1. جيل من X. مداري بيض تنظم كل الضفادع مداري القيطم من شركة ناسكو. ويعيش لدينا الضفادع في الموائل المائية أبقى إعادة تدوير نظام توزيع المياه في 27 درجة مئوية. هناك العديد من الخيارات لأنظمة المياه للعناية X. مداري. بعض المعلومات العامة جيدة على هذا أنواع الضفادع ويمكن الاطلاع على المواقع على شبكة الإنترنت من مختبرات هارلاند وغرينجر ( <a href="http://tropicalis.berkeley.edu/home/" target="_blank">http://tropicalis.berkeley.edu/home/</a> ، <a href="http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis/" target="_blank">http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis /</a> ). يتم الاحتفاظ بها الضفادع في tankwater تتكون من (0.4 غرام Ciclid بحيرة أملاح، 0.6 غرام من الملح البحري، 0.625 غرام NaHCO 3 لكل لتر من الماء، ودرجة الحموضة 7.0) 20. هذه النتائج وصفة في موصلية ~ 1800 ميكروثانية، وهي الملوحة العالية للX. مداري. ومع ذلك، فقد وجدنا أن الضفادع لدينا تزدهر في ثيتم تحسين و البيئة وجودة البويضة. وصفات tankwater بديلة يمكن العثور على أعلاه في الموارد المدرجة لX. العام الرعاية مداري. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حقن الضفادع مع الإنسان gonadotropin المشيمي (قوات حرس السواحل الهايتية) في ثلاثة أيام متتالية لتحفيز وضع البيض: أولا، إعداد اثنين من تركيزات حل قوات حرس السواحل الهايتية. Resuspend 10،000 U من مسحوق مجفف بالتجميد قوات حرس السواحل الهايتية في 10 مل العقيمة، منزوع الأيونات H 2 O لتركيز النهائي من 1،000 U / مل. ثم، تمييع 1 مل من 1،000 U / مل حل قوات حرس السواحل الهايتية في 9 مل H 2 O لتركيز النهائي من 100 U / مل. تخزين كل الحلول في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 1، وإعداد 4-6 الضفادع لوضع البيض عن طريق حقن مع قوات حرس السواحل الهايتية بين 2:00 حتي 15:00. حقن كل ضفدع في كيس الليمفاوية الظهرية قرب مجرور مع 0.2 مل 100 U / مل حل قوات حرس السواحل الهايتية. وجود الضفادع سريع خلال حقنتين اللاحقة تقليل كمية النفايات الحالي ضفدع خلال وضع البيض، ولكن هو اختياري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 2، وضخ نفس الضفادعمع 0.2 مل 100 U / مل حل قوات حرس السواحل الهايتية بين 2:00 حتي 03:00. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم 3، وضخ نفس الضفادع مع 0.2 مل 1،000 U / مل حل قوات حرس السواحل الهايتية، بين 7:00 حتي 10:00. إعداد الضفادع لوضع البيض: ملء دلو من البلاستيك 6 الكوارت مع tankwater الطازجة، إضافة الضفادع والمكان في الظلام في 25 ° C. بعد هذه الحقن، وسوف تبدأ وضع البيض بعد 4 ساعات وسوف تكون كاملة بنسبة 7 ساعة. يجب أن الضفادع تضع بيضها في بيئة التي يتم الاحتفاظ بحد أدنى 25 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل استخراج الحلول والمعدات لديهم استعداد على الفور قبل جمع البيض. </li></ol> 20X MMR: 100 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.8، 2 مم EDTA الرقم الهيدروجيني 7.8، 2 M كلوريد الصوديوم، و 40 ملي بوكل، 20 ملي MgCl 2 و 40 مم CaCl 2. الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. تحضير 1 لتر من 1X MMR قبل فقط لاستخراج التحضير. XB 10X: 100 HEPES ملي، pH7.7، و 10 ملي MgCl 2، 1 مم CaCl 2، 1 M بوكل؛ 500 ملي السكروز. الأوتوكلاف وتخزينها في 4 درجات مئوية. تحضير 1 لتر من 1X XB يأوست قبل لاستخراج التحضير. حل Dejelly: تحضير 250 مل 3٪ حل السيستين في منزوع الأيونات H 2 O ودرجة الحموضة إلى 7،8-8،0 مع 10 N هيدروكسيد الصوديوم. إعداد مسبق فقط لاستخراج التحضير. CSF-XB: تأخذ 200 مل من 1X XB وإضافة 2 مل 0.5 M EGTA درجة الحموضة 7.7 و 200 ميكرولتر 1 M MgCl 2. إعداد مسبق فقط لاستخراج التحضير. CSF-XB +: تأخذ 50 مل من CSF-XB وإضافة 50 ميكرولتر من LPC (10 ملغ / مل لكل سهم من Leupeptin، Pepstatin، وChymostatin في DMSO). إضافة 50 ميكرولتر مثبط حركة الخلايا D (10 ملغ / مل في DMSO). إعداد مسبق فقط لاستخراج التحضير. إعداد محلول الجيلاتين 0.2٪ في منزوع الأيونات H 2 O، والموجات الدقيقة إلى حل وتصفية تعقيم. تخزين في درجة حرارة الغرفة. احتياطي 2 بيكمان 2 × ½ بوصة أنابيب نابذة فائقة السرعة. إعداد اثنين من 15 مل أنابيب الطرد المركزي الزجاج جولة القاع مع 0.5 مل من H 2 O في كل لتخفيفمنبذة فائقة أنبوب. جعل النار مصقول الزجاج ماصات باستور. المفاجئة نهاية الخروج من 5 ¾ الماصات الزجاج بوصة لفضح فتحة واسعة، وتعرض للهب لضمان سلاسة جديدة غيض ماصة عرضة للخطر. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 500 مل دورق زجاجي لتخزين البيض بنسبة يحوم حل الجيلاتين 0.2٪ في جميع أنحاء لمعطف جدران الدورق. تجاهل حل الجيلاتين من الدورق بعد الاستعمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض من دلو من البلاستيك المستخدمة لوضع الموارد البشرية 6-7 بعد الحقن الثالثة في اليوم 3. إذا رغبت في ذلك، الضغط بلطف كل ضفدع مرة واحدة للحصول على أي البيض المتبقية. غسل البيض مرة واحدة مع tankwater الطازجة ونقل إلى 500 مل دورق زجاج المغلفة مع محلول الجيلاتين 0.2٪. </li></ol> 2. إعداد مستخلصات من X. بيض مداري جميع خطوات إعداد مستخلص لا يمكن أن يؤديها في درجة حرارة الغرفة، ما يقرب من 25 درجة مئوية. في جميع أنحاء يغسل، فمن المهم للحفاظ على البيضق المغمورة تحت السائل بحيث تظل رطبة. التعرض للهواء يمكن أن يسبب البيض هربا من الاعتقال دورة الخلية أو ليز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب قدر tankwater ممكن مع الاحتفاظ السائل بما فيه الكفاية للحفاظ على البيض الرطب. إمالة دورق يحتوي على البيض إلى الجانب وإضافة ~ 300 