e9248 (2010).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li><li>Cross, M., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+nuclear+assembly+using+fractionated+Xenopus+egg+extracts.">In vitro nuclear assembly using fractionated Xenopus egg extracts.</a> J. Vis. Exp. (19), e908 (2008).</li><li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+research:+metamorphosed+by+genetics+and+genomics.">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li><li>Hellsten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328, 633-636 (2010).</li><li>Brown, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle.">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li><li>Godfrey, E. W., Sanders, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+water+hardness+on+oocyte+quality+and+embryo+development+in+the+African+clawed+frog+(Xenopus+laevis).">Effect of water hardness on oocyte quality and embryo development in the African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp. Med. 54, 170-175 (2004).</li><li>Groisman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB,+maskin,+and+cyclin+B1+mRNA+at+the+mitotic+apparatus:+implications+for+local+translational+control+of+cell+division.">CPEB, maskin, and cyclin B1 mRNA at the mitotic apparatus: implications for local translational control of cell division.</a> Cell. 103, 435-447 (2000).</li><li>Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microtubule+polymerization+in+vitro+and+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts.">Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 38, 29-34 (2006).</li><li>Kalab, P., Pu, R. T., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ran+GTPase+regulates+mitotic+spindle+assembly.">The ran GTPase regulates mitotic spindle assembly.</a> Curr. Biol. 9, 481-484 (1999).</li><li>Gaglio, T., Saredi, A., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuMA+is+required+for+the+organization+of+microtubules+into+aster-like+mitotic+arrays.">NuMA is required for the organization of microtubules into aster-like mitotic arrays.</a> J. Cell Biol. 131, 693-708 (1995).</li><li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microtubule+interactome:+complexes+with+roles+in+cell+cycle+and+mitosis.">A microtubule interactome: complexes with roles in cell cycle and mitosis.</a> PLoS Biol. 6, e98 (2008).</li><li>Suprenant, K. A., Tempero, L. B., Hammer, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+ribosomes+with+in+vitro+assembled+microtubules.">Association of ribosomes with in vitro assembled microtubules.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 14, 401-415 (1002).</li><li>Rebagliati, M. R., Weeks, D. L., Harvey, R. P., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+cloning+of+localized+maternal+RNAs+from+Xenopus+eggs.">Identification and cloning of localized maternal RNAs from Xenopus eggs.</a> Cell. 42, 769-777 (1985).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