مل 1X MMR ببطء على جدار الدورق، يتم تصغير بحيث الانفعالات المادية للبيض. اسمحوا البيض يستقر، ثم صب قبالة الحطام المحتوية طاف. X. البيض مداري هي مفتول العضلات في هذه الخطوة، لذلك يتم إزالة البيض المنشط بعد dejellying. تكرار لما مجموعه ثلاثة يغسل 1X MMR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dejelly البيض. صب قبالة بقدر MMR ممكن، وإضافة نصف من الحل dejelly. دوامة مستمر لمدة حوالي 5 دقائق. سوف حل المعاطف هلام تكون مرئية في طاف بعد بضع دقائق. صب قبالة وإضافة محلول dejelly المتبقية. الاستمرار في دوامة مستمرة حتى البيض حزمة بإحكام جدا وجميع المشرق مع القطب بهم نباتية (القطبمع صبغة بيضاء) نحو الجزء السفلي من الطبق. صب قبالة بسرعة بقدر حل dejelly ممكن. مرة واحدة يتم dejellied البيض فهي حساسة جدا للتلاعب الميكانيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية إضافة XB إلى البيض. في أول غسل XB، وإزالة البيض الذي قد نجا اعتقال CSF عن طريق إزالة هي lysed، منتفخ، والأبيض، وpseudocleavage البيض. تنشيط اكس. البيض مداري تميل إلى تسوية في مركز أعلى، وذلك باستخدام ماصة نقل البلاستيك لسحب هذه المغادرة. أيضا إزالة قطعة من الجلد والنفايات ضفدع. غسل البيض ما مجموعه ثلاث مرات مع ~ 300 مل 1X حل XB، يحوم بلطف البيض بين يغسل والسماح لهم ليستقر على الجزء السفلي من الكأس. كما كان من قبل، صب قدر من كل محلول الغسيل ممكن مع الحفاظ البيض الرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البيض مرتين مع CSF-XB وصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة CSF-XB + إلى البيض. باستخدام المعالجة الجيلاتين النار مصقول ماصة باستير، والبيض إلى أنابيب الطرد المركزي فائقة نقل مع CSF-XB +، مع الحرص على عدم فضح هGGS إلى الهواء. مكان داخل 15 مل أنابيب الطرد المركزي الزجاج مع وسادة الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور البيض في جهاز للطرد المركزي السريرية في 200 x ج لمدة 1 دقيقة، وزيادة السرعة إلى 800 XG وتدور لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الشافطة لإزالة أكبر قدر ممكن من العازلة البيض. وينبغي أن تكون جافة تقريبا على القمة. التحرك بسرعة البيض إلى Sorvall RC-6 أجهزة الطرد المركزي مجهزة الدوار HB-6 (أو ما يعادلها)، وتدور 17،000 XG لمدة 15 دقيقة عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طبقة حشوية الصفراء بين الصباغ وطبقات الدهون باستخدام إبرة قياس 18 تعلق على حقنة 1 مل. ثقب الجانب من الأنبوب وسحب برميل حقنة ببطء للحصول على طبقة استخراج حشوية. تجنب حبيبات الصباغ قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل السيتوبلازم إلى أنبوب تنبيذ فائق جديدة. فمن الطبيعي لاستخراج لتظهر غائم قليلا في هذه الخطوة. مكان داخل 15 مل زجاج أنبوب الطرد المركزي مع وسادة الماء. تدور مرة أخرى 17،000 XG لمدة 10 دقيقة عند 20 درجة مئوية. كرر تحويلةraction مع إبرة قياس 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل السيتوبلازم إلى 1.5 مل microfuge أنبوب. تقدير حجم استخراج وتمييع مثبط حركة الخلايا D وLPC 1:1،000 في استخراج. تخلط جيدا مع 1 مل ماصة، pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات دون إدخال فقاعات الهواء. A العائد نموذجي من مستعمرة الضفدع صحية ما يقرب من 300-500 ميكرولتر من استخراج / ضفدع. للحفاظ على أقصى قدر من النشاط، فمن الضروري لتخزين استخراج وتأدية معالجات تجريبية في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية). </li></ol> 3. تنقية تاكسول استقرت ميكروتثبول من X. مداري استخراج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تاكسول 100-200 قسامة ميكرولتر من استخراج في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لتفاعلات السيطرة، وعلاج ما يعادل حجم استخراج مع المخدرات نوكودازول أنيبيب destablilzing (10 ميكرومتر). الاحتياطي 100 ميكرولتر من استخراج علاج للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع المعالجة المخدرات فياستخراج مع 10 مجلدات BRB-80 (80 ملم أنابيب درجة الحموضة 6.8، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم EGTA) + 30٪ الجلسرين. تجميع 14 مل أنابيب البولي بروبلين جولة القاع تحتوي على 10 مل من BRB-80 + 60٪ سادة الجلسرين. باستخدام مجموعة واسعة تتحمل ماصة، طبقة استخراج رد فعل المعاملة المخدرات بلطف على أعلى من BRB-80 + 60٪ سادة الجلسرين. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في XG 17،000 عند 20 درجة مئوية في Sorvall RC-6 أجهزة الطرد المركزي مجهزة الدوار HB-6 (أو ما يعادلها)، ومحولات أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف تحتوي على مواد unsedimented استخراج، وغسل واجهة مرتين مع منزوع الأيونات H 2 O. نضح حجم وسادة المتبقية ببطء، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه مثل هلام يحتوي على الأنابيب الدقيقة، والبروتينات أنيبيب المرتبطة بها، والرنا أنيبيب المرتبطة في العينة المعالجة تاكسول. لا يحتوي على عينة المعالجة نوكودازول المواد مرئية. Resuspend الكرية في 1 مل TRIzol والمضي قدما مع تعليمات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي. Untrاستخراج عتيد (تصل إلى 100 ميكرولتر) يمكن معلق مباشرة في 1 مل TRIzol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هناك الآن مجموعات المتاحة تجاريا لإعداد مكتبات Transcriptome على مناسبة لRNA وما يليها. ويمكن شراء هذه من خلال <a href="http://www.illumina.com/" target="_blank">http://www.illumina.com/</a> و <a href="http://www.454.com/" target="_blank">http://www.454.com/</a> . </li></ol>

<ol>
	<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+localization:+gene+expression+in+the+spatial+dimension.">mRNA localization: gene expression in the spatial dimension.</a> Cell. 136, 719-730 (2009).</li><li>Besse, F., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+localized+mRNAs:+restricting+protein+synthesis+in+space+and+time.">Translational control of localized mRNAs: restricting protein synthesis in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 971-980 (2008).</li><li>Lawrence, J. B., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+localization+of+messenger+RNAs+for+cytoskeletal+proteins.">Intracellular localization of messenger RNAs for cytoskeletal proteins.</a> Cell. 45, 407-415 (1986).</li><li>Mingle, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+all+seven+messenger+RNAs+for+the+actin-polymerization+nucleator+Arp2/3+complex+in+the+protrusions+of+fibroblasts.">Localization of all seven messenger RNAs for the actin-polymerization nucleator Arp2/3 complex in the protrusions of fibroblasts.</a> J. Cell Sci. 118, 2425-2433 (2005).</li><li>Blower, M. D., Feric, E., Weis, K., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+demonstrates+conserved+localization+of+messenger+RNAs+to+mitotic+microtubules.">Genome-wide analysis demonstrates conserved localization of messenger RNAs to mitotic microtubules.</a> J. Cell Biol. 179, 1365-1373 (2007).</li><li>Eliscovich, C., Peset, I., Vernos, I., Mendez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle-localized+CPE-mediated+translation+controls+meiotic+chromosome+segregation.">Spindle-localized CPE-mediated translation controls meiotic chromosome segregation.</a> Nat. Cell Biol. 10, 858-865 (2008).</li><li>Sharp, J. A., Plant, J. J., Ohsumi, T. K., Borowsky, M., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+microtubule-interacting+transcriptome.">Functional analysis of the microtubule-interacting transcriptome.</a> Mol. Biol Cell. 22, 4312-4323 (2011).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Mili, S., Moissoglu, K., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+reveals+APC-associated+RNAs+enriched+in+cell+protrusions.">Genome-wide screen reveals APC-associated RNAs enriched in cell protrusions.</a> Nature. 453, 115-119 (2008).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters.">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Desai, A., Murray, A., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro.">The use of Xenopus egg extracts to study mitotic spindle assembly and function in vitro.</a> Methods Cell Biol. 61, 385-412 (1999).</li><li>Gache, V., Waridel, P., Luche, S., Shevchenko, A., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+mass+spectrometry+identification+of+microtubule-binding+proteins+from+Xenopus+egg+extracts.">Purification and mass spectrometry identification of microtubule-binding proteins from Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol. Med. 137, 29-43 (2007).</li><li>Gache, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+meiotic+microtubule-associated+interactome.">Xenopus meiotic microtubule-associated interactome.</a> PLoS One. 5, e9248 (2010).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li><li>Cross, M., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+nuclear+assembly+using+fractionated+Xenopus+egg+extracts.">In vitro nuclear assembly using fractionated Xenopus egg extracts.</a> J. Vis. Exp. (19), e908 (2008).</li><li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+research:+metamorphosed+by+genetics+and+genomics.">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li><li>Hellsten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328, 633-636 (2010).</li><li>Brown, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle.">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li><li>Godfrey, E. W., Sanders, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+water+hardness+on+oocyte+quality+and+embryo+development+in+the+African+clawed+frog+(Xenopus+laevis).">Effect of water hardness on oocyte quality and embryo development in the African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp. Med. 54, 170-175 (2004).</li><li>Groisman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB,+maskin,+and+cyclin+B1+mRNA+at+the+mitotic+apparatus:+implications+for+local+translational+control+of+cell+division.">CPEB, maskin, and cyclin B1 mRNA at the mitotic apparatus: implications for local translational control of cell division.</a> Cell. 103, 435-447 (2000).</li><li>Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microtubule+polymerization+in+vitro+and+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts.">Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 38, 29-34 (2006).</li><li>Kalab, P., Pu, R. T., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ran+GTPase+regulates+mitotic+spindle+assembly.">The ran GTPase regulates mitotic spindle assembly.</a> Curr. Biol. 9, 481-484 (1999).</li><li>Gaglio, T., Saredi, A., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuMA+is+required+for+the+organization+of+microtubules+into+aster-like+mitotic+arrays.">NuMA is required for the organization of microtubules into aster-like mitotic arrays.</a> J. Cell Biol. 131, 693-708 (1995).</li><li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microtubule+interactome:+complexes+with+roles+in+cell+cycle+and+mitosis.">A microtubule interactome: complexes with roles in cell cycle and mitosis.</a> PLoS Biol. 6, e98 (2008).</li><li>Suprenant, K. A., Tempero, L. B., Hammer, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+ribosomes+with+in+vitro+assembled+microtubules.">Association of ribosomes with in vitro assembled microtubules.