本稿では、XからCSF-逮捕卵抽出物を生成する簡単な方法を説明してきましたトロピカ 19と微小管結合RNAは7を勉強するために、この抽出液を使用しています。 X.からCSF-逮捕卵抽出物を製造するための基本手順トロピカはXに使用したのと同じですいくつかの重要な違いがツメガエル 。 X.での作業に最も困難な側面の一つトロピカカエルはXに匹敵する微小管の核またはスピンドルアセンブリ活性を有する抽出液を作るのに十分な高品質の卵を得ることであるツメガエル卵抽出。減数分裂IIの細胞周期停止、X.ためのホルモン注射間の間隔から滑りを防止しながら最適な産卵条件を達成するためにトロピカはXのそれが以前より短くなっているツメガエル 、そして産卵の先頭に第三のhCGの注射からタイミングもはるかに短いです。 XとhCGの注射からTへのタイミングをツメガエル彼は産卵の始まりは、それがバッファの中に一晩置いた卵するための便利で効率的であるようなものである。しかし、Xに敷設hCGの注射と卵の間に短い時間のそれは頻繁に手動でカエルから卵を表現することが必要であるトロピカ 。二つの異なるカエルの卵のエキスを作る間にもう一つの重要な違いはdejellyingステップです。 Xとツメガエルの卵は、それがゼリーコートが卵をビーカーに離間されている方法と密接観察することによって溶解したときに決定することは容易であるように大きいです。 dejellying反応が始まるように、卵がより密にパックし始める。しかし、X.トロピカの卵は、はるかに小さく、ゼリーのコートだけでは卵充填密度により解散したときにそれを判断するのは非常に困難になる可能性があります。私たちは、ゼリーのコートが溶解したときに決定するための最も信頼性の高い方法は、動物（黒）と植物（白）極の向きを監視することであること。発見したときに、すべての植物の極ORIビーカーの底に向かってENTゼリーコートは十分な抽出を続行するために除去されています。最後に、一方X.ツメガエル卵抽出物を冷却温度で保存することができる（4-12°C）我々はそれがX.を維持するために重要であることを観察したトロピカの卵は、生化学的活性を維持するために準備し、実験操作中に室温（20〜25℃）で抽出します。そのため、使いやすさの違いにより、我々はXを使用することを好む卵のエキスの生産のためのツメガエルカエル。しかし、必要とする、またはシーケンスのゲノム、Xと生物によって促進される実験用トロピカは、優れた代替システムです。 我々は、この報告書に記載していることの方法は、微小管重合を誘導する微小管安定化剤としてタキソールを使用しています。タキソールは、精製された微小管の大規模な分離を容易に堅牢な微小管安定化剤であるため、我々はこの方法を選んだ。メソッド番目我々が説明で代替可能性微小管重合法を用いて微小管に関連するタンパク質およびRNAを比較することによって改善することができる。選択肢はGTP誘起重合（古典技法）、22またはクロマチンドリブンスピンドルアセンブリ23によって誘導される微小管を模倣するために、微小管重合としてRAN-GTPを使用してを使用して重合を含めることができます。最後に、微小管重合が近い有糸分裂（中心体、クロマチン、および動原体媒介）の間に核される微小管のタイプの模倣だろう誘導する精子核の精製使用。微小管の核生成のこれらの代替エネルギー源への欠点は核剤は、タキソールと同じくらい容易に入手できないことであり、彼らは核しないまたは効率タキソールなどの微小管を安定させる。したがって、これらの方法の各々は、大規模精製のために使用することがより困難になる。微小管の核複数の異なるタイプを比較することの利点それは微小管の核形成の各経路に特異的であるタンパク質および/またはRNAを同定することが可能かもしれないことである。 我々はここで説明していることの方法は、両生類の細胞質抽出物を利用しています。しかしながら、このアプローチは、他の生物からの抽出システムの使用に拡張することができる。有糸分裂抽出物を忠実に微小管アセンブリの多くの局面を要約することを同期化されたヒト組織培養細胞から24に記載されている。我々は正常5 HeLa細胞からの微小管関連RNAを識別するためにこれらの抽出物を使用している。微小管関連したRNAは検討されていないが、同様の微小管精製スキームは、多くの異なる生物25,26について記載されている。ここで説明するアプローチは、微小管の核形成が可能な濃縮された細胞質抽出物を生産する任意の生物を使用することができる。 最後に、我々はデそのアプローチもののここでは、スクライブ微小管関連タンパク質およびRNAの精製について説明し、このアプローチは、他の細胞内構造に一般化することができる。ほとんどのローカライズのmRNAが生化学的方法を用いて同定されていないが、DNAとRNAシーケンシング技術の最近の進歩は、このアプローチをローカライズされたRNAを識別するための魅力的な方法を作る。このアプローチでは、興味のある任意の細胞内またはサブ胚構造は、単離または精製することができた。その後、関連するタンパク質やRNAをゲノム規模で識別することができます。 RNAは、次に、濃縮されたローカライズされたRNAを識別するために、全細胞又は胚のRNA含有量と比較することができる。このアプローチは、全卵（ アフリカツメガエル 27の最初のローカライズされたRNAを同定したアプローチに似て動物や植物の分離）、アクチン関連RNAは、ER-関連したRNAは、ミトコンドリア関連性RNA、またはすることができます任意の細胞内構造を使用することができる無傷関連したRNAを用いて精製する。に基づく微小管関連RNA上の私たちの仕事は、我々は、これは与えられた場所で、その関数の新しいタンパク質を発見するための優れた方法であろうと予測している。さらに、すべてのローカライズされたRNAの位置と範囲の同定は、細胞および胚は、遺伝子発現を制御するためのmRNAの局在化をどのように使用するかについての洞察を提供する。