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 14, 401-415 (1002).</li><li>Rebagliati, M. R., Weeks, D. L., Harvey, R. P., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+cloning+of+localized+maternal+RNAs+from+Xenopus+eggs.">Identification and cloning of localized maternal RNAs from Xenopus eggs.</a> Cell. 42, 769-777 (1985).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذا التقرير وصفناها طريقة بسيطة لإنتاج البيض مقتطفات CSF اعتقال من X. مداري 19 واستخدام هذا المقتطف لدراسة الرنا أنيبيب المرتبطة 7. الإجراء الأساسية لإنتاج البيض مقتطفات CSF اعتقال من X. مداري هو نفس المستخدمة لX. المورق مع عدد قليل من الاختلافات الرئيسية. واحد من الجوانب الأكثر تحديا للعمل مع X. الضفادع مداري هو الحصول على البيض جودة عالية بما يكفي لجعل مقتطف مع التنوي أنيبيب أو نشاط الجمعية المغزل مماثلة لX. المورق البيض مقتطفات. لتحقيق ظروف وضع البيض الأمثل في حين منع انزلاق من الانقسام الاختزالي الثاني الخلية اعتقال دورة، والفاصل الزمني بين الحقن الهرمونية للX. مداري أقصر من تلك المستخدمة لX. المورق، وتوقيت الحقن من قوات حرس السواحل الهايتية الثالث إلى بداية وضع البيض هي أيضا أقصر من ذلك بكثير. مع X. المورق توقيت من حقن قوات حرس السواحل الهايتية إلى Tانه بداية وضع البيض هو من النوع الذي هو مريحة وفعالة للحصول على البيض لتكون وضعت بين عشية وضحاها إلى المخزن المؤقت. ومع ذلك، ونظرا للوقت أقصر بين قوات حرس السواحل الهايتية الحقن ووضع البيض مع X. مداري فمن الضروري في كثير من الأحيان للتعبير عن البيض من الضفادع يدويا. آخر فرق كبير بين صنع استخراج البيض من اثنين من الضفادع المختلفة هو الخطوة dejellying. مع X. المورق البيض هي من الضخامة بحيث أنه من السهل تحديد متى قد حلت معطف هلام من خلال مراقبة عن كثب كيف متباعدة البيض في الدورق. كما يبدأ رد الفعل dejellying، البيض تبدأ في حزمة أكثر كثافة. ومع ذلك، X. البيض مداري هي أصغر بكثير، وأنه يمكن أن يكون من الصعب جدا تحديد متى قد حلت معطف هلام من قبل البيض التعبئة الكثافة وحدها. لقد وجدنا أن الأسلوب الأكثر موثوقية لتحديد متى قد حلت معطف هلام هو رصد التوجه للحيوان (أسود) ونباتية (أبيض) القطبين. عندما تكون جميع نباتية أقطاب أوريوالأنف والحنجرة نحو الجزء السفلي من الكأس تمت إزالة هلام معطف بما فيه الكفاية للمضي قدما في استخراج. وأخيرا، في حين اكس. ويمكن تخزين البيض المورق استخراج في درجات حرارة باردة (4-12 درجة مئوية) لاحظنا أن فمن الأهمية بمكان للحفاظ على X. مداري استخراج البيض في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) أثناء إعداد والتلاعب التجريبية للحفاظ على النشاط البيوكيميائية. بسبب الاختلافات في سهولة الاستخدام ونحن نفضل استخدام X. الضفادع المورق لإنتاج استخراج البيض. ومع ذلك، لإجراء التجارب التي تتطلب أو يتم تسهيل من قبل كائن حي مع التسلسل الجينوم، X. مداري هو نظام بديل ممتاز. الطريقة التي وصفناها في هذا التقرير يستخدم التاكسول كعامل أنيبيب استقرار للحث على البلمرة أنيبيب. لقد اخترنا هذا الأسلوب لأن التاكسول هو عامل استقرار قوي أنيبيب التي تسهل العزلة على نطاق واسع من المنقى الأنابيب الدقيقة. طريقة الفي وصفنا يمكن المرجح أن تتحسن من خلال مقارنة البروتينات والرنا المرتبطة الأنابيب الدقيقة باستخدام طرق بديلة البلمرة أنيبيب. ويمكن أن تشمل بدائل البلمرة باستخدام GTP التي يسببها البلمرة (وهي تقنية كلاسيكية)، 22 أو باستخدام ران-GTP باعتبارها polymerizer أنيبيب لتقليد الأنابيب الدقيقة التي تحدثها الجمعية المغزل يحركها لونين 23. وأخيرا، واستخدام تنقيته نوى الحيوانات المنوية للحث على أن البلمرة أنيبيب تكون أقرب تقليد لأنواع من الأنابيب الدقيقة التي يتم الأنوية أثناء الانقسام (الجسيم المركزي، لونين، والحيز الحركي بوساطة). المآخذ على هذه المصادر البديلة من التنوي أنيبيب هي أن وكلاء nucleating إليها ليست متوفرة بسهولة كما التاكسول وأنها لا nucleate أو استقرار الأنابيب الدقيقة بكفاءة كما التاكسول. ولذلك، فإن كل من هذه الأساليب تكون أكثر صعوبة لاستخدامها لتنقية واسعة النطاق. ميزة مقارنة العديد من أنواع مختلفة من nucleators أنيبيبغير أنه قد يكون من الممكن تحديد البروتينات و / أو الرنا التي هي محددة لكل مسار من التنوي أنيبيب. الطريقة التي وصفناها هنا يستفيد من مقتطفات حشوية من البرمائيات. ومع ذلك، يمكن توسيع نطاق هذا النهج لاستخدام نظام مقتطف من الكائنات الحية الأخرى. وقد وصفت مقتطفات الإنقسامية من الخلايا البشرية متزامنة زراعة الأنسجة 24 أن ألخص بأمانة جوانب كثيرة من الجمعية أنيبيب. لقد استخدمت بنجاح هذه المقتطفات لتحديد الرنا أنيبيب المرتبطة من خلايا هيلا 5. وقد وصفت مخططات مماثلة تنقية أنيبيب لكثير من الكائنات الحية المختلفة 25،26، على الرغم من أن لم يتم فحص أنيبيب الرنا المرتبطة بها. النهج الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم مع أي كائن التي يمكن أن تنتج استخراج حشوية مركزة قادرة على nucleating الأنابيب الدقيقة. وأخيرا، على الرغم من أن النهج الذي نحن ديالكاتب هنا يناقش تنقية الأنابيب الدقيقة والبروتينات والرنا المرتبطة بها، يمكن لهذا النهج تعميمها على الهياكل التحت خلوية أخرى. في حين لم يتم تحديد mRNAs ومعظم المترجمة باستخدام أساليب الكيمياء الحيوية التطورات الحديثة في الحمض النووي والتكنولوجيات تسلسل الحمض النووي الريبي جعل هذا النهج وسيلة جذابة لتحديد الرنا المترجمة. في هذا النهج أي بنية التحت خلوية أو الجنين الفرعية من الفائدة يمكن أن تكون معزولة أو تنقيته. ثم يمكن التعرف على البروتينات والرنا المرتبطة بها على نطاق واسع الجينوم. ويمكن بعد ذلك مقارنة الرنا RNA إلى المحتوى من الخلية الكلي أو الجنين لتحديد الرنا المترجمة المخصب. هذا النهج يمكن أن تستخدم مع البيض كله (الحيوانية والنباتية الانفصال، على غرار النهج الذي حدد أول الرنا المترجمة في القيطم 27)، الأكتين الرنا المرتبطة بها، الرنا ER-المرتبطة بها، الرنا الميتوكوندريا المرتبطة، أو إلى أي هيكل التحت خلوية التي يمكن أن يمكن تنقيته مع الرنا المرتبطة سليمة. على أساسعملنا على الحمض النووي الريبي أنيبيب المرتبطة نتوقع أن هذا من شأنه أن يكون وسيلة ممتازة لاكتشاف البروتينات الجديدة التي وظيفة في مكان معين. وعلاوة على ذلك، سوف تحديد موقع ومدى جميع الرنا المترجمة توفير نظرة ثاقبة كيفية استخدام خلايا الأجنة وتوطين مرنا للسيطرة على التعبير الجيني.

السيطرة المكانية والزمانية في التعبير الجيني هو المهم بالنسبة لجميع الخلايا، ويكتسي أهمية خاصة من أجل السيطرة على الجنينية المبكرة كلام بسرعة 1. ويتحقق التحكم المكاني في التعبير الجيني من خلال توطين بالموقع من mRNAs وإلى وجهات معينة داخل الخلايا أو الأجنة. في العديد من أنواع الخلايا كبيرة جدا، (على سبيل المثال البويضات والأجنة، والخلايا العصبية) يستخدم توطين مرنا لتقييد التعبير البروتين إلى موقع العمل من البروتين المشفرة. منذ مرنا المترجمة يمكن أن تحفز عدة جولات من إنتاج بروتين وهو أكثر فعالية في توطين مرنا من لتوطين جزيئات البروتين الفردية. وعادة ما يتم قمعها mRNAs والمترجمة translationally حتى تصل إلى وجهتها، والذي يعمل على زيادة الحد توطين البروتين المشفرة 2. بالإضافة إلى العديد من الحالات الموثقة توثيقا جيدا من توطين RNA للسيطرة الزخرفة الجنينية، وقد وثقت العديد من الدراسات mRNAs وأن تكون مترجمةإلى موقع العمل من البروتين المشفرة. ومن الأمثلة البارزة توطين β-الأكتين 3 و Arp2 / 3 4 mRNAs وإلى حافة الرائدة في مجال الخلايا الليفية متحركة وتوطين mRNAs وبالنسبة للعديد من المنظمين الإنقسامية إلى الانتصافي والإنقسامية مغزل 5-7. وقد تم تحديد العديد من الأمثلة الكلاسيكية من mRNAs والمترجمة من خلال شاشات الوراثية للطفرات تأثير الأمهات وبعد ذلك تم تحديد لترميز الرنا المترجمة. ومع ذلك، فقد بدأت الدراسات الحديثة على نطاق الجينوم لتوفير رؤية أوسع في نطاق الرنا المترجمة. أظهرت دراسة حديثة الشاشة في الموقع التهجين أجنة ذبابة الفاكهة في أن ~ 70٪ من جميع mRNAs ويكون توطين محددة، بما في ذلك العديد من الوجهات رواية 8. حددت تنقية أقدام كاذبة من الخلايا الليفية الماوس مجموعة متنوعة من mRNAs والمترجمة 9. العمل من مجموعتنا باستخدام تنقية البيوكيميائية من الأنابيب الدقيقة من الانتصافي كرهصديد البيض مقتطفات التعرف على مئات mRNAs والتي copurify مع المغزل 5،7. أظهر عملنا أن غالبية mRNAs وأنيبيب المترجمة ترميز البروتينات التي تعمل في السيطرة على الانقسام، ودعم فكرة أن mRNAs وتكون مترجمة إلى موقع العمل من البروتين المشفرة. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على كشف تخصيب مرنا في جزء التحت خلوية من خلال تنقية البيوكيميائية يسلط الضوء على قوة هذا النهج لتحديد mRNAs والمترجمة. الرنا معظم المترجمة استخدام وسائل النقل النشط على الهيكل الخلوي، إما الأكتين أو الأنابيب الدقيقة، لتحقيق النقل إلى وجهتهم النهائية 10. للحصول على فهم أفضل لمدى وأنواع الرنا أن تكون مترجمة إلى وجهات محددة باستخدام نهج البيوكيميائية فمن الضروري أن يكون هناك نظام في المختبر يمكن أن ألخص العمليات هيكل الخلية. أحد أنظمة رئيس الوزراء لدراسة البيولوجيا هيكل الخلية هي مقتطفات البيض المنتجةمن بويضة غير مخصبة من الضفدع القيطم المورق. X. وقد استخدمت المورق مقتطفات البيض لعقود لدراسة مجموعة واسعة من العمليات هيكل الخلية وساهمت كثيرا في فهمنا للآليات والجزيئات التي تتحكم في الجمعية هيكل الخلية وديناميكية 11. وعلاوة على ذلك، X. المورق مقتطفات بيضة قابلة للالتنقيات على نطاق واسع من الأنابيب الدقيقة والبروتينات المرتبطة 12،13 وهناك أساليب مصممة تصميما جيدا لإنتاج أنواع مختلفة من مقتطفات البيض 14-16. ومع ذلك، للدراسات الجينية وهناك العديد من المآخذ على استخدام X. المورق كنظام نموذج. على مدى عقود كانت القيطم المورق الضفادع نظام قوي لدراسة البيولوجيا التطورية والخلية، نظرا لحجم البويضة كبيرة والتنمية خارجي قوي 17. وعلاوة على ذلك، وتطوير أنظمة استخراج البيض التي يمكن أن ألخص العديد من بروكيسي الخلويةجعلت ليالي في أنبوب اختبار هذا الضفدع نموذج تجريبي قوي. ومع ذلك، فقد أعيقت القيطم المورق من عدم وجود تسلسل الجينوم الكامل، الذي تباطأ بسبب طبيعة متغاير الترابيع الصبغية من التباين genome.In، وهي من الأنواع ترتبط ارتباطا وثيقا، القيطم مداري، لديه الجينوم مضاعفا التي كانت متسلسلة في عام 2010 18. بينما X. مداري ليس كما لين العريكة تجريبيا باسم اكس. المورق 17 توافر الجينوم التسلسل يجعل من نظام نموذجا جذابا لإجراء تحاليل واسعة الجينوم. في هذا التقرير ونحن تصف طريقة لجعل الانقسام الاختزالي الثاني، تثبيط الخلايا مقتطفات اعتقال عامل (CSF) من X. مداري 19. نحن ثم تصف طريقة بسيطة لتنقية الأنابيب الدقيقة والرنا يرتبط بها من هذا المقتطف. ويمكن بعد ذلك تحويل الرنا إلى مكتبات قابلة للتسلسل باستخدام تقنيات التسلسل الإنتاجية العالية وضعت مؤخرا. مرة واحدة في المكتباتوالتسلسل أنها يمكن أن تكون محاذاة إلى جينوم الضفدع لتحديد mRNAs والمحددة التي هي المخصب في عينة أنيبيب مقارنة بإجمالي استخراج. هذا يوفر وسيلة قوية للكشف توطين مرنا أنيبيب المستهدفة على نطاق الجينوم واسعة. بالإضافة إلى كونها قادرة على الكشف عن mRNAs والمترجمة، واستخدام التسلسل عالية الإنتاجية وتسلسل الجينوم توفر إمكانية اكتشاف النصوص الرواية التي ليست موجودة حاليا في الشروح قاعدة بيانات عامة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus tropicalis </td>
			<td>NASCO</td>
			<td>LM00823MX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, free base</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>14030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cichlid Lake Salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>47894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>SC7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbermaid Plastic bucket</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Polyallomer 2 x &frac12; inch Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>326819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45500-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>45550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &frac34; inch glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall HB-6 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of xenopus tropicalis egg extracts to identify microtubule-associated rnas