遺伝子発現の空間的および時間的制御のすべてのセルのために重要であり、1パターニング初期胚の制御のために特に重要です。遺伝子発現の空間的な制御は、細胞や胚内の特定の宛先へのmRNAの積極的なローカライズによって達成される。多くの非常に大細胞型において、（ 例えば、卵母細胞、胚、およびニューロン）のmRNA局在化が符号化されたタンパク質の作用部位へのタンパク質の発現を制限するために使用される。ローカライズされたmRNAがタンパク質生産の多くのラウンドを触媒することができるので、それは個々のタンパク質分子をローカライズするより、mRNAをローカライズするほうが効率的です。彼らはさらにコード化タンパク質2の局在を制限するために役立つ彼らの目的地に到達するまで、ローカライズされたmRNAは通常、翻訳抑制される。胚のパターン形成を制御するRNAの局在化の多くはよく文書の場合に加えて、いくつかの研究では、ローカライズされたmRNAを文書化していますコー​​ドされたタンパク質の作用部位である。著名な例では、減数分裂と紡錘体5-7に多くの分裂レギュレータの運動性線維芽細胞およびmRNAの局在のリーディングエッジまでのβ-アクチン3及びArp2 / 3複合4 mRNAの局在を含む。 ローカライズされたmRNAの古典的な例の多くは、母性効果変異の遺伝的スクリーニングによって同定されたと後でローカライズされたRNAをエンコードするために決定した。しかし、最近のゲノムワイドな研究では、ローカライズされたRNAのスコープに広範な洞察を提供し始めている。 ショウジョウバエ胚におけるin situハイブリダイゼーション画面で最近は、すべてのmRNAの〜70％は多くの小説の宛先8を含む特定の局在を、持っていることを実証した。マウス線維芽細胞から偽足の精製は、ローカライズされたmRNAの9の多様なグループを同定した。減数Xenoのから微小管の生化学的精製を使用して、私たちのグループからの仕事膿卵スピンドル5,7とcopurify mRNAの識別数百を抽出します。私たちの仕事は、mRNAのがコード化された蛋​​白質の作用部位に局在しているという考えを支持し、微小管に局在するmRNAの大半は有糸分裂の制御にその機能タンパク質をコードすることが示された。また、生化学的精製によって細胞内画分中のmRNA濃縮を検出する能力は、ローカライズされたmRNAを同定するためのこのアプローチの力を強調する。 ほとんどのローカライズされたRNAは、彼らの最終目的地10への輸送を達成するために、細胞骨格のアクチンや微小管のどちらかを能動輸送を使用しています。それは細胞骨格のプロセスを繰り返すことができ、インビトロ系を有することが必要である生化学的ア ​​プローチを使用して、特定の宛先にローカライズされたRNAの程度や種類のより良い理解を得るために。細胞骨格の生物学を研究するための最初のシステムの一つは、卵抽出物を生産しているカエルのアフリカツメガエル。X.から未受精卵からツメガエル卵抽出物は、細胞骨格のプロセスの広い配列を研究するために何十年も使用されており、細胞骨格の組み立てとダイナミクス11を制御するメカニズムと分子の我々の理解に大きく貢献してきました。さらに、X.ツメガエル卵抽出物は微小管関連タンパク質12,13の大規模精製に適していると卵抽出物14-16の様々な種類の製造にうまく設計された方法がある。しかし、ゲノム研究のためにXの使用にはいくつかの欠点があるモデル系としてツメガエル 。 何十年ものアフリカツメガエルカエルは発達と細胞生物学の研究のための強力なシステム、大規模な卵母細胞の大きさと堅牢な外部の開発17のおかげであった。さらに、多くの細胞processeてを繰り返すことができる卵抽出システムの開発試験管でsがこのカエルを強力実験モデルを作りました。しかし、 アフリカツメガエルは genome.Inコントラストの異質4倍体の性質によって遅くされた完全なゲノム配列、密接に関連した種は、 アフリカツメガエルトロピカの不足によって妨げられている、2010年18に配列決定した二倍体ゲノムを持っています。しばらくX.トロピカはXのように実験的に扱いやすいではないツメガエル17はシーケンスゲノムの可用性はゲノムワイド解析を実行するために魅力的なモデルシステムになります。 本稿では、Xから減数分裂II-、細胞増殖抑制因子逮捕抽出（CSF）を作成する方法を説明しますトロピカ 19。我々は、この抽出物から微小管と関連するRNAを精製する簡単な方法を説明します。 RNAは、その後、最近開発されたハイスループットシーケンシング技術を用いて配列決定に適しライブラリーに変換することができる。ライブラリは一度それらは全抽出物と比較して微小試料中に濃縮されている特定のmRNAを同定するために蛙のゲノムに整列させることができる配列決定する。これは、ゲノムワイドなスケールで微小管を標的とするmRNAの局在を検出するための強力な方法を提供します。ローカライズされたmRNAを検出することができることに加えて、高スループット配列決定し、配列ゲノムの使用は、公開データベース注釈で現在は存在しない新規な転写物を発見する可能性を提供する。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus tropicalis </td>
			<td>NASCO</td>
			<td>LM00823MX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, free base</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>14030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cichlid Lake Salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>47894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>SC7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbermaid Plastic bucket</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Polyallomer 2 x &frac12; inch Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>326819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45500-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>45550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &frac34; inch glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall HB-6 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of xenopus tropicalis egg extracts to identify microtubule-associated rnas

多くの生物は、空間的及び時間的に制御する遺伝子の発現に特異的な細胞内の目的地へのmRNAをローカライズする。最近の研究では、トランスクリプトームの大部分が細胞及び胚における非ランダム位置に局在することが示されている。ローカライズされたmRNAを同定するための一つのアプローチは、生化学的に関心のある細胞構造を精製して、関係するすべての転写産物を同定することである。最近開発されたハイスループットシーケンシング技術を使用して、それは今では細胞内の構造に関連付けられているすべてのRNAを特定することは簡単です。トランスクリプトの識別を容易にするために、それは完全に配列ゲノムを持つ生物で動作することが必要である。細胞内構造の生 ​​化学的精製の ​​ための一つの魅力的なシステムでは、カエルアフリカツメガエルから生産卵抽出ですが、X.ツメガエルは 、現在転写識別を妨げる完全に配列ゲノムを持っていない。この記事では、方法を説明関連カエル、X.から卵抽出物を生成する完全に配列ゲノムを持っているトロピカ、。私たちは、微小管重合、精製および転写分離のための詳細を提供します。この記事は、微小管関連転写産物の同定のための具体的な方法を説明しているが、我々はそれが簡単に他の細胞内構造に適用され、ローカライズされたRNAの同定のための強力な方法を提供すると信じています。

X.を識別するには微小管に関連付けられているトロピカ転写物は、私たちは、減数分裂IIの中期（CSF）で逮捕された未受精卵から細胞質抽出液を調製。タキソールのこの抽出物の治療は、グリセロールクッション（ 図1A）を介して沈殿により精製することができる安定した微小管を形成することができる。クマシーゲル分析は、タキソール依存的にそのα/β-チューブリン堆積を確認し、これらの調製（ 図1B）に回収さ主要なタンパク質種を表す。他のタンパク質の低いレベルは、微小管（のMAP）でそのタキソール画分中のタンパク質は特に準を示す、タキソールペレットではなく、薬ノコダゾール解重合微小管で処理された製剤中にも存在する。 アジレント·バイオアナライザは、全てXに一般的なRNA組成物を検査するために使用されるトロピカ抽出画分（ 図1C </強い&gt;）。のrRNAとtRNA種の両方が翻訳がXの微小管とスピンドルに発生することを以前の結果と一致し、CSFエキスと微小管含有タキソールペレットに存在しているツメガエル卵抽出5,21。ゲル投影のライントレースはmRNAの信号が著しく低くなって明らかに微小含有を示す、28S rRNAの上の領域への移行の中で最も顕著なタキソールペレットを、そのXの微小管とのmRNAのcosedimentのサブセットトロピカ 。このように単離されたRNAは、市販の試薬を用いてRNA-seqの実験に適している。 <img src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg" /> 図1。 RNA-seqのためのMT-RNAの精製。MT-RNAを単離する（A）精製スキーム。卵は雌のXから収穫されるTROpicalisカエル。細胞質抽出物の調製後、タキソールは、微小管重合を誘導するために添加される。微小管およびMT-RNAは、グリセロールクッションを介して沈殿により精製する。（A）に記載の手法を用いて単離されたタンパク質の（B）クマシーゲル分析。総CSFは、タキソールまたはノコダゾールの存在下で沈殿タンパク質と比較して抽出する。RNAの（C）バイオアナライザゲル分析（）に記載の手法を用いて単離。 CSFから単離されたRNAは、タキソールまたはノコダゾールの存在下で沈降RNAに比べて抽出します。ゲル突起とライントレースの両方が示されている。 ら 、シャープからの許可を得て転載。、（2011）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg">大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

Watch this Scientific Journal Video about Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs at JoVE.com

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

我々は、未受精卵の集合を記述する<em&gt;アフリカツメガエルトロピカ</em&gt;卵と減数分裂II-逮捕卵抽出物生産。この卵抽出物は微小管と微小管結合RNAを精製するために使用することができる。

の生産<em&gt;アフリカツメガエルトロピカ</em微小管関連RNAを識別するために、&gt;卵抽出

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

production-xenopus-tropicalis-egg-extracts-to-identify-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

13.6K ビュー.  Massachusetts General Hospital. 我々は、未受精卵の集合を記述するアフリカツメガエルトロピカ卵と減数分裂II-逮捕卵抽出物生産。この卵抽出物は微小管と微小管結合RNAを精製するために使用することができる。

ビデオ: Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

アフリカツメガエル卵抽出物の調製と分画

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

生物学

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

分別アフリカツメガエルの卵抽出を用いたin vitro核アセンブリで

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

用いたDNA損傷チェックポイントの研究<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

β-カテニンの分解にの再構成<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

ヒト血清から小非コードRNAの分離

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

口腔顔面表現型の定量化で<em&gt;アフリカツメガエル</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、 アフリカツメガエル

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

の生産

要約

さらに動画を探す

この動画の章

アフリカツメガエル卵抽出物の調製と分画

分別アフリカツメガエルの卵抽出を用いたin vitro核アセンブリで

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

用いたDNA損傷チェックポイントの研究

β-カテニンの分解にの再構成

ヒト血清から小非コードRNAの分離

口腔顔面表現型の定量化で

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、アフリカツメガエル

の生産

要約

さらに動画を探す

この動画の章

アフリカツメガエル卵抽出物の調製と分画

分別アフリカツメガエルの卵抽出を用いたin vitro核アセンブリで

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

用いたDNA損傷チェックポイントの研究

β-カテニンの分解にの再構成

ヒト血清から小非コードRNAの分離

口腔顔面表現型の定量化で

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、 アフリカツメガエル

アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、アフリカツメガエル