العديد من الكائنات الحية توطين التحت خلوية mRNAs وإلى وجهات محددة لمراقبة المكان والزمان التعبير الجيني. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن الغالبية العظمى من Transcriptome على المترجمة إلى موضع اعشوائي في الخلايا والأجنة. نهج واحد لتحديد mRNAs والمترجمة هو لتنقية كيميائيا بنية الخلوية من الفائدة والتعرف على جميع النصوص المرتبطة بها. باستخدام تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية وضعت مؤخرا هو عليه الآن واضحة لتحديد جميع الرنا المرتبطة بنية التحت خلوية. لتسهيل التعرف نسخة من الضروري العمل مع كائن حي مع تسلسل الجينوم الكامل. واحد نظام جذاب للتنقية الحيوية في الهياكل التحت خلوية مقتطفات البيض المنتجة من الضفدع القيطم المورق. ومع ذلك، X. المورق حاليا لايوجد تسلسل الجينوم بالكامل، الأمر الذي يعيق تحديد النص. في هذه المادة ونحن تصف طريقةلإنتاج البيض مقتطفات من الضفادع ذات الصلة، X. مداري، التي لديها تسلسل الجينوم الكامل. ونحن نقدم تفاصيل عن البلمرة أنيبيب وتنقية والعزلة نص. في حين توضح هذه المقالة طريقة محددة لتحديد النصوص أنيبيب المرتبطة بها، ونحن نعتقد أنه سيتم تطبيقها بسهولة على هياكل التحت خلوية أخرى، وسوف توفر وسيلة قوية لتحديد الرنا المترجمة.

لتحديد X. النصوص مداري المرتبطة الأنابيب الدقيقة، ونحن نستعد لاستخراج عصاري خلوي من بويضة غير مخصبة اعتقل في الطورية من الانقسام الاختزالي الثاني (CSF). العلاج من هذا المقتطف مع التاكسول يسمح تشكيل الأنابيب الدقيقة المستقرة التي يمكن تنقية بالترسيب من خلال وسادة الجلسرين (الشكل 1A). يؤكد تحليل هلام Coomassie أن الرواسب α / β-تويولين في الطريقة التي تعتمد على التاكسول، وتمثل الأنواع الرئيسية بروتين تعافى في هذه الاستعدادات (1B الشكل). انخفاض مستويات البروتينات الأخرى موجودة أيضا في التاكسول بيليه، ولكن ليس في التحضيرات تعامل مع أنيبيب depolymerizing المخدرات نوكودازول، مشيرا إلى أن البروتينات في جزء التاكسول المنتسبين على وجه التحديد مع الأنابيب الدقيقة (خرائط). يتم استخدام اجيلنت Bioanalyzer لدراسة تكوين الحمض النووي الريبي العامة في جميع X. الكسور استخراج مداري (الشكل 1C </STRONG&gt;). كلا الريباسي والأنواع الحمض الريبي النووي النقال موجودة في CSF استخراج والمحتوية على أنيبيب التاكسول بيليه، بما يتفق مع النتائج السابقة أن الترجمة يحدث في الأنابيب الدقيقة ومغزل في X. المورق البيض استخراج 5،21. تتبع خط الإسقاط هلام يكشف إشارة مرنا هو أقل بشكل ملحوظ في أنيبيب التي تحتوي على التاكسول بيليه، وعلى الأخص في منطقة المهاجرة فوق 28S الرنا الريباسي، مشيرا إلى أن مجموعة فرعية من mRNAs وcosediment مع الأنابيب الدقيقة في X. مداري. عزل الحمض النووي الريبي في هذه الطريقة هو مناسبة لتجارب الحمض النووي الريبي وما يليها باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا. <img src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1.jpg" alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg" /> الشكل 1. تنقية MT-RNA لRNA وما يليها. (A) نظام تنقية لعزل MT-RNA. ويتم حصاد البيض من الإناث X. ترومانالضفادع picalis. بعد إعداد استخراج حشوية، يضاف التاكسول للحث على البلمرة أنيبيب. ويجري تنقية الأنابيب الدقيقة وMT-RNA بالترسيب من خلال وسادة الجلسرين. (ب) تحليل Coomassie هلام من البروتينات المعزولة باستخدام نظام الموصوفة في الفقرة (أ). مجموع CSF استخراج مقارنة مع البروتينات الرسوبية في وجود التاكسول أو نوكودازول. (C) Bioanalyzer هلام تحليل الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام نظام الموصوفة في الفقرة (أ). عزل الحمض النووي الريبي من CSF استخراج مقارنة الحمض النووي الريبي الرسوبية في وجود التاكسول أو نوكودازول. وتظهر كل من الإسقاط جل وآثار خط. أعيد طبعها بإذن من شارب، وآخرون، (2011). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs at JoVE.com

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

وصفنا جمع غير مخصبة<em&gt; القيطم مداري</em&gt; البيض وإنتاج الانقسام الاختزالي الثاني اعتقال استخراج البيض. هذا استخراج البيض يمكن استخدامها لتنقية الأنابيب الدقيقة والرنا أنيبيب المرتبطة بها.

إنتاج<em&gt; القيطم مداري</em&gt; البيض مقتطفات من التعرف على الرنا أنيبيب المرتبطة بها

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

production-xenopus-tropicalis-egg-extracts-to-identify-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

13.6K Views.  Massachusetts General Hospital. وصفنا جمع غير مخصبة القيطم مداري البيض وإنتاج الانقسام الاختزالي الثاني اعتقال استخراج البيض. هذا استخراج البيض يمكن استخدامها لتنقية الأنابيب الدقيقة والرنا أنيبيب المرتبطة بها.

Video: Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

إعداد والتقطير من البيض مقتطفات القيطم المورق

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

في المختبر عن طريق الجمعية النووية مجزأ مقتطفات البيض القيطم

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and motif position preference1. Each component algorithm is optimized to find a different kind of motif. By taking the best of these three approaches, SCOPE performs better than any single algorithm, even in the presence of noisy data1. In this article, we utilize a web version of SCOPE2 to examine genes that are involved in telomere maintenance. SCOPE has been incorporated into at least two other motif finding programs3,4 and has been used in other studies5-8. 
The three algorithms that comprise SCOPE are BEAM9, which finds non-degenerate motifs (ACCGGT), PRISM10, which finds degenerate motifs (ASCGWT), and SPACER11, which finds longer bipartite motifs (ACCnnnnnnnnGGT). These three algorithms have been optimized to find their corresponding type of motif. Together, they allow SCOPE to perform extremely well.
Once a gene set has been analyzed and candidate motifs identified, SCOPE can look for other genes that contain the motif which, when added to the original set, will improve the motif score. This can occur through over-representation or motif position preference. Working with partial gene sets that have biologically verified transcription factor binding sites, SCOPE was able to identify most of the rest of the genes also regulated by the given transcription factor.
Output from SCOPE shows candidate motifs, their significance, and other information both as a table and as a graphical motif map. FAQs and video tutorials are available at the SCOPE web site which also includes a "Sample Search" button that allows the user to perform a trial run. 
Scope has a very friendly user interface that enables novice users to access the algorithm's full power without having to become an expert in the bioinformatics of motif finding. As input, SCOPE can take a list of genes, or FASTA sequences. These can be entered in browser text fields, or read from a file. The output from SCOPE contains a list of all identified motifs with their scores, number of occurrences, fraction of genes containing the motif, and the algorithm used to identify the motif. For each motif, result details include a consensus representation of the motif, a sequence logo, a position weight matrix, and a list of instances for every motif occurrence (with exact positions and "strand" indicated). Results are returned in a browser window and also optionally by email. Previous papers describe the SCOPE algorithms in detail1,2,9-11.

A straight-forward and robust method to identify potential regulatory motifs in co-regulated genes is presented. SCOPE does not require any user parameters and returns motifs that represent excellent candidates for regulatory signals. The identification of such regulatory signals helps to understand the underlying biology.

تستخدم لتحديد نطاق الدوافع المحتملة في تنظيم الجينات Coregulated

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

دراسة الحمض النووي حاجز الضرر باستخدام<em&gt; القيطم</emمقتطفات البيض&gt;

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

إعادة تشكيل β-catenin تدهور في<em&gt; القيطم</em&gt; مستخلصات البيض

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

هجين طريقة استخراج الحمض النووي للتقييم النوعي والكمي للمجتمعات البكتيرية من عينات الدواجن الإنتاج

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

القيطم المورق نموذجا لتحديد الترجمة انخفاض قيمة

